Effizientes 3D-Licht

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 170 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Möglichkeit, menschliche Gewebeproben in 3D abzubilden, sowohl mit zellulärer Auflösung als auch mit einem großen Sichtfeld (FOV), kann grundlegende und klinische Untersuchungen verbessern. Hier demonstrieren wir die Machbarkeit der Lichtblatt-Bildgebung von formalinfixierten menschlichen Gehirnproben mit einer Größe von ~5 cm3 und bis zu ~7 cm3 großen formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Prostatakrebsproben, die mit dem FFPE-MASH-Protokoll verarbeitet wurden. Wir präsentieren einen Prototyp der Lichtblattmikroskopie, das Dual View Selective Plane Illumination Microscope (ct-dSPIM) für geklärtes Gewebe, das schnelle hochauflösende 3D-Aufnahmen von geklärtem Gewebe im cm3-Maßstab ermöglicht. Wir verwendeten Mosaikscans für schnelle 3D-Übersichten ganzer Gewebeproben oder höher aufgelöste Übersichten großer ROIs mit verschiedenen Geschwindigkeiten: (a) Mosaik 16 (16,4 µm isotrope Auflösung, ~1,7 h/cm3), (b) Mosaik 4 (4,1 µm isotrop). Auflösung, ~ 5 h/cm3) und (c) Mosaik 0,5 (0,5 µm nahezu isotrope Auflösung, ~15,8 h/cm3). Wir konnten kortikale Schichten und Neuronen an der Grenze der menschlichen Gehirnbereiche V1 und V2 sichtbar machen und eine geeignete Bildqualität für die Gleason-Score-Einstufung in dicken Prostatakrebsproben nachweisen. Wir zeigen, dass die ct-dSPIM-Bildgebung eine hervorragende Technik zur quantitativen Beurteilung gesamter, mit MASH präparierter, großflächiger menschlicher Gewebeproben in 3D ist, mit erheblichem zukünftigem klinischem Potenzial.

Trotz der klaren Vorteile großflächiger Mikrostrukturvisualisierungen werden Gewebeproben in der Grundlagenforschung und der klinischen Pathologie noch immer überwiegend mit herkömmlichen Lichtmikroskopen in hauchdünnen Gewebeschnitten (ca. 5–100 µm) untersucht, die auf Glasobjektträgern montiert sind. Dadurch wird die 3D-Organstruktur zerstört und es werden nur begrenzte 2D-Informationen über ein kleines Sichtfeld (Field of View, FoV) bereitgestellt. Daher sind erhebliche Fortschritte in Richtung neuartiger Hochgeschwindigkeits-, Massen-3D-Multiskalen-Mikroskopieansätze mit ausreichender Auflösung erforderlich. Dies ermöglicht die Erkennung entscheidender Details und Übersichtsmerkmale in den gesamten großen Gewebeproben (von mm bis cm Größe).

Die komplexe 3D-Struktur des menschlichen Gehirns ist von Natur aus mehrskalig und besteht aus sehr kleinen Strukturen, die sich über große Entfernungen, sogar ganze Gehirnbereiche, erstrecken1. Die geschichtete kortikale Zytoarchitektur wird beispielsweise durch Zelldichte, Größe und Morphologie auf mikroskopischer Ebene definiert, ihre Schichten erstrecken sich jedoch über gesamte kortikale Bereiche und daher erfolgt die Schichtung über Zentimeterskalen. Um eine quantitative Charakterisierung, wie z. B. Zellzählung, über verschiedene Schichten und sogar ganze Gehirnbereiche hinweg zu ermöglichen, müssen sowohl große FoV-Übersichtsscans als auch hochauflösende zelluläre Bildgebung durchgeführt werden. Diese Art von Daten ist beispielsweise für eine realistische, biologisch informierte neuronale Modellierung unerlässlich2. Daher erfordert die Untersuchung der geschichteten Zytoarchitektur sowohl hochauflösende Bildgebung als auch große FoVs.

Bei Prostatakrebs zeichnen sich Tumore durch Multifokalität und eine heterogene Morphologie mit unterschiedlichen histomorphologischen Mustern in 3D über ausgedehnte Volumina aus3,4. Bis heute erfordert eine definitive Diagnose von Prostatakrebs eine histopathologische Überprüfung von Biopsien auf der Grundlage der Gleason-Score-Einstufung3. Dies ist eine Herausforderung, wie die Variabilität zwischen Beobachtern zeigt, die wiederum zu einer Unter- oder Überbehandlung von Patienten führen kann4. Darüber hinaus werden die Kriterien für eine „aktive Überwachung“ durch die Quantifizierung der Tumorausdehnung und den Gleason-Grad5 bestimmt. Da vollständige Serienschnitte von Prostata-Biopsiekernen selten durchgeführt werden, kann es in Fällen mit mehreren kleinen Herden des Prostata-Adenokarzinoms zu einer Unterbewertung kommen, da diese in unterschiedlichen Konzentrationen in den Paraffinblöcken vorhanden sind5. Darüber hinaus kann es aufgrund der unvollständigen Durchtrennung von Gewebeblöcken zu falsch-negativen Biopsien kommen. Paulk et al. zeigen das Auftreten des Prostatakarzinoms in den tieferen Abschnitten der Paraffinblöcke, das in den anfänglichen H&E-Abschnitten fehlte5. In der derzeitigen Praxis ist das routinemäßige Durchschneiden der gesamten Paraffinblöcke zur Verbesserung der Gewebevisualisierung aufgrund des höheren Arbeitsaufwands und des höheren Preises im Vergleich zum Standardverfahren, bei dem nur 3–4 Ebenen geschnitten werden, möglicherweise nicht möglich.

In den letzten Jahren wurde die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) zusammen mit der optischen Gewebereinigung zur 3D-Visualisierung und Untersuchung von Nagetier- und menschlichem Gewebe im mesoskaligen bis mikroskaligen Auflösungsbereich eingesetzt6,7,8,9,10,11. Verschiedene Labore haben optische Clearing-Protokolle wie CLARITY6,8, iDISCO9,10 und CUBIC12 entwickelt, die hauptsächlich dazu verwendet werden, das Gehirn von Mäusen transparent zu machen, um sowohl die Struktur als auch die Pathologie des Gehirns zu verstehen7. Insbesondere die Anwendung der Lichtblattbildgebung von gereinigtem Gewebe auf große archivierte (d. h. mit Aldehydfixiermitteln fixierte) Gehirnproben erwachsener Menschen stellte aufgrund der Probengröße und der Schwierigkeiten bei der Anwendung von Reinigung, Markierung und Bildgebung eine große Herausforderung dar in großen Mengen myelinreichen Gewebes13.

Frühere Arbeiten haben eine erfolgreiche Reinigung, Markierung und LSFM-Bildgebung sowohl von Biopsien des menschlichen Gehirns7,12,13,14,15,16 als auch von menschlichen Prostatakrebsbiopsien17 gezeigt. Obwohl menschliche Gehirnproben zwischen 1 mm313 und 1 cm312 und 1,5 cm dicke Gewebeplatten14 erfolgreich gereinigt und markiert wurden, wurde die tatsächliche LSFM-abgebildete Probengröße auf 1 mm3 15 oder 500 µm dicke Gewebeplatten13 mit einem gemeldeten maximalen Volumen von ~ beschränkt 10,5 mm × 14,1 mm × 3 mm16. Zhao et al. Die bisher größte optisch gereinigte und markierte menschliche Gehirnprobe (7,5 × 5 × 0,4 cm) wurde mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Allerdings würde ein Lichtblattmikroskopie-Aufbau die Geschwindigkeit und Skalierbarkeit der Bildaufnahme erheblich steigern. Aktuelle Prostatastudien, wie sie von Glaser et al.17 beschrieben und durchgeführt wurden. konzentriert sich hauptsächlich auf 1–2,5 mm Kernnadelbiopsien. Eine Übersicht über die bekanntesten LSFM-Aufbauten, die auf menschliche Gehirn- und Prostatakrebsproben (und andere Probentypen) angewendet werden, ist in Tabelle 1 aufgeführt, einschließlich Probenvolumen und Auflösung. Sowohl das Liu-Labor17 als auch das Shroff-Labor18 haben an ihrem oben offenen LSFM bzw. der dualen invertierten Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM) Mehrfachimmersionsobjektive für die Bildgebung von freiem Gewebe angebracht, um die Bildgebung von freiem Gewebe z. B. zu ermöglichen. menschliche Prostata- und Mäusegehirnproben. Obwohl dies zeigt, dass sich die LSFM-Technologie und die Clearing-Protokolle schnell weiterentwickeln, war eine schnelle 3D-Bildgebung von gereinigtem Gewebe von großen menschlichen Prostata- und Gehirnproben mit einer lateralen Größe von vielen Zentimetern und einem Volumen von vielen cm3 bisher unerreichbar.

In dieser Arbeit zeigen wir, dass wir mehrere Kubikzentimeter menschlicher Gehirn- und Prostatakrebs-Gewebeproben (axiale Ganzschnittschnitte) optisch klären, kennzeichnen und abbilden. Zuvor haben wir MASH (Multiscale Architectonic Staining of Human cortex) vorgestellt, einen skalierbaren Reinigungs- und Markierungsansatz, der sich für bis zu 5 mm dicke Platten archivierten erwachsenen menschlichen Gehirngewebes als wirksam erwiesen hat. Hier verarbeiteten wir menschliche Gehirnproben mit MASH-Clearing und -Kennzeichnung. Darüber hinaus führen wir FFPE-MASH ein und verarbeiten erstmals erfolgreich menschliche FFPE-Prostataproben. Anschließend stellen wir das Dual View Selective Plane Illumination Microscope (ct-dSPIM) für geklärtes Gewebe vor, um eine effiziente LSFM-3D-Bildgebung für großes geklärtes Gewebe durchzuführen, die bestehende geklärte LSFM-Studien zu menschlichen Gehirn- und Prostataproben im abgebildeten Volumen bei weitem übertrifft.

Unser neuer Ansatz ermöglicht die 3D-Bildgebung, Visualisierung und Quantifizierung großer Volumina mit hoher Geschwindigkeit und einem einstellbaren Kompromiss zwischen Geschwindigkeit und Auflösung. Um die Machbarkeit dieser Methode zu zeigen, beschreiben wir die LSFM-Bildgebung des menschlichen Gehirns und der Prostata. Wir verwenden das ct-dSPIM, um das menschliche Gehirn (Occipitallappen) bis zu einer Größe von ~50 × 35 × 3 mm (>5 cm3) und Resektionsproben von menschlichem Prostatakrebs (der axiale Ganzkörperabschnitt nach der Prostatektomie) bis zu einer Größe von ~40 × abzubilden 35 × 5 mm (~7 cm3). Die ct-dSPIM-Bildgebung ermöglicht die Erweiterung aktueller Methoden und Studien und ermöglicht die Untersuchung mehrerer mm dicker axialer Prostataabschnitte. Die Anwendung der ct-dSPIM-Bildgebung auf größere Prostatakrebsproben ermöglicht neuartige 3D-Einblicke in die Morphologie von gutartigem und neoplastischem Gewebe. Dieses zusätzliche 3D-Wissen über Tumore kann die Gewebevisualisierung im gesamten Block verbessern, zu einem besseren Verständnis der Architektur des Prostata-Adenokarzinoms führen und möglicherweise die Diagnose von Prostatakrebs verbessern.

Wir haben eine multiskalige 3D-Bildgebung an MASH-präpariertem menschlichem Gehirn (Abb. 1–5) und den axialen Prostataabschnitten (Abb. 6, 7; ergänzende Abb. 1, 2) mit einem großen FoV mit Mosaik 4 und Mosaik 16 durchgeführt Akquisitionen und ein moderates FoV und eine hohe Auflösung für eine bestimmte Interessenregion. Mosaik 16 menschlicher Gehirnproben (Abb. 1, 2, 4) ermöglichte relativ schnelle (ca. 8–16 h, ~1,7 cm3/h, 16,4 µm isotrop, Tabelle 2) Übersichtsscans eines gesamten Gewebeblocks Bis zu 5 cm × 3 cm in der Seitengröße und 3 mm dick. Kleinere ROIs der menschlichen Gehirnproben wurden mit einem Mosaik 4 abgebildet (Abb. 3, 4). und Mosaik 0,5. (Abb. 5). Diese Ergebnisse stellen wir der Reihe nach vor und diskutieren sie.

a Probe entnommen ca. 6 mm vor dem Hinterhauptpol (dritter 3 mm dicker Abschnitt in Richtung von hinten nach vorne). Von links nach rechts: Formalinfixierte, ungefärbte Probe und MASH-NR-gefärbte Probe von der hinteren und vorderen Seite; Geklärte Probe, aufgenommen von der Rückseite (die Form zeigt Merkmale der transparenten Probe sowohl auf der Vorder- als auch auf der Rückseite; Raster: kleinste Quadrate 1 × 1 mm, fette Quadrate 10 × 10 mm). 3D-Rekonstruktion der gesamten Schicht mit 16,4 µm isotroper Auflösung mit einer Mosaik-16-Aufnahme (Maßstabsbalken: 1 cm): Die dicht gefärbten zellreichen Schichten sind auch bei geringer Vergrößerung/großem FOV-Überblick erkennbar (weiße Pfeilspitzen). Die V1/V2-Grenze wird durch die schwarzen Pfeile in der Übersicht und den vergrößerten ROI angezeigt. b Aufeinanderfolgende vordere Schicht desselben Hinterhauptslappens, ca. 9 mm vor dem Hinterhauptpol, Platten wie für (a) beschrieben.

3D-Rendering und orthogonale Ebenen isotroper 16,4-µm-Daten. Orthogonale Ansichten von 50 µm MIP (XY: grün, XZ: rot, YZ: blau) der gesamten 3 mm dicken Probe. Maßstabsbalken: 5 mm für XZ, YZ bzw. Volumendarstellung und 2,5 mm für die XY-Ebene.

3D-Rendering eines Mosaiks 4 Aufnahmen eines ROI in der Nähe des menschlichen primären visuellen Kortex (links oben). Orthogonale Ansichten von 50 µm MIPs (XY: blau, XZ: grün, YZ: rot) zeigen kortikale Schichten unabhängig von der Ausrichtung (weiße Pfeile). Gezackte Kanten in der XZ-Ansicht entstehen durch die Schrägstellung, wenn sich die Kante der Aufnahme innerhalb des Gewebes befindet. Vergrößerte ROIs des MIP (XY: Gelb, XZ: Magenta, YZ: Cyan) zeigen qualitativ die isotrop abgetastete Auflösung sowie die Bild- und Beschriftungsqualität tief im Inneren der Probe. Maßstabsbalken: Volumendarstellung, XY- und YZ-Ebene 3 mm; XZ: 1,5 mm; vergrößerte ROIs jeweils 0,5 mm.

Vom gesamten Okzipitallappenschnitt erfasste Daten (dritter 3 mm dicker Abschnitt vom Okzipitalpol in Richtung anterior), dargestellt mit einer Auflösung von 16,4 µm (16,4 µm Volumen; linke Seite). Zwei Gyri wurden mit einer Auflösung von 4,1 µm (blau) und im 0,5 µm großen Volumen (rot) mit einer anisotropen Auflösung und einer Pixelgröße von 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm abgebildet. Die vergrößerten Einfügungen zeigen die effektive Auflösung, die mit dem 4,1-µm-Volumen (Magenta) bzw. 0,5-µm-Volumen (Orange) erreichbar ist. Während das 4,1 µm große Volumen mesoskopische Strukturen aufweist, die auf Minisäulen hinweisen (hervorgehoben in Magenta), kann es bei dieser Auflösung im extrem dicht besiedelten koniozellulären visuellen Kortex schwierig sein, kleinere Einzelzellen von Zellclustern zu unterscheiden. Das Volumen von 0,5 µm ermöglicht die Identifizierung einzelner Zellen, einschließlich der proximalen Teile der apikalen und basalen Dendriten (weiße Pfeile). Maßstabsbalken: 5 mm (16,4 µm Volumen), 3 mm (4,1 µm Volumen) und 0,25 mm (4,1 µm Volumen, vergrößertes Panel), 1 mm (0,5 µm Volumen) und 0,075 mm (0,5 µm Volumen, vergrößertes Panel).

a Volumendarstellung des für die Zellzählung verwendeten Datensatzes. b Ergebnisse der manuellen Layer-Segmentierung für das gesamte Volumen. Die Farben sind wie folgt: Schicht I Cyan, Schicht II leuchtendes Rot, Schicht IIIa Orange, Schicht IIIb Grün, Schicht IV Magenta, Schicht V Blau, Schicht VI Dunkelrot und weiße Substanz in Gelb. Das Gewebe im unsegmentierten Teil des Volumens war beschädigt und ermöglichte keine Segmentierung der Schichten und wurde von der Analyse ausgeschlossen. Einzelne Ebene (XY-Ebene des neu geschnittenen Bildvolumens) der gefilterten Daten (c) und automatisch segmentierten Objekte (d). Segmentierte Zellen werden in zufälligen Farben angezeigt. e Schätzungen der Zelldichte, abgeleitet aus der Gesamtzahl aller segmentierten Zellen pro Schichtsegment über das gesamte Bildvolumen (für mehrere, nicht verbundene Segmente derselben Schichten wurden die Zählungen zusammengefasst). Farben wie unter (b) angegeben. Die Maßstabsbalken für alle Bilder ganz links betragen 500 µm und für die beiden vergrößerten Panels 75 µm.

Auf der linken Seite werden die Proben in verschiedenen Phasen der Verarbeitungspipeline angezeigt: nach der Entparaffinierung und Bleichung (a, e), nach dem Färben (b, f) und nach dem RI-Matching (d. h. geklärt, c, g). Auf der rechten Seite ein MIPs aus dem Datensatz „Mosaic 16“ über ca. 50 µm werden in invertierten Graustufen (d, h) dargestellt. Die roten Kreise zeigen die Krebsregionen an (wie von einem Pathologen identifiziert). Abkürzungen: AFS anteriores fibromuskuläres Stroma, CZ-Zentralzone, U (Prostata-)Harnröhre, PZ-Peripheriezone, TZ-Übergangszone. Maßstabsbalken: 3 mm.

Die Probe aus Abb. 8e–h ist hier in 2D (a) dargestellt, eine Schicht über die gesamte Oberfläche in yz, dargestellt im roten Feld, einschließlich 2 orthogonaler Schnitte über die gesamte Probendicke, dargestellt durch grün (xz) und blau (xy). ) Kästchen. Gestrichelte Kästchen zeigen den Tumor an (wie vom Pathologen identifiziert). Die Tumorregion dieser Probe (rot gestricheltes Kästchen in a) wird auch in b als 3D-Volumendarstellung angezeigt. Maßstabsleiste: a, 3 mm; b, eins Quadrat des roten Gitters 1 mm.

Dicke Schnitte aus dem Hinterhauptslappen des menschlichen Gehirns (Abb. 1) wurden ca. 6 mm vor dem Hinterhauptspol (dritter 3 mm dicker Abschnitt in der Richtung von hinten nach vorne; siehe Abb. 1a und Zusatzvideo 1) und die darauffolgende vordere Schicht (~ 9 mm vor dem Pol) desselben Hinterhauptslappens (Abb. 1b). und Zusatzvideo 2). Die dunklen Verfärbungen in den unverarbeiteten Schnitten (ganz links) sind wahrscheinlich auf die postmortale Ansammlung von Blut in Gefäßen am Hinterkopf zurückzuführen. Gefärbte Schnitte zeigen den Gennari-Streifen in V1 (Abb. 1, durch Pfeile angezeigt). Die Morphologie der MASH-gereinigten Probe bleibt nach Dehydrierung, Delipidierung und Anpassung des Brechungsindex (RI) gut erhalten, und sowohl graue als auch weiße Substanz werden hochtransparent. Die in MASH-gereinigten Proben beobachtete Gewebeschrumpfung ist relativ gering, mit einer durchschnittlichen Verringerung der gemessenen Oberfläche von 12 % (ergänzende Abbildung 3). Die schwarzen Artefakte in Abb. 1a entstehen durch Lichtstreuung bei der Abbildung des Heißklebers, der zur Fixierung der Probe in der 3D-gedruckten Abbildungskammer verwendet wird. Dies geschieht, wenn die tiefste aufgezeichnete Schicht des Bildvolumens über das Gewebe und in den darunter liegenden Kleber hineinragt.

Wir haben die in Abb. 1 gezeigten Okzipitallappenproben für die Multiskalen-CT-dSPIM-Bildgebung verwendet. Zunächst führten wir einen Mosaik-16-Übersichtsscan der gesamten Probe durch (siehe Abbildungen 1, 2, 4 und Zusatzvideo 3). Abbildung 1 zeigt die 3D-Rekonstruktion beider Schichten mit einem Mosaik-16-Datenvolumen bei einer isotropen Auflösung von 16,4 µm. Die Scanrichtung kann als die Richtung der langen Bildstapel oder -streifen (jeweils 0,74 × 0,74 mm tief und breit und viele Zentimeter lang) erkannt werden, die in den verbleibenden beiden Richtungen gekachelt sind, um eine vollständige 3D-Probenabdeckung zu gewährleisten. Mehrere kortikale Schichten können durch ihre Unterschiede in der Zelldichte unterschieden werden (Abb. 1, weiße Pfeilspitzen) und die V1/V2-Grenze ist bei dieser mesoskopischen Auflösung als deutliche Veränderung in der Schichtstrukturierung sichtbar (Abb. 1, schwarze Pfeile).

In Abb. 2 sind Volumendarstellungen und orthogonale Maximum-Intensity-Projektionen (MIPs) dargestellt, um die erhaltene Volumenabdeckung besser zu visualisieren. Die verschiedenen Achsen (wie im Bildbetrachter beschriftet, siehe ergänzende Abbildung 4) werden in Grün (XZ), Rot (YZ) bzw. Blau (XY) angezeigt. Die XY-Ansicht zeigt die Kachelung der langen Aufnahmestapel in Z-Richtung des Volumens (entsprechend der X-Achse der Bühne während der Aufnahme). Die orthogonalen Ansichten verdeutlichen auch die Etikettendurchdringung und -qualität in der gesamten 3 mm dicken Probe.

Nach der Aufnahme des Übersichtsmosaiks 16 wurde ein Mosaik-4-Scan mit höherer Auflösung und isotroper Auflösung von 4,1 µm in einem ROI nahe der V1/V2-Grenze durchgeführt (Abb. 3, 4). Die orthogonalen Ansichten von 50-µm-MIPs werden durch grüne (XY), rote (XZ) bzw. blaue (YZ) Felder angezeigt und zeigen Unterschiede in der kortikalen Schichtung unabhängig von der Ausrichtung (Abb. 3, Pfeile). Die Einsätze mit höherer Vergrößerung (XY: Gelb, Bild- und Beschriftungsqualität auch tief in der Probe (Abb. 3). Mesoarchitektonische kortikale Merkmale wie Minisäulen werden bei dieser Auflösung gut sichtbar (Abb. 4 Magenta-Panel) und dünnere kortikale Schichten, die in den Mosaik-16-Daten nicht sichtbar sind, können unterschieden werden. Die höhere Auflösung ermöglicht es sogar, einige der größten Einzelzellen zu unterscheiden (Abb. 3, 4, vergrößerte Felder), trotz der Körnigkeit des okzipitalen Kortex.

Um das Potenzial der volumetrischen Bildgebung des Gehirns für die quantitative 3D-Histologie zu demonstrieren, führten wir eine automatisierte Zellzählung in einem hochauflösenden Volumen von 0,5 µm (Ergänzungsvideo 4) durch (Abb. 5; Voxelgröße: 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm). Ziel war es, die Zelldichten in den verschiedenen kortikalen Schichten quantitativ zu vergleichen. Das gesamte Volumen (Abb. 5a) eines entzerrten, zusammengefügten und neu geschnittenen Datensatzes wurde manuell in die verschiedenen kortikalen Schichten segmentiert (Abb. 5b). In einem Bereich des Datensatzes, der beschädigtes Gewebe enthielt, konnte die Schichtsegmentierung nicht zufriedenstellend durchgeführt werden. Dieser Bereich wurde daher von der Analyse ausgeschlossen (ungefärbte Teile in Abb. 5b). Anschließend wurden die Daten in einer automatisierten Pipeline verarbeitet, um die Rohbilder zu filtern und Zellkörper zu segmentieren (Abb. 5c, d). Die Anzahl aller Zellsegmente, die größer als 125 µm3 sind und vollständig im entsprechenden Schichtsegment enthalten sind, wurde verwendet, um Schätzungen der Zelldichte für jede Schicht abzuleiten (Abb. 5e). Die Zellzahlen wurden für Schichten mit mehreren nicht verbundenen Segmenten zusammengefasst. Wie erwartet weist Schicht I mit knapp über 60.000 segmentierten Objekten pro mm3 die niedrigste Zelldichte auf, allerdings ist die Dichte höher als für diese Schicht erwartet. Schicht II zeigt zwar höhere Zelldichten als Schicht I oder IIIa (wie erwartet), zeigt jedoch eine geringere Dichte als aufgrund des qualitativen Eindrucks während der Schichtsegmentierung zu erwarten war. Überraschenderweise hatten die Schichten IIIb, V und VI höhere Zelldichten als die Schichten II oder IIIa. Schicht IV, die sichtbar mit Abstand dichteste Schicht, wies mit fast 100.000 segmentierten Objekten pro mm3 auch die höchste Zelldichte in unserem Datensatz auf. Mehrere dieser Beobachtungen lassen sich wahrscheinlich zumindest teilweise durch Teilvolumeneffekte erklären. Um die Ergebnisse der automatisierten Segmentierung zu validieren, führten wir eine manuelle Zellzählung für denselben Datensatz durch. Bei der verwendeten automatischen Zellsegmentierungsmethode kam es im Vergleich zu den manuellen Zählungen zu einer durchschnittlichen Überzählung von 36 % (siehe ergänzende Abbildung 5). Dies wurde teilweise, aber nicht vollständig, durch den Ausschluss von Segmenten gemildert, die als zu klein für die Darstellung von Zellen galten (<125 µm3). Nach dem Filtern dieser kleinen Strukturen wurden die zweiten automatisierten Ergebnisse um durchschnittlich 17 % überzählt. Es wurde beobachtet, dass insbesondere größere Zellen bei der automatischen Segmentierung häufig in mehrere kleinere Objekte segmentiert wurden, wenn es sichtbare Intensitätsunterschiede im gesamten Zytoplasma oder zwischen Zytoplasma, Kern und Nukleolus gab.

Wir haben FFPE-MASH für formalinfixierte und in Paraffin eingebettete (FFPE) menschliche axiale Ganzkörperprostataschnitte entwickelt. Zum ersten Mal wurde das MASH-Protokoll mit der Bezeichnung MASH-NR erfolgreich auf große Prostatakrebsproben verschiedener Patienten angewendet (die axialen Ganzkörperschnitte; Abb. 6, 7; ergänzende Abb. 1, 2; ergänzendes Video 5). . Wir demonstrieren daher die Machbarkeit der Anwendung von MASH nicht nur auf Gewebe anderer menschlicher Organe als des Gehirns, sondern auch auf FFPE-Material. Darüber hinaus konnten wir die Machbarkeit einer Hochgeschwindigkeits-Mosaik-16-ct-dSPIM-Bildgebung (1,7 h/1 cm3) an großen MASH-NR-gereinigten und markierten Prostatakrebsproben zeigen. Die großen mesoskopischen Übersichten ermöglichen die anatomische Beschreibung der Morphologie des Prostatagewebes und die Angabe möglicher neoplastischer Regionen (Abb. 6d, h; durch rote Kreise angezeigt), bei denen es sich histopathologisch um ein Adenokarzinom der Prostata handelte. Die mikroskopische Untersuchung der entsprechenden Hämatoxylin-Eosin-Schnitte zeigte, dass der Tumor aus kribriformen und verschmolzenen neoplastischen Drüsen besteht, die mit einem hochgradigen Prostata-Adenokarzinom vereinbar sind. Im Mosaik-16-Volumen (Abb. 6d, h) konnten verschiedene Schichtzonen und Kompartimente der Prostata klassifiziert werden, nämlich das fibromuskuläre Stroma (AFS), die zentrale Zone (CZ), die periphere Zone (PZ), der Übergang Zone (TZ) und der Harnröhre (U). Darüber hinaus ermöglichten Mosaik-4-Scans mit höherer Auflösung die Erkennung der Tumormorphologie in der gesamten Gewebeprobe, und der Pathologe schlug einen Gleason-Score von 3 und 4 im axialen Gesamtabschnitt (Prostatektomie) vor (ergänzende Abbildung 2).

Die 3D-Visualisierung der ct-dSPIM-Abbildung der axialen Prostataschnitte (Abb. 7; ergänzende Abb. 2) ermöglicht die Erkennung des Querschnitts der Urethra prostatica, dargestellt in den orthogonalen Schnitten über die gesamte Probendicke (Abb. 7a, grünes und blaues Kästchen, gestrichelter Einschub zeigt die Tumorregion an). Das in Abb. 7 dargestellte 3D-Volumen zeigt auch die Krebsregion, die durch die rote gestrichelte Linie in der Oberflächenansicht angezeigt wird, wie von einem Pathologen bestätigt. Die Tumorregionen sind auch im Orthogonalschnitt in Abb. 7a durch die grüne und die blaue gestrichelte Linie gekennzeichnet. Abbildung 7b zeigt eine 3D-Vergrößerung der Tumorregion, die im roten gestrichelten Linienfeld in a dargestellt ist.

Hier präsentieren wir den neuartigen ct-dSPIM-Prototyp für die Lichtblatt-Bildgebung von geklärtem Gewebe von großen menschlichen Gewebeproben und unsere Anwendung sowohl auf axiale Ganzkörperschnitte des menschlichen Gehirns als auch der Prostata (nach Prostatektomie). Wir konnten die Effizienz und Durchführbarkeit der ct-dSPIM-Bildgebung sowohl mit MASH-präparierten19 archivierten menschlichen Hinterhauptslappen (Abb. 1–5) als auch mit Prostataresektionen (Prostatektomie; Abb. 6, 7) demonstrieren. Das FFPE-MASH-Protokoll19 mit der MASH-NR-Markierung wurde zum ersten Mal erfolgreich auf große formalinfixierte und in Paraffin eingebettete (FFPE) Prostatakrebsproben angewendet, wie in den Abbildungen gezeigt. 6 und 7 sowie in den ergänzenden Abbildungen. 1 und 2 und Zusatzfilm 5. Dies zeigt nicht nur die Anwendbarkeit von MASH auf andere Gewebetypen außer dem menschlichen Gehirn, sondern, was ebenso wichtig ist, zusätzlich zu formalinfixierten Proben auch auf FFPE-Proben. Zuvor haben wir das MASH-Protokoll auf formalinfixierte archivierte menschliche Gehirnproben angewendet, die bis zur Verwendung in 4 % PFA aufbewahrt wurden. Die Verwendung des MASH-Protokolls auf FFPE-Material könnte seine Anwendung in anderen Bereichen erweitern, da FFPE-Gewebe seit Jahrzehnten häufig in der Forschung und klinischen Anwendung verwendet wird, was bedeutet, dass die potenziellen Auswirkungen auf die klinische Praxis beträchtlich sind. Der wichtigste Schritt bei der Modifizierung von MASH zu FFPE-Gewebe ist die anfängliche Entparaffinierung in Xylol, die ausreichend lange dauern muss, um die vollständige Auflösung des Paraffins in dicken Proben zu ermöglichen. Daher könnte dieser Schritt durch die Anwendung dieser Technik auf frische Proben ohne vorherige Fixierung und Verarbeitung mit Paraffinierung entfallen, was die Verarbeitungszeit des MASH-Gewebes erheblich verkürzen würde.

Als Ergänzung zu den Übersichtsaufnahmen von Mosaik 16 mit einer isotropen Auflösung von 16,4 µm haben wir Scans mit höherer Auflösung in bestimmten Regionen von Interesse erfasst. Während ein Mosaik 16 einen Überblick über den gesamten Gewebeblock bietet, ermöglichen Mosaik 4 (4,1 µm isotrope Auflösung) und Mosaik 0,5 (nahezu 1 µm Auflösung) eine detailliertere Beurteilung von Teilen desselben Gewebes. Zusammengenommen ermöglicht dieses mehrskalige Datenerfassungsschema die Identifizierung verschiedener mesoskopischer Merkmale wie Schichten, Minisäulen und Zellkörper im Gehirn (Abb. 4). Dies ermöglicht die umfassende und detaillierte Analyse großer menschlicher Gewebeproben.

Die isotrope Abtastung der Datensätze „Mosaik 16“ und „Mosaik 4“ basiert auf einer √2-Beziehung der Schichtschrittlänge zur lateralen Abtastauflösung und ist optisch durch die axiale Auflösung begrenzt, dh durch die theoretische Lichtblattdicke von ~8 µm. Die Gesamterfassungsgeschwindigkeit von Mosaik-Scans wird nur durch die maximale Scangeschwindigkeit der Stufe begrenzt und reicht derzeit von 1,7 h/~1 cm3 für Mosaik 16 bis 5 h/~1 cm3 für Mosaik 4 und 15,8 h/~1 cm3 für Mosaik 0,5 . Die Mosaik-16-Übersichtsscans ermöglichten die hochvolumige Hochgeschwindigkeitsvisualisierung einer gesamten 5-mm-Prostatektomie-Gewebeplatte oder einer gesamten 3-mm-Gewebeplatte des menschlichen Hinterhauptslappens. Hier zeigen wir Mosaikscans der okzipitalen Proben mit einer Aufnahmedauer zwischen 2 Stunden 23 Minuten (Mosaic 0,5), 3 Stunden 45 Minuten (Mosaic 4) und bis zu 8 Stunden 26 Minuten der gesamten 5 cm3 großen Okklobenprobe (Mosaic 16; Abb. 1–5). Die Zeit für die Aufnahme eines Oberflächenschicht-Mosaik-16-Scans einer Prostataprobe, wie in Abb. 6 dargestellt, betrug 50 Minuten.

In Zukunft könnte die Methode die derzeitigen Auflösungsgrenzen verschieben. Es ist theoretisch möglich, eine Dual-View-CT-dSPIM-Bildgebung mit einer effektiven optischen Auflösung von ~1 µm durchzuführen, was größtenteils in Zellkulturen nachgewiesen wurde. In jüngster Zeit wurden Demonstrationen in gereinigtem Gewebe durchgeführt18,20, bei denen die Dual-View-Bildgebung und die anschließende Dual-View-Entfaltungsverarbeitung durch starke Beschleunigung der Entfaltungsverarbeitung zum Einsatz kamen. Doch selbst bei den neuesten Entwicklungen20, bei denen die Entfaltung durch tiefes Lernen implementiert wird, das auf dem Bilderzeugungsprozess basiert, liegen die Verarbeitungszeiten immer noch in der Größenordnung von einigen Stunden (2–3 Stunden) für Volumina, die um drei Größenordnungen kleiner sind (1,4). × 2,3 × 0,5 mm3) als die hier berichteten, was selbst mit den fortschrittlichsten aktuellen Methoden Tausende von Stunden Verarbeitung für die hier vorgestellten sehr großen Proben bedeutet. Darüber hinaus würden Dual-View-Aufnahmen die derzeitigen Aufnahmezeiten verdoppeln, was den gesamten Zeitaufwand für die Auflösungsverbesserung erheblich und im relevanten Kontext sehr großer Gewebeproben und der zukünftigen klinischen Anwendung in der Prostata unrealistisch machen würde. Darüber hinaus sind für die Zwecke dieser Studie, mit dem Ziel einer effizienten und skalierbaren Bildgebung mit großem FoV und ausreichender Auflösung (anstelle der höchstmöglichen optisch begrenzten Auflösung), die Kosten-Nutzen-Analyse und die Machbarkeit in Bezug auf die Gesamtzeit derzeit die Dual-View-Bildgebung ungünstig. In unsere aktuelle Studie haben wir ct-dSPIM-Mosaikbilddaten eines Teilvolumens des menschlichen Gehirns (Occipitallappen) mit einer (abgetasteten) Auflösung von 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm einbezogen. Obwohl die tatsächliche optische Auflösung geringer ist (in der Größenordnung von 8,0 µm × 0,8 µm × 0,8 µm mit dem 0,4 NA-Objektiv), können diese Einzelansichtsdaten mit angemessenen Datenraten erfasst werden und sind für die beabsichtigten Zwecke, einschließlich der Erkennung einzelner Zellen, ausreichend. Segmentierung und quantitative Zellzahl in menschlichen Gehirnproben. In Prostatakrebsproben ermöglicht eine Abtastauflösung im Bereich von 16 bis 0,5 µm eine effiziente 3D-Tumorbildgebung mit einer Bildqualität, die für klinische Untersuchungen ausreichend ist (Abb. 8, 9; ergänzende Abb. 4, 5). Für zukünftige Arbeiten sehen wir Chancen (z. B. subzelluläre Auflösung für intrazelluläre Strukturen oder neuronale axonale oder dendritische Strukturen) und die Möglichkeit, unsere aktuellen Bemühungen mit einer höheren nahezu isotropen Auflösung zu kombinieren. Bei solchen Bemühungen verdienen sowohl entfaltete Dual-View-Ansätze als auch axial gescannte Single-View-Ansätze eine Berücksichtigung für die Bildgebung großer Gehirn- und Prostataproben21,22.

eine 3D-Darstellung der größeren Bildgebungskammer, die routinemäßig im ct-dSPIM-Aufbau verwendet wird. Die Kammern haben ein Volumen von 0,9 l (20 cm × 15 cm × 3 cm). Die Kammer wird in Draufsicht (oben), Schrägansicht (Mitte) und Seitenansicht (unten) dargestellt. b Kammerprototyp mit SLS in PP gedruckt. c Kammerprototyp, gedruckt mit SLA in Somos®WaterShed XC 11122. Die Proben werden auf Glasobjektträgern montiert, die mit Silikon versiegelt sind, um zu verhindern, dass die Kammer ausläuft. RIMS.

a Das emittierte Laserlicht wird kollimiert und gelangt durch eine elektronisch abstimmbare (ETL) Linse (C60-TUNELENS-100, ASI) in den Lichtblatt-„Scanner“ (MM-SCAN-1.2, ASI). Mit dem ETLf kann die axiale Position der Strahltaille an der Probe elektronisch gesteuert werden. Die Legende wird auf der nächsten Seite fortgesetzt. Der Scanner enthält einen 2D-MEMS-Spiegel, der den Gaußschen Strahl einmal pro Kamerabild über die Probe streicht, um ein „virtuelles“ oder „digitales“ Lichtblatt zu erzeugen. Die andere Achse des MEMS-Spiegels wird verwendet, um das Lichtblatt so einzustellen, dass es mit der Brennebene des Detektionsobjektivs übereinstimmt. b Die Abbildungswege sind die beiden möglichen Lichtwege (Wege A und B). Für jeden Pfad befindet sich der Scanner auf einer Seite und der Bildgebungspiezo und die Kamera auf der gegenüberliegenden Seite. Das Licht wandert wie dargestellt durch die verschiedenen Komponenten, wie den dichroitischen Spiegel und den Emissionsfilter (Anregungspfade: blaue gepunktete Linie; Emissionspfade: durchgezogene grüne Linie). Die gefilterte Fluoreszenz wird durch eine Tubuslinse (C60-TUBE-B, ASI; f = 200 mm) auf eine 2048 × 2048 Pixel große sCMOS-Kamera (ORCA-Flash4.0 V3, Hamamatsu) fokussiert.

Einer der vielversprechenden Aspekte der volumetrischen Bildgebung, die in diesem Artikel gezeigt wird, ist die Tatsache, dass sie es uns ermöglicht, ein großes Volumen des menschlichen Kortex mit hoher räumlicher Auflösung abzubilden, was uns wiederum die Untersuchung zellulärer Strukturen über erweiterte Sichtfelder ermöglicht. In Zukunft könnte dies prinzipiell die Quantifizierung von Zelldichten für verschiedene Bereiche und Schichten ohne stereologische Verzerrung ermöglichen, da es sich bei den abgeleiteten Zellzahlen nicht um Extrapolationen aus 2D-Schnitten handelt. Allerdings sollten stereologisch abgeleitete Schätzungen der Zelldichten zum jetzigen Zeitpