Kuppeln und Halb - Nantong Histology Consumables Co., Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3165 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es ist bekannt, dass die Infrarotmikroskopie mikrometergroßer Proben unter starken Streuverzerrungen leidet, die auf die Mie-Streuung zurückzuführen sind. Die hochmoderne Vorverarbeitungstechnik zur Modellierung und Entfernung von Mie-Streuungsmerkmalen aus Infrarot-Absorptionsspektren biologischer Proben basiert auf einem Metamodell für perfekte Kugeln. Allerdings sind nicht-sphärische Zellformen eher die Norm als die Ausnahme, und es ist daher äußerst wichtig, die Gültigkeit dieser Vorverarbeitungstechnik für deformierte sphärische Systeme zu bewerten. Für diese Fälle untersuchen wir sowohl numerisch als auch experimentell die Absorptionsspektren von 3D-gedruckten einzelnen Kuppeln, Reihen von bis zu fünf Kuppeln, zwei Kuppeln mit unterschiedlichem Abstand und Halbkapseln unterschiedlicher Länge als Modellsysteme deformierter Einzelzellen und kleiner Zellen Cluster. Wir stellen fest, dass die Kopplungseffekte zwischen einzelnen Kuppeln gering sind, was frühere Ergebnisse der einschlägigen Literatur für Kugeln bestätigt. Darüber hinaus weisen wir darauf hin und veranschaulichen anhand von Beispielen, dass die optische Reziprozität zwar die gleiche Extinktionseffizienz für die Beleuchtung von oben und von unten garantiert, das interne Feld eines Streuers in diesen beiden Situationen jedoch erheblich unterschiedlich sein kann. Abschließend zeigen wir, dass das ME-EMSC-Modell zur Vorverarbeitung von Infrarotspektren aus sphärischen biologischen Systemen auch für deformierte sphärische Systeme gültig ist.

Bis heute stehen mehrere leistungsstarke Techniken zur Durchführung der Schwingungsspektroskopie biologischer und unbelebter Proben im mittleren Infrarot-Spektralbereich zur Verfügung. Dazu gehören beispielsweise die Raman-Spektroskopie1, die Neutronenspektroskopie2, die photoakustische Spektroskopie3,4,5,6 und die Elektronenenergieverlustspektroskopie7. Die mit Abstand am weitesten verbreitete Analysetechnik zur biochemischen Charakterisierung verschiedener Proben ist jedoch die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)8,9,10,11. Daher liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der weiteren Steigerung der Leistungsfähigkeit dieser Technik und der Erweiterung ihrer Anwendbarkeit. Während die Erfassung, Korrektur und Interpretation biologischer FTIR-Dünnschichtspektren auf etablierten Techniken basiert, bleibt im Bereich der FTIR-Spektroskopie einzelner biologischer Zellen und kleiner Zellaggregate noch viel zu tun. Es ist bekannt, dass biologische Zellen, die ungefähr die gleiche Größe wie die Wellenlänge der Infrarotstrahlung haben, hochwirksame Streuer sind. Starke Streusignaturen, die bei der Infrarotspektroskopie menschlicher Zellen beobachtet wurden, wurden von Mohlenhoff et al. der Mie-Typ-Streuung zugeschrieben. im Jahr 200512. Seitdem werden sphärische Modellsysteme häufig verwendet, um Streusignaturen aus biologischen Systemen zu modellieren und zu entfernen13,14,15,16. Die beiden Hauptbeiträge der Mie-Streuung sind Wackelbewegungen und Wellen17. Wackelbewegungen sind weitreichende Schwingungen, die durch einen Interferenzeffekt verursacht werden17. Sie bestimmen das durchschnittliche Verhalten von Infrarot-Extinktionsspektren. Wellen sind scharfe Spitzen, die den Wellen überlagert sind. Sie entstehen durch Formresonanzen, also stehende Wellen im Inneren der Probe18.

Es ist jedoch nicht genau geklärt, ob sphärische Modellsysteme zur Beschreibung biologischer Zellen in infrarotspektroskopischen Messungen geeignet sind. Von den meisten biologischen Zellen wird nicht erwartet, dass sie perfekt kugelförmig sind, und in der Natur sind häufig unterschiedliche Formen zu beobachten. Beispiele hierfür sind Bakterien, Hefen und Algen, die ein breites Spektrum an Formen aufweisen, von Kugelformen über Sphäroide bis hin zu länglichen Kapselformen. Wenn eine Zelle außerdem auf einem Infrarot-Mikroskopobjektträger abgelegt wird, kann sie sich am Objektträger festsetzen, was zu einer Formverformung führt. Im Gegensatz dazu wird von strukturell stabilen Proben, beispielsweise Pollenkörnern, erwartet, dass sie ihre Kugelform behalten, wenn sie auf einem Objektträger abgelegt werden. Dies kann mit der optischen Mikroskopie von Pollenkörnern beobachtet werden. Bei Infrarot-Absorptionsmessungen zeigen Pollenkörner nahezu perfekte Mie-Streusignaturen, sowohl mit Wellen als auch mit Wellen19. Wellen reagieren empfindlich auf die Form des Streuers, und es hat sich gezeigt, dass Formverformungen Wellen in Infrarotspektren unterdrücken oder sogar beseitigen können20. Daher ist neben der direkten Beobachtung mit dem Lichtmikroskop das Vorhandensein von Wellen ein weiterer Hinweis darauf, dass Pollenkörner ihre Kugelform behalten.

Wenn biologische Zellen mittels Infrarotspektroskopie untersucht werden, kommen sie häufig in einer Anordnung vor. Typische Probenkonfigurationen in der Infrarotspektroskopie sind eukaryotische Zellen im Gewebe oder mehrere auf einem Substrat abgelagerte Einzelzellen. Daher ist es wichtig zu wissen, ob bei benachbarten Zellen Kopplungseffekte auftreten, die die Streusignaturen beeinflussen können.

Die Ziele dieser Studie sind (1) die Beschreibung der Streusignaturen in kuppelförmigen (halbkugelförmigen) Systemen und länglichen, kuppelförmigen Systemen (Halbkapseln), (2) zu verstehen, ob Kopplungseffekte zwischen benachbarten Partikeln (z. B. Kuppeln) auftreten ) auftreten, (3) um qualitativ numerisch simulierte Ergebnisse mit Spektren zu vergleichen, die mittels Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) erhalten wurden, wobei sowohl eine Synchrotronquelle (SR-FTIR) als auch eine Globarquelle mit einem Focal-Plane-Array (FPA)-Bildgebungsdetektor verwendet wurden, (4) um den Effekt der Umkehr der Beleuchtungsrichtung der auf eine Probe einfallenden Infrarotstrahlung zu untersuchen und (5) um zu bewerten, ob bestehende Vorverarbeitungstechniken zur Gewinnung reiner Absorptionsspektren aus durch Mie-Streuung verzerrten Spektren zur Korrektur von Infrarotspektren verformter Strahlung geeignet sind Kugelsysteme.

Die kuppel- und länglichen kuppelförmigen Strukturen wurden mithilfe einer 3D-Drucktechnik erhalten, nämlich durch Zwei-Photonen-induziertes direktes Laserschreiben (2PDLW).

Bei der FTIR-Spektroskopie wird das Absorptionsspektrum Z durch Messung von \(I_0\), der auf die Probe einfallenden Intensität, und I, der von der Probe durchgelassenen Intensität, bestimmt:

Im Idealfall wird die einfallende Strahlung lediglich durch molekulare Absorption abgeschwächt, sodass ein reines Absorptionsspektrum entsteht, das direkt als molekularer Fingerabdruck interpretiert werden kann. Streuung trägt jedoch auch zum Strahlungsverlust am Detektor bei. Der Streubeitrag kann das Absorptionsspektrum erheblich verändern und erfordert daher Korrekturmethoden, um ein reines Absorptionsspektrum zu erhalten19.

Um die Gesamtmenge der aus der Vorwärtsrichtung entfernten Strahlung zu berechnen, entweder durch Absorption oder durch Streuung, betrachten wir die dimensionslose Extinktionseffizienz \(Q_{\textrm{ext}}\), definiert als das Verhältnis des Extinktionsquerschnitts und der geometrische Querschnitt der Probe17. Die folgende Gleichung zeigt die Beziehung zwischen der scheinbaren Absorption und der Extinktionseffizienz19,20:

wobei G und g die geometrischen Querschnitte des Detektors bzw. der Probe sind. In (2) wird angenommen, dass \(G\gg g\). Da nach (2) \(Q_{\textrm{ext}}\) eine herausragende Rolle in der Absorption Z spielt, ist \(Q_{\textrm{ext}}\) eine interessierende Größe. Während außer für homogene Filme keine exakten geschlossenen analytischen Ausdrücke zur Berechnung von \(Q_{\textrm{ext}}\) als Funktion der Wellenzahl verfügbar sind, sind geschlossene analytische Näherungen von \(Q_{\textrm{ ext}}\) erhalten werden. Aufgrund dieser Äquivalenz wird das gemessene scheinbare Absorptionsspektrum (Gl. 1) auch Extinktionsspektrum genannt.

Gemäß Ref. 17 werden Näherungsformeln für \(Q_{\textrm{ext}}\), die für die in diesem Artikel diskutierten Simulationen und Experimente relevant sind, unter der Annahme gefunden, dass die einfallende Strahlung, dargestellt als Strahlen, den Streuer direkt durchquert. ohne Ablenkung und erfährt somit nur eine Phasenverschiebung innerhalb des Streuers. Am Detektor verbindet sich die einfallende Strahlung mit der phasenverschobenen Strahlung, was zu Welleninterferenz führt, die \(Q_{\textrm{ext}}\) erzeugt. Basierend auf diesem Interferenzeffekt werden in Anhang A analytische Extinktionsformeln für Halbkugeln, Halbkapseln und Halbzylinder abgeleitet.

Wir weisen darauf hin, dass unter Einbeziehung von Tunnel- und Beugungseffekten erhebliche Verbesserungen der Genauigkeit der im Anhang dargestellten Formeln erzielt werden können (siehe z. B. Ref.21 für den Fall von Kugeln). Diese komplexeren Formeln werden für die Zwecke dieser Arbeit jedoch nicht benötigt.

Beim Zwei-Photonen-induzierten direkten Laserschreiben (2PDLW) wird durch Zwei-Photonen-Absorption eine lokale Polymerisation im sehr kleinen Volumen eines eng fokussierten Laserstrahls erreicht22. Die Verschiebung des Brennflecks entlang einer Flugbahn, die die Polymerisation des Fotolacks induziert, führt zu einer festen 3D-Mikrostruktur. Der Zwei-Photonen-Absorptionsprozess und die anschließende begrenzte Polymerisation können zu einer Fertigungsauflösung von 100 nm oder sogar mehr führen23. Aufgrund dieser Auflösung eignet sich 2PDLW ideal für die Herstellung von Kuppeln und länglichen Kuppeln mit genau definierter Größe, Form und relativer Positionierung für die Infrarotspektroskopie unter kontrollierten Bedingungen.

REM- und Mikroskopbilder von jeweils einer der mittels FTIR-Spektroskopie untersuchten Konfigurationen. (a) Eine einzelne Kuppel mit dem Radius \(R=10\,\upmu \hbox {m}\), (b) sich berührende Kuppeln in einer Reihe, (c) zwei Kuppeln mit zunehmendem Abstand d und (d) halb- Kapseln (längliche Kuppeln) mit einem Radius der Endkappen gleich \(R= 10\,\upmu \hbox {m}\) und einer Dehnung L. Das Material der Proben ist OrmoComp24.

Die 3D-gedruckten kuppelförmigen Strukturen wurden mit einem kommerziellen 2PDLW-Aufbau (Microlight3D) erhalten. Es besteht aus einem inversen Mikroskop (Zeiss Axiovert 200), das mit einem frequenzverdoppelten gütegeschalteten Nd:YAG-Laser (532 nm, 0,56 ns Pulsdauer, 11,7 kHz) ausgestattet ist. Zur Fokussierung des Laserstrahls in der Probe wurde ein 40x-Objektiv (NA 0,95, trocken, Zeiss Plan-APOCHROMAT) verwendet. Die 3D-Objekte werden durch Verschieben der Probe relativ zum Laserbrennfleck mithilfe eines Piezomanipulators mit einem Verfahrbereich von \(100\times 100\times 100 \,\upmu \hbox {m}\) erhalten. Die Laserleistung kann durch einen akusto-optischen Modulator gesteuert werden. Der Piezo-Manipulator ist mit einem Langstrecken-Translationstisch zur automatischen Replikation der Strukturen auf der Oberfläche eines Substrats kombiniert. Ein Autofokussystem wird verwendet, um jedes Objekt mit einer Reproduzierbarkeit von besser als 50 nm an der gleichen Position relativ zur Substratoberfläche zu positionieren. Die Scangeschwindigkeit, die Laserleistung und die 3D-Flugbahn werden computergesteuert.

Die 3D-Strukturen wurden mit dem Ormocomp-Fotolack (Microresist Technology)24 erstellt. Ein ca. 5 \(\upmu \hbox {L}\) Tropfen Fotolack wurde auf der Oberfläche eines 170 \(\upmu \hbox {m}\) Mikroskop-Deckglases abgeschieden. Nach der Mikrofertigung wurde der nicht reagierte Fotolack durch zwei aufeinanderfolgende Waschschritte unter Verwendung von Ormodev (Microresist Technology) als Lösungsmittel entfernt. Nach dem Waschen wurden die Proben an der Luft getrocknet. Beim 3D-Druck wurde kein Vor- oder Nachbackverfahren angewendet.

Die mikrogefertigten Strukturen wurden durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) unter Verwendung eines Zeiss Supra 55VP-Geräts charakterisiert. Vor SEM-Experimenten wurde mit einem Leica EM ACE600 Sputtercoater eine 5 nm dicke Goldbeschichtung auf der Oberfläche der Proben abgeschieden, um Ladungsansammlungen zu entfernen und den Kontrast bei den SEM-Messungen zu verbessern.

Die mit einer CAD-Software erhaltenen 3D-Strukturen wurden mit Simpoly 4.5.1 geschnitten. Der innere Teil der Objekte wurde weniger dicht geschnitten als die Oberfläche, um die Bearbeitungszeit zu verkürzen. Die Schnittrichtung wurde senkrecht zur Strahlausbreitungsachse gewählt und die Voxelpositionen wurden entsprechend der geometrischen Neigung der Struktur bestimmt, um die Oberflächenqualität ähnlich wie von Liao et al.25 vorgeschlagen zu verbessern. Die Schnittparameter, die Belichtungszeit und die Laserleistung wurden variiert und in Rückkopplung mit REM-Experimenten zahlreiche Wiederholungen durchgeführt, um die optimalen Herstellungsbedingungen zu finden. Abbildung 1 zeigt REM-Bilder der untersuchten Proben: (1) Kuppeln (Abb. 1a), (2) lineare Anordnungen sich berührender Kuppeln (Abb. 1b), (3) Kuppeln mit zunehmendem Abstand (Abb. 1c) und (4) Halbkapseln (längliche Kuppeln) (Abb. 1d).

Mithilfe einer CAD-Software wurden kuppelförmige (halbkugelförmige) und längliche, kuppelförmige (Halbkapsel) Strukturen entworfen. Die elektronenmikroskopischen und IR-optischen mikroskopischen Bilder der Strukturen sind in Abb. 1 dargestellt. Der Radius der Kuppeln betrug \(10\,\upmu \hbox {m}\). Die länglichen Kuppeln (Halbkapseln) wurden durch die Kombination von zwei Viertelkugeln im Abstand L und einem dazwischen angeordneten Halbzylinder (\(R=10\,\upmu \hbox {m}\) und zunehmenden Längen L) entworfen (siehe Abb. 1d). Der Radius wurde konstant gehalten, L wurde jedoch in der Studie von 0 bis 1,5R variiert. Neben der Herstellung isolierter Einzelkuppeln wurden sie auch in verschiedenen relativen Positionen zueinander repliziert, um ihre Kopplungen zu untersuchen, wie in Abb. 1b und c dargestellt. Es wurden zwei Arten von Konfigurationen verwendet. Zunächst wurden lineare Kuppelanordnungen hergestellt, die nebeneinander angeordnet waren. Die Anzahl der Kuppeln in einer Anordnung wurde zwischen zwei und fünf variiert. Dann wurden Kuppelpaare mit einem relativen Abstand d hergestellt, der zwischen 0 und 2R variierte. Alle Konfigurationen wurden in 5er-Replikaten hergestellt.

Rasterkraftmikroskopbilder wurden mit einem JPK NanoWizard II AFM (JPK, Cambridge, UK), montiert auf einem Zeiss AxioObserver, im Kontaktmodus aufgenommen. Es wurden Siliziumnitrid-Cantilever (Veeco, Cambridge, UK) verwendet.

FTIR-Spektren einer Lungenkrebszelllinie (CALU-1) wurden mit einem synchrotrongekoppelten Nicolet Continuum IR-Mikroskop (ThermoFisher Scientific, Courtaboeuf, Frankreich) mit einem 32\(\times\) Schwarzschild-Objektiv und einem MCT-Einzelmikroskop aufgezeichnet. Elementdetektor. Die Messungen wurden an der SMIS-Beamline am SOLEIL-Synchrotron in Frankreich durchgeführt. Details zum Experiment finden Sie in Lit.26. In diesem Experiment wurden Zellen aus der nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Zelllinie (NSCLC) SK-MES gewonnen, die von der European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK)20,27 erworben wurde.

FTIR-Spektren von 3D-gedruckten Kuppeln und Halbkapseln wurden an der SMIS-Beamline am SOLEIL-Synchrotron gesammelt. Alle Proben wurden mit demselben FTIR-Mikroskop wie die Lungenkrebszellen, mit derselben Vergrößerung und demselben Detektor gemessen. Die konfokale Apertur wurde für die Kuppeln und die Halbkapseln auf \(10\times 10\,\upmu \hbox {m}\) eingestellt. Die Breite der Öffnung wurde zusammen mit L vergrößert, um die gesamte räumliche Ausdehnung der Halbkapsel abzudecken. Die spektrale Auflösung wurde auf 4 \(\hbox {cm}^{-1}\) eingestellt. Insgesamt wurden 64 Scans für jede Probe und 512 für den Hintergrund gemittelt. Für jede Konfiguration wurden Spektren von vier bis fünf Replikaten gesammelt. Anschließend wurde der Durchschnitt der Spektren für jede der Konfigurationen berechnet.

Die Simulationen wurden mit der Methode der Oberflächenintegralgleichung (SIE)28 durchgeführt. Dabei handelt es sich um eine leistungsstarke numerische Methode, die häufig zur Lösung dreidimensionaler elektromagnetischer Probleme eingesetzt wird. Die SIE-Methode löst die äquivalenten Oberflächenstromdichten auf der Oberfläche der Probe und reduziert dadurch die Anzahl der Unbekannten im Vergleich zu volumenbasierten Methoden (wie FEM, FDTD oder VIEM)29. Es gibt verschiedene SIE-Formulierungen für homogene dielektrische Objekte. In unserem Code verwenden wir die kombinierte Tangentialformulierung (CTF). Der Multilevel Fast Multipole Algorithm (MLFMA)30 wird eingesetzt, um die Effizienz der SIE-Lösung weiter zu verbessern. Die Extinktionseffizienz wird aus dem SIE-Lösungsvektor und dem Anregungsvektor31,32 berechnet. Unser Code wurde durch die analytische Mie-Lösung validiert33 und wurde für die Simulation des homogenen dielektrischen Objekts in unserer vorherigen Arbeit33 verwendet.

Im Allgemeinen zeigt die Untersuchung der Formen biologischer Proben, dass eine biologische Zelle möglicherweise nicht einer perfekten Kugel ähnelt, wenn sie auf einem Substrat abgelagert wird. Ein Beispiel einer AFM-Höhenkarte, die die Topographie einer Lungenkrebszelle zeigt, ist in Abb. 2a dargestellt. Die Abbildung zeigt, dass die Form der Zelle eher einer Kuppel als einer Kugel ähnelt. Die Lungenkrebszelle bleibt an der Oberfläche des Objektträgers hängen und die Form wird dadurch verformt. Dies bestärkt unsere Annahme, dass kuppelförmige Systeme in vielen Fällen strukturell weicher Proben bessere Modellsysteme zur Beschreibung biologischer Zellen sind. Eine 2D-Kontur-Wärmekarte (Abb. 2b) zeigt die gleichen Informationen wie in Abb. 2a, aber die Zellstruktur in 2D wird quantitativ besser dargestellt. Ein von derselben Zelle gesammeltes Infrarotspektrum ist in Abb. 2c dargestellt, wo die Streusignaturen deutlich vorhanden sind15,27. Im Gegensatz dazu ist in derselben Abbildung ein repräsentatives Spektrum für menschliche Zellen (dargestellt durch ein Matrigel-Spektrum15) ohne Streumerkmale in Orange dargestellt. Das reine Absorptionsspektrum (orangefarbene Linie) entspricht in etwa dem, was wir für den Fall erwarten würden, dass die Krebszelle nicht streut.

Eigenschaften einer Lungenkrebszelle. (a) AFM-Höhenkarte mit Darstellung der 3D-Topographie, die einer Kuppel ähnelt. (b) 2D-Kontur-Wärmekarte mit den gleichen Informationen wie (a), aber im 2D-Querschnitt werden die Informationen deutlicher hervorgehoben. (c) Infrarotspektrum der Lungenkrebszelle15,27 (blaue Linie), das Mie-Streuungsbeiträge enthält, verglichen mit einem reinen Matrigel-Absorptionsspektrum (orange Linie), das ungefähr repräsentativ für eine menschliche Zelle ist und keine Mie-Streuungsbeiträge enthält .

Drei verschiedene Systeme wurden untersucht, nämlich Kuppeln in einer Reihe (Abb. 1b), zwei Kuppeln mit zunehmendem Abstand (Abb. 1c) und Halbkapseln mit unterschiedlicher Dehnung L (Abb. 1d). Die Spektren dieser Systeme sind in Abb. 3a dargestellt. Alle Spektren in Abb. 3 sind Mittelwerte von Spektren identischer Systeme.

Wir beginnen mit Kuppeln in einer Reihe. Wie in Abb. 1b dargestellt, reicht die Anzahl der Kuppeln von eins bis fünf, wobei die einzelne Kuppel als Referenzsystem dient (keine Nachbarn) und sich die Kuppeln in den Reihen zwei bis fünf alle berühren, um eine maximale Kopplung zwischen den Kuppeln zu gewährleisten. In jeder Reihe haben wir das Absorptionsspektrum einer der Kuppeln nahe der Mitte der Reihe aufgezeichnet. Die resultierenden Absorptionsspektren sind im oberen Satz in Abb. 3a dargestellt. Wir beobachten, dass trotz der Nähe der Kuppeln und unabhängig von der Anzahl der sich berührenden Kuppeln in einer Reihe der Einfluss benachbarter Kuppeln auf die Spektren vernachlässigbar ist. Die geringfügigen Variationen in den Streusignaturen, die im Bereich von 7500–5000 cm\(^{-1}\) am ausgeprägtesten sind, sind nicht systematisch.

(a) Infrarot-Absorptionsspektren von Kuppel- und länglichen Kuppelproben. Für jede Konfiguration wird der Mittelwert von 4–5 Replikaten angezeigt. In allen Situationen ist das Material der Kuppeln OrmoComp24 und der Radius der Kuppeln beträgt \(10\,\mu\)m. Der obere Satz zeigt Absorptionsspektren für Kuppeln in einer Reihe, von einer einzelnen Kuppel (rote Linie) bis zu fünf Kuppeln in einer Reihe (blaue Linie). Der mittlere Satz zeigt Kuppeln mit zunehmendem Abstand \(d = [0, 5, 10, 20]\, \upmu \hbox {m}\) (jeweils von der roten zur blauen Linie). Der untere Satz zeigt Absorptionsspektren für längliche Kuppeln, wobei die Dehnung L = [0, 2,5, 5, 10, 15] \(\upmu \hbox {m}\) (b) Extinktionseffizienz für eine längliche Kuppel mit einem Brechungsindex von 1,5 ist für zunehmende Dehnung L. Der Radius der Endkappen beträgt R = \(10\,\upmu \hbox {m}\). Die strichpunktierten Linien zeigen \(Q_{\textrm{ext}}\), das durch elektromagnetische SIE-Simulationen für Fälle gefunden wurde, in denen L von 0 auf 3R erhöht wird. Die durchgezogenen Linien zeigen die Näherungen gemäß Gl. (A.16) wobei L von 0 auf 50R erhöht wird. Die rote gestrichelte Linie ist die Näherung von \(Q_{\textrm{ext}}\) für einen unendlich langen Halbzylinder (Gl. A.15). Die grüne Linie zeigt \(Q_{\textrm{ext}}\) für eine Kugel mit dem Radius \(10\,\upmu \hbox {m}\) und einem Brechungsindex von 1,5, berechnet mittels exakter Mie-Theorie. Die grüne Linie ist der oberen (grünen) Wellenzahlachse zugeordnet. (c) Simuliertes \(Q_{\textrm{ext}}\) für ein System bestehend aus Kuppeln in einer Reihe (durchgezogene Linien) und Kuppeln mit zunehmendem Abstand (gestrichelte Linien). Die schwarze Linie ist \(Q_{\textrm{ext}}\) für eine einzelne Kuppel. Die Anzahl der Kuppeln reicht von einer (rote Linie) bis vier (blau). Der Wellenzahlbereich wird für das längste Array reduziert, um die Simulationszeit zu verkürzen. Für die Kuppeln mit zunehmendem Abstand wird der Abstand d zwischen den beiden Kuppeln von 0 auf R vergrößert. Für beide Untersuchungen wird R auf \(10\,\upmu \hbox {m}\) gesetzt und der Brechungsindex beträgt 1,5. Die Linien sind horizontal getrennt, da sie einen hohen Grad an Überlappung aufweisen. Zwischen den Linien sind nur geringe Unterschiede in der Wellenstruktur zu beobachten.

Abbildung 3a zeigt Absorptionsspektren von zwei Kuppeln mit zunehmendem Abstand (mittlerer Satz), wie in Abb. 1c dargestellt. Die Messungen werden an einer der Kuppeln des Paares durchgeführt. Abbildung 3a zeigt, dass die Absorptionsschwankungen auch für dieses System vernachlässigbar sind. Die rote Linie ist die Absorption für sich berührende Kuppeln. Die anderen Linien zeigen die Absorption für zunehmenden Abstand d zwischen den Kuppeln bis zu \(d=2R\) (blaue Linie).

Bei der Untersuchung von Halbkapseln, bei denen L in Abb. 1d schrittweise von 0 auf 1,5 R erhöht wird, sehen wir, dass sich die Wackelstruktur zu niedrigeren Wellenzahlen hin verschiebt (unterer Satz in Abb. 3a). Die in diesen Spektren beobachtete vertikale Verschiebung der Absorption, wie in „Methoden“ beschrieben, wird durch die sich ändernde Größe (die zusammen mit L zunimmt) der numerischen Apertur verursacht.

Die Extinktionseffizienz \(Q_{ext}\) hängt mit der gemessenen Extinktion nach Gleichung zusammen. (2). Wie oben erwähnt, kann für spezielle Systeme mit einem hohen Grad an Symmetrie die genaue Extinktionseffizienz analytisch aus der elektromagnetischen Theorie ermittelt werden, z. B. der Mie-Theorie34 im Fall von Kugeln. In diesem Fall vernachlässigen wir das Vorhandensein des Objektträgers. Dieser Effekt wird in einer Folgearbeit untersucht. Für Kugeln können wir auch die näherungsweise analytische Lösung finden (siehe Anhang A). Für nicht integrierbare Systeme, bei denen keine exakten analytischen Ergebnisse gefunden werden können, kann jedoch nur der Näherungsansatz für die analytische Lösung gewählt werden. Wir können auch numerische Ansätze wie SIE verwenden, um das Streuproblem der nicht integrierbaren Systeme zu lösen.

Da eine Kuppel axiale Symmetrie, aber keine sphärische Symmetrie aufweist, kann die Beleuchtung von oben (der einfallende Strahl breitet sich in negativer z-Richtung aus, d. h. die einfallende Strahlung tritt in die Spitze der Kuppel in Richtung der Unterseite der Kuppel ein) von der Beleuchtung von unten unterschieden werden Beleuchtung (der einfallende Strahl breitet sich in positiver z-Richtung aus, d. h. die einfallende Strahlung tritt durch die Unterseite der Kuppel in Richtung der Spitze der Kuppel ein). Wir haben numerisch überprüft, dass Ober- und Unterbeleuchtung dasselbe \(Q_{\textrm{ext}}\) ergeben, was durch den optischen Reziprozitätssatz35 garantiert wird (siehe Abb. 4c).

Abbildung 3b zeigt die analytische Mie-Lösung in Grün, zusammen mit dem ungefähren \(Q_{\textrm{ext}}\) für längliche Kuppeln gemäß Gl. (A.16) in durchgezogenen Linien und numerische Simulationen für \(Q_{\textrm{ext}}\) für längliche Kuppeln in Strich-Punkt-Linien. Beachten Sie, dass die analytische Mie-Lösung der oberen grünen x-Achse entspricht. Für die Kuppeln variieren die Dehnungen von keiner Dehnung (\(L=0\), blaue Linien) bis \(L=\) [ 2,5, 5, 10, 15, 30 ] \(\upmu \hbox {m}\ ), wobei die längste Dehnung den roten Linien entspricht. Der Radius der Kuppeln ist auf R=\(10\,\upmu \hbox {m}\) und der Brechungsindex auf 1,5 eingestellt, was ungefähr dem Brechungsindex von OrmoComp24-Blau entspricht, wenn die Absorption außer Acht gelassen wird. Indem wir ein nicht absorbierendes Teilchen simulieren, isolieren wir den Effekt der Streuung auf \(Q_{\textrm{ext}}\). Das erste, was uns in Abb. 3b auffällt, ist, dass die Schwankungen in \(Q_{\textrm{ext}}\) für die numerischen Berechnungen (strichpunktierte Linien) und die Näherungsformel (durchgezogene Linien) übereinstimmen.

Zusätzlich zur Näherung von \(Q_{\textrm{ext}}\) für eine längliche Kuppel mit halbzylindrischer Verlängerung \(L=500\,\upmu \hbox {m}\) (dunkelrote durchgezogene Linie), Abb. 3b zeigt \(Q_{\textrm{ext}}\) für einen Halbzylinder (Gl. A.15) als gestrichelte dunkelrote Linie. Es ist offensichtlich, dass sich bei zunehmendem L das resultierende \(Q_{ext}\) dem eines Halbzylinders annähert. Die numerischen Berechnungen von \(Q_{\textrm{ext}}\) zeigen den gleichen Trend wie das angenäherte \(Q_{\textrm{ext}}\), jedoch eine Verlängerung von \(L=500\,\upmu \ hbox {m}\) ist zu groß für numerische Berechnungen.

Die numerischen Simulationen werden für ein einfallendes Feld durchgeführt, das so polarisiert ist, dass das elektrische Feld senkrecht zur verlängerten Achse des Halbzylinders verläuft. Wie aus der Abbildung hervorgeht, führt die Dehnung zu einer Abschwächung der Wellen. Dies liegt daran, dass die Flüstergalerie-Moden in der Richtung senkrecht zum elektrischen Feld, also der Elongationsachse, am stärksten sind. Wenn jedoch \(L>0\), sterben diese Flüstergaleriemodi aus, da die deformierten Formen keine stehenden Wellen entlang der Grenze unterstützen. Dies wird durch die in Referenz 20 berichteten Ergebnisse bestätigt. Zur Polarisation des elektrischen Feldes parallel zur Längsachse siehe Anhang B.

Aus Abb. 3b geht außerdem hervor, dass die Schwankungen im ungefähren Qext und im numerischen Qext auch mit den vollständigen Mie-Lösungen übereinstimmen, wenn man die um den Faktor 2 verringerte Weglänge von Infrarotstrahlen, die eine Kuppel durchqueren, im Vergleich zur Weglänge, die zum Durchqueren erforderlich ist, korrigiert eine Sphäre. Der Zweck dieser Darstellung besteht darin, die Beziehung zwischen Qext für eine vollständige Kugel und eine Kuppel zu demonstrieren. Wir stellen fest, dass im Fall der Dispersion aufgrund der Wellenlängenabhängigkeit des Brechungsindex ebenfalls eine Skalierung erforderlich wäre. Das ME-EMSC-Modell erfordert jedoch keine Vorkenntnisse über die Skalierung und passt die Skalierung der Wackelbewegungen und der Streuung automatisch an. Daher unterstützen die Ergebnisse die Anwendbarkeit der Van-de-Hulst-Näherung zur Korrektur von Spektren, die von kuppelartigen Streuern erhalten wurden.

Obwohl viel schwächer, zeigt Abb. 3b, dass die Wellen in der numerischen Kuppel \(Q_{\textrm{ext}}\) (strichpunktierte blaue Linie) mit den Wellen in der Kugel \(Q_{\textrm{ext) übereinstimmen }}\) (grüne Linie). Dies wird auf der Grundlage der Tatsache verstanden, dass die Diskontinuität des Brechungsindex an der Unterseite der Kuppel, d. h. der abrupte Übergang von \(n=1,5\) auf der Innenseite der Kuppel zu \(n=1\) ) an der Außenseite der Kuppel wirkt wie ein unvollkommener Spiegel, der durch sein Spiegelbild Kuppelresonanzen zu Kugelresonanzen ergänzen kann. Daher ist jede Resonanz in der Kugel mit Auf-/Ab-Symmetrie auch eine Kuppelresonanz. Der verringerte Kontrast zwischen Kuppelwellen und Kugelwellen ist ebenfalls verständlich, da der Spiegel an der Unterseite der Kuppel unvollkommen ist (dh neben der Reflexion auch eine erhebliche Übertragung ermöglicht), können die Kuppelresonanzen leicht aus dem Kuppelvolumen austreten durch die Spiegeloberfläche und führen so zu einer deutlich geringeren Hervorhebung der Wellen in der Kuppel. Aufgrund des Strahlungsaustritts durch die Unterseite der Kuppel kann eine Kuppel auch als undichten dielektrischen Resonator betrachtet werden. Jegliche Undichtigkeiten in einem Resonator verringern die Güte des Resonators, was zu einer Verbreiterung der Resonanzen führt. Dieser Mechanismus erklärt, warum die beobachteten Kuppelwellen nicht nur eine geringere Höhe, sondern auch viel breiter sind als die entsprechenden Kugelwellen.

Wir haben auch numerische Simulationen von \(Q_{ext}\) für sich berührende Kuppeln in einer Reihe durchgeführt (Abb. 1b). Die Ergebnisse dieser Simulationen sind in Abb. 3c als durchgezogene Linien dargestellt. Es ist offensichtlich, dass die Änderung von \(Q_{ext}\) für die verschiedenen Systeme gering ist. Gleiches gilt für zwei Kuppeln mit zunehmendem Abstand (Abb. 1c), deren \(Q_{ext}\) in Abb. 3c als gestrichelte Linien aufgetragen ist. Der Abstand d zwischen den Kuppeln variiert von ungefähr keinem Abstand (\(d=0,04\,\upmu \hbox {m}\)) bis \(d=R=\) \(10\,\upmu \hbox {m). }\). \(Q_{ext}\) ist praktisch nicht betroffen. Diese Ergebnisse bestätigen die Angaben in den Referenzen33,36, die zeigen, dass die gleichen Schlussfolgerungen für kleine Ansammlungen von Kugeln gezogen werden können, sowohl für sich berührende als auch für getrennte. Referenz33 zeigt auch, dass für eine Ansammlung von Kugeln mit unterschiedlichen Radien die Extinktionseffizienz den Mittelwert aller Kugeln einzeln annimmt. Man kann davon ausgehen, dass die gleiche Schlussfolgerung auch für Hemisphären gilt.

In Anhang C werden die Ergebnisse ähnlicher numerischer Untersuchungen für zweidimensionale Systeme berichtet, die aus halbscheibenförmigen Streuern und halbstadiumförmigen Streuern bestehen. Diese Systeme entsprechen dreidimensionalen Systemen, die in der dritten Dimension invariant sind (z. B. unendlich lange Halbzylinder). Die Simulationen zeigen den gleichen Trend wie die dreidimensionalen Ergebnisse, dh der Effekt benachbarter Streuer ist vernachlässigbar, aber der Übergang von einer Halbscheibe zu einem Halbstadium führt zu einer Verschiebung der Schwankungen in der Extinktionseffizienz.

Im vorherigen Abschnitt haben wir darauf hingewiesen, dass der optische Reziprozitätssatz35 nur erfordert, dass \(Q_{\textrm{ext}}\) in Bezug auf die Beleuchtung von unten und oben invariant ist (wie in Abb. 4c gezeigt), aber dazu nichts aussagt Form der internen elektrischen Feldverteilungen des Streuers in diesen beiden Fällen. Tatsächlich führt die Beleuchtung von unten zu einer anderen Intensitätsverteilung des elektrischen Feldes als die Beleuchtung von oben. Simulationen wurden sowohl mit Beleuchtung von oben als auch von unten für eine Kuppel mit \(R=10\,\mu\)m durchgeführt. Ein komplexer Brechungsindex wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Invarianz in \(Q_{\textrm{ext}}\) auch für absorbierende Materialien gilt. Der Brechungsindex wurde auf PMMA37 eingestellt, da der Brechungsindex von OrmoComp unbekannt bleibt. Als Ergebnis unserer detaillierten numerischen Simulationen zeigt Abb. 4a die Intensitätsverteilung des elektrischen Feldes für eine Kuppel mit Beleuchtung von oben, während Abb. 4b die Intensitätsverteilung des elektrischen Feldes für dieselbe Kuppel, jedoch mit Beleuchtung von unten, zeigt. In diesen beiden Fällen erhalten wir völlig unterschiedliche elektrische Feldverteilungen. Während die Beleuchtung von oben eine Intensitätsverteilung in Form von horizontalen Streifen ergibt (Abb. 4a), ergibt die Beleuchtung von unten eine Intensitätsverteilung in Form eines Flüstergalerie-Modus18 (Abb. 4b). Whispering-Gallery-Moden wurden zuvor als Ursprung der Wellen im \(Q_{\textrm{ext}}\) von Kugeln identifiziert (siehe die scharfen Merkmale in \(Q_{\textrm{ext}}\) in Abb . 3b). Wie im vorherigen Abschnitt erläutert und da die Whispering-Gallery-Modi auf/ab symmetrisch sind, sollten wir damit rechnen, dass sie auch in Kuppeln auftreten, da der unvollkommene Bodenspiegel den in Abb. 4b gezeigten Whispering-Gallery-Bogen vervollständigen kann einen vollständigen Flüstergalerie-Modus einer Kugel und erklären Sie die Wellen und ihre Positionen an den gleichen Stellen wie die Kugelwellen im Fall von Kuppeln. Die Überraschung besteht darin, dass bei Kuppeln die Morphologie der entsprechenden Resonanzwellenfunktionen von der Beleuchtungsrichtung abhängt. Die unterschiedliche Verteilung des elektrischen Feldes in kuppelförmigen Streuern (und anderen unregelmäßig geformten Streuern) kann wichtige Konsequenzen für die Infrarotspektroskopie haben, da, wie in Abb. 4 gezeigt, unterschiedliche Innenbereiche des Streuers mit unterschiedlichen Intensitäten bestrahlt werden, abhängig von der Oberseite bzw. Bodenbeleuchtung. Betrachtet man beispielsweise eine Zelle in Form einer verschachtelten Kuppel, würde die Beleuchtung von unten vorzugsweise die Zellwand abtasten, während die Beleuchtung von oben vorzugsweise das Innenvolumen der Zelle mitabtasten würde. Somit konnte ein bescheidener Grad an ortsaufgelöster Zellchemie erhalten werden. Während diese Unterschiede aufgrund des optischen Reziprozitätstheorems in \(Q_{\textrm{ext}}\) nicht sichtbar sind, könnten sie sichtbar sein, wenn zusätzlich zur durchgelassenen Infrarotstrahlung auch die Streustrahlung gemessen wird. Dies geschieht teilweise mit der numerischen Apertur in Infrarotmikroskopen. Wir haben noch keine Experimente zur Beleuchtung von oben und unten durchgeführt, aber unsere detaillierten SIE-Simulationen (unterstützt durch einige unabhängige, vorläufige VIEM-Simulationen) zeigen die unterschiedlichen internen Feldverteilungen (siehe Abb. 4) und die entsprechenden Ergebnisse recht deutlich unterschiedliche Streusignaturen.

Die Schlussfolgerungen, die wir im Fall von Kuppeln gezogen haben, lassen sich explizit im Fall eines Filmstapels mit zwei absorbierenden Schichten untermauern. In diesem Fall können geschlossene analytische Ausdrücke für alle relevanten Größen wie Extinktion, Streuung und Absorptionseffizienz erhalten werden, d. h. \(Q_{\textrm{ext}}\), \(Q_{\textrm{scat} }\) bzw. \(Q_{\textrm{abs}}\). Die Formeln bestätigen die optische Reziprozität35, indem sie analytisch das gleiche \(Q_{\textrm{ext}}\) auch im absorbierenden Fall erhalten. Sie zeigen auch, dass die interne elektrische Feldverteilung in den beiden Filmen für die Beleuchtung von oben und von unten unterschiedlich ist, was im Fall des absorbierenden Filmstapels explizit und analytisch berechnet werden kann.

Wir führten auch zusätzliche numerische Simulationen mit Halbzylindern und Halbkapseln durch und bestätigten, dass, obwohl \(Q_{\textrm{ext}}\) invariant ist, die Beleuchtung von oben gegenüber der Unterseite auch bei diesen Systemen unterschiedliche Intensitäten des internen elektrischen Feldes erzeugt Verteilungen für Ober- und Unterbeleuchtung.

Im Zusammenhang mit der Beleuchtung von oben vs. unten kann man sich über den schrägen Einfall wundern. Wir haben diese Situation nicht weiter untersucht, aber höchstwahrscheinlich werden die gleichen Auswirkungen auftreten. Bei schrägem Einfall kommt es jedoch auf die Polarisation des einfallenden Strahls an und die reziproken Bedingungen müssen sorgfältig definiert werden. Auch wenn \(Q_{\textrm{ext}}\) selbst bei schrägem Einfall immer noch invariant sein dürfte, erwarten wir, dass die interne elektrische Feldverteilung wiederum anders ist. Dies sind schwierige, aber wichtige Fragen, die Gegenstand weiterer Forschung sein werden.

Elektrische Feldverteilung \(|E|^2\) innerhalb und außerhalb einer Kuppel mit \(n=1,5\) und \(R=10\,\mu\)m bei \(2374\,\textrm{cm }^{-1}\). (a) Beleuchtung von oben. Die Intensität des internen elektrischen Feldes hat die Form horizontaler Streifen. (b) Bodenbeleuchtung. Die Intensität des internen elektrischen Feldes manifestiert sich als Flüstergalerie-Modus. Obwohl also \(Q_{\textrm{ext}}\) für beide Beleuchtungsrichtungen gleich ist, sind die entsprechenden Verteilungen des elektrischen Feldes innerhalb der Kuppel bei Beleuchtung von oben und unten sehr unterschiedlich. (c) Extinktionseffizienz für eine absorbierende Kuppel mit Beleuchtung von oben und unten. Der Brechungsindex der Kuppel ist auf PMMA eingestellt, wie in37 dargestellt. Die Extinktionseffizienz ist bei Ober- und Unterbeleuchtung identisch.

Um Streusignaturen aus sphärischen biologischen Proben abzuschätzen und zu entfernen, gilt der ME-EMSC-Algorithmus15 als Stand der Technik. Der Algorithmus basiert auf einem Metamodell, das die Van-de-Hulst-Näherung an \(Q_{ext}\) für eine Kugel verwendet. Es werden mehrere plausible Lösungen für \(Q_{ext}\) berechnet, die dann auf eine Anzahl von Basisvektoren komprimiert werden. Die Basisvektoren werden zur Rekonstruktion des gemessenen Absorptionsspektrums verwendet. Wie in diesem Artikel dargelegt, sind biologische Proben selten perfekt kugelförmig und können beispielsweise Kuppeln oder Halbkapseln ähneln. Daher ist es wichtig zu wissen, ob das \(Q_{ext}\) einer Halbkapsel innerhalb des Unterraums der Basisvektoren existiert, der von den im Metamodell verwendeten Kugellösungen aufgespannt wird. Es ist zwar klar, dass das \(Q_{ext}\) einer Halbkugel in diesem Unterraum existiert, da die Lösungen für die Van-de-Hulst-Näherungen für eine Kugel und eine Halbkugel identisch sind (unter Berücksichtigung des Unterschieds im effektiven optischen Weg). Länge), ist dies bei einer Halbkapsel mit \(L>0\) nicht der Fall.

Um diese Frage zu beantworten, betrachten wir eine absorbierende Halbkapsel, deren Brechungsindex in Abb. 5a dargestellt ist. Der Realteil des Brechungsindex wird in Blau dargestellt, der Imaginärteil in Orange. Der Brechungsindex wird durch die Simulation von Lorentzlinien für den Imaginärteil und die Verwendung der Kramers-Kronig-Beziehungen zur Berechnung des schwankenden Realteils des Brechungsindex ermittelt. Für den Realteil wird ein konstanter Offset von 1,5 verwendet. Dabei wird ein simulierter Brechungsindex verwendet, sodass die Absorptionseigenschaften des Materials variiert werden können. Die Extinktionseffizienz für eine Halbkapsel \(Q_{\textrm{ext}}^ \mathrm{Halbkapsel}\) mit \(R =10\,\upmu \hbox {m}\) und \(L = 10\,\upmu \hbox {m}\) ist in Abb. 5b als gestrichelte rote Linie dargestellt. Gleichung (A.12) wird zur Berechnung der Halbkapsel \(Q_{\textrm{ext}}^ \mathrm{Halbkapsel}\) verwendet.

Anschließend wurden gemäß Gl. 100 Extinktionseffizienzen \(Q_{\textrm{ext}}^{\textrm{sphere}}\) für absorbierende Kugeln berechnet. (A.2). Der komplexe Brechungsindex war derselbe wie bei der Halbkapsel, nur dass der konstante Offset für den Realteil zwischen 1,3 und 1,7 variierte. Die Radien der Kugeln wurden von \(R = 5\,\upmu \hbox {m}\) bis \(R = 10\,\upmu \hbox {m}\) variiert. Darüber hinaus werden die Kurven durch PCA auf eine Anzahl \(n_{\textrm{comp}}\) von Hauptkomponenten, \(p_i\), komprimiert, wie im ME-EMSC-Metamodell15.

Um herauszufinden, ob \(Q_{\textrm{ext}}^ \mathrm{Halbkapsel}\) durch \(p_i\) ausgedrückt werden kann, gilt \(Q_{\textrm{ext}}^ \ mathrm{Halbkapsel}\) wurde auf den von \(p_i\) aufgespannten Raum projiziert. Die rekonstruierten \(Q_{\textrm{ext}}^ {\mathrm{Halbkapsel}, r}\) werden zusammen mit der ursprünglichen \(Q_{\textrm{ext}}^ \mathrm{Halbkapsel} angezeigt. \) in Abb. 5b. Die rekonstruierten \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{Halbkapsel}, r}\) werden mit einer unterschiedlichen Anzahl von Hauptkomponenten \(n_{\textrm{comp}}\) erstellt und sind in verschiedenen Blautönen dargestellt. Das Original \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{Halbkapsel}}\) ist gestrichelt rot dargestellt. Es ist offensichtlich, dass die Rekonstruktion für eine kleine Anzahl von Hauptkomponenten (\(n_{\textrm{comp}} = 5\)) einen relativ großen Fehler aufweist. Wenn die Anzahl der Hauptkomponenten erhöht wird, verbessert sich die Rekonstruktion. Für \(n_{\textrm{comp}} = 12\) ist die Rekonstruktion nahezu perfekt. Für längere L ist im Allgemeinen eine zunehmende Anzahl von Hauptkomponenten erforderlich, um eine zufriedenstellende Rekonstruktion zu erhalten (Ergebnisse nicht gezeigt). Für \(n_{\textrm{comp}} > 9\) ist die Rekonstruktion jedoch auch für lange Elongationen zufriedenstellend.

Im ME-EMSC ist die Anzahl der im Unterraummodell verwendeten Hauptkomponenten eine Variable, die vom Benutzer festgelegt werden muss. Der Standardwert basiert auf der erklärten Varianz und beträgt normalerweise 7. Unsere Ergebnisse zeigen, dass für nicht-sphärische Proben erwartet wird, dass das Modell immer noch \(Q_{\textrm{ext}}\) für deformierte Kugeln beschreibt. Möglicherweise ist jedoch eine Erhöhung der Anzahl der Komponenten im Modell erforderlich. In dieser Analyse zeigen wir, dass das im ME-EMSC verwendete Kugel-Subraum-Modell auch die Lösung für eine längliche Kuppel enthält. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass das ME-EMSC auch für längliche, kuppelförmige Systeme gilt, was ein repräsentativeres Modell einer biologischen Zelle darstellt.

Um zu zeigen, dass \(p_i\) \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{Halbkapsel}}\) nicht rekonstruieren kann, berechnet aus einem beliebigen komplexen Brechungsindex, wurde eine etwas andere Chemie simuliert und als verwendet Eingabe für \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{Halbkapsel}}\). Der Unterschied zum ursprünglichen komplexen Brechungsindex besteht darin, dass einige Peakpositionen entsprechend verschoben wurden: 1500 \(\hbox {cm}^{-1}\) \(\rightarrow\) 1520 \(\hbox {cm}^{- 1}\), 2010 \(\hbox {cm}^{-1}\) \(\rightarrow\) 1950 \(\hbox {cm}^{-1}\), 3000 \(\hbox {cm} ^{-1}\) \(\rightarrow\) 3500 \(\hbox {cm}^{-1}\), 5400 \(\hbox {cm}^{-1}\) \(\rightarrow\) 5350 \(\hbox {cm}^{-1}\). Bei der Rekonstruktion des neuen \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{Halbkapsel}}\) mit dem \(p_i\) von zuvor können die verschobenen Peaks nicht genau wiederhergestellt werden. Abbildung 5c zeigt die rekonstruierte \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{Halbkapsel}, r}\) in Blautönen zusammen mit der neuen \(Q_{\textrm{ext}}^{\ mathrm{Halbkapsel}}\) in gestricheltem Rot. Es ist offensichtlich, dass die rekonstruierten Spektren die verschobenen Peaks nicht beschreiben können.

(a) Der in den Berechnungen von \(Q_{\textrm{ext}}\ verwendete Brechungsindex, wobei der Realteil \(n_r\) in Blau und der Imaginärteil n in Orange dargestellt ist. (b) \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{Halbkapsel}}\) (rote gestrichelte Linie) wird aus einer Anzahl \(n_{comp}\) Basisvektoren rekonstruiert. Die blauen Linien zeigen verschiedene rekonstruierte \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{Halbkapsel,r}}\), mit einer unterschiedlichen Anzahl verwendeter Basisvektoren. (c) Wenn die Chemie (bestimmt durch den Brechungsindex), die zur Berechnung der 100 \(Q_{\textrm{ext}}^{\textrm{sphere}}\)-Kurven verwendet wird, geändert wird, wird die Rekonstruktion \(Q_{\textrm {ext}}^{\mathrm{semi-capsule,r}}\) versagt an den Absorptionsbanden.

Bei der Auswertung des AFM-Bildes einer Lungenkrebszelle (siehe Abb. 2a) stellen wir fest, dass ihre Form eher einer Kuppel als einer Kugel ähnelt. Ähnlich wie bei Lungenkrebszellen wird diese Morphologie im Allgemeinen für viele strukturell instabile biologische Zellen erwartet, wenn sie auf Objektträgern abgelagert werden. Wie in Abb. 2c zu sehen ist, beobachten wir bei solchen kuppelförmigen Systemen immer noch starke Streuungsmerkmale. Dies wird durch unsere numerischen Untersuchungen bestätigt, die starke Mie-Streusignaturen von kuppelförmigen Systemen zeigen. Wenn man die Wellen außer Acht lässt, erwarten wir tatsächlich, dass Kuppeln genau die gleiche Wackelstruktur aufweisen wie perfekte Kugeln, wenn man den Unterschied in der effektiven optischen Weglänge korrigiert (d. h. Faktor-2-Skalierung von \(\rho\)). Mit zunehmendem L beobachten wir, dass längliche Kuppeln eine Wackelstruktur aufweisen, die Kugeln sehr ähnlich ist, mit einer allmählichen Verschiebung hin zu niedrigeren Wellenzahlen.

Darüber hinaus beobachten wir keinen signifikanten Unterschied in den Streusignaturen isolierter Kuppeln im Vergleich zu Kuppelanordnungen. Die Messungen (Abb. 3a) der 3D-gedruckten Proben (Abb. 1) zeigen, dass der Effekt der Kopplung zwischen Streuungen vernachlässigbar ist. Die Wackelstruktur ist praktisch unverändert, während bei der Wellenstruktur geringfügige Unterschiede zu beobachten sind. Wir haben gezeigt, dass diese Schlussfolgerung sowohl für unsere numerischen Simulationen als auch für unsere Messungen gültig ist. Diese Ergebnisse stimmen mit den in Ref. 33 berichteten Ergebnissen zu Kugelarrays überein.

Dieses Papier trägt zu einem besseren Verständnis von Streuproblemen bei und hat wichtige Auswirkungen auf die Modelle, die zur Korrektur der Streuung in diesen Systemen verwendet werden. In der Infrarotspektroskopie ist der ME-EMSC-Algorithmus die modernste Vorverarbeitungsmethode, die zur Entfernung von Mie-Streusignaturen aus Spektren biologischer Zellen und Gewebe verwendet wird, um so die entsprechenden reinen Absorptionsspektren abzurufen15. Der Algorithmus verwendet ein Metamodell, das auf der Van-de-Hulst-Näherung für die Streuung an einer Kugel basiert, um die Streumerkmale in den gemessenen Absorptionsspektren zu modellieren. Basierend auf den in dieser Arbeit berichteten Ergebnissen kommen wir zu dem Schluss, dass ein Modell, das davon ausgeht, dass der Streuer eine perfekte Kugel ist, auch für kuppel- und halbkapselförmige Systeme anwendbar ist. Dies wurde durch theoretische Überlegungen nachgewiesen, die belegen, dass die Theorie hinter dem ME-EMSC-Modell auf Kuppel- und Halbkapselsysteme anwendbar ist. Da außerdem Kopplungseffekte zwischen Systemen aus mehreren Kugeln und Kuppeln vernachlässigbar sind, ist das ME-EMSC-Modell auch auf biologische Zellen in Arrays anwendbar.

Bei der Angabe von Absorptionsspektren wird die Beleuchtungsrichtung (d. h. Beleuchtung von oben vs. von unten) biologischer Proben in der Infrarot-Mikrospektroskopie in der Literatur normalerweise nicht angegeben. Und tatsächlich garantiert der optische Reziprozitätssatz35, dass, soweit es \(Q_{\textrm{ext}}\) betrifft, die Umkehr der Beleuchtungsrichtung zu den gleichen Ergebnissen führt. Die Bestimmung von \(Q_{\textrm{ext}}\) erfordert jedoch, dass im Infrarotdetektor nur vorwärts gestreutes Licht erfasst werden darf. Für einen realitätsnahen Detektor ist dies jedoch nicht zu erreichen, da aufgrund der numerischen Apertur (NA) des Detektors Streustrahlung immer zusammen mit der Strahlung in Vorwärtsrichtung erfasst wird. Dies stellt ein großes Problem dar, da die Streustrahlung von der Beleuchtungsrichtung abhängt. Daher wird bei jedem realistischen Detektor die gemessene Absorption für zwei konjugierte Richtungen (z. B. Ober- und Unterbeleuchtung) der einfallenden Strahlung unterschiedlich sein. Spektroskopiker müssen sich dieses Problems bewusst sein und es muss in Streuungskorrekturalgorithmen angemessen berücksichtigt werden. Dies wird eine wichtige Richtung für die zukünftige Arbeit sein.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor im Zenodo-Repository innerhalb der BioSpec Norway Community verfügbar: https://doi.org/10.5281/zenodo.7228232.

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Diese Arbeit wurde durch das vom norwegischen Forschungsrat finanzierte Stipendium „Kombination von Spektral- und Bildinformationen bei der Analyse hyperspektraler Bilddaten“ unterstützt. AB dankt Philippe Paliard (Microlight3D) für die fruchtbaren Diskussionen über das Schneiden von Mikrostrukturen. Die Messungen der Absorptionsspektren der 3D-gedruckten Proben wurden von SOLEIL (Projekt Nr. 20200795), einer französischen nationalen Synchrotronanlage, unterstützt. Die Berechnungen wurden mit Ressourcen durchgeführt, die von Sigma2 – der nationalen Infrastruktur für Hochleistungsrechnen und Datenspeicherung in Norwegen – mit der Fördernummer NN9294K bereitgestellt wurden.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Johanne Heitmann Solheim und Maren Anna Brandsrud

Fakultät für Naturwissenschaften und Technik, Norwegische Universität für Biowissenschaften, 1430, Aas, Norwegen

Johanne Heitmann Solheim, Maren Anna Brandsrud, Beibei Kong, Stine Lossius & Achim Kohler

Chemielabor der ENS de Lyon, Französisches Nationales Zentrum für wissenschaftliche Forschung (CNRS), 69364, Lyon, Frankreich

Akos Banyasz & Guillaume Micouin

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Ferenc Borondics

School of Pharmacy and Bioengineering, Cancer Centre, University Hospitals of North Midlands, Keele University, Stoke on Trent, ST4 6QG, Großbritannien

Josep Sulé-Suso

Fachbereich Physik, Wesleyan University, Middletown, CT, USA

Reinhold Blümel

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JHS, MAB und AK entwickelten gemeinsam die ursprüngliche Idee. Die Autoren JHS, MAB, RB und AK entwickelten das Konzept des Papiers. RB und AK überwachten die Forschung. BK führte die Simulationen durch und analysierte die Daten mit Unterstützung von RB, JHS und MAB. Der 3D-Druck wurde von AB mit Unterstützung von GM durchgeführt. Die FTIR-Messungen der 3D-gedruckten Proben wurden von FB und AB durchgeführt. Die Messungen des Lungenkrebses Zelle wurde von JSSJHS erstellt, MAB und SL waren die Hauptautoren des Artikels mit Beiträgen der anderen Autoren.

Korrespondenz mit Maren Anna Brandsrud.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Solheim, JH, Brandsrud, MA, Kong, B. et al. Kuppeln und Halbkapseln als Modellsysteme für die Infrarot-Mikrospektroskopie biologischer Zellen. Sci Rep 13, 3165 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30130-z

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Eingegangen: 13. Juni 2022

Angenommen: 16. Februar 2023

Veröffentlicht: 23. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30130-z

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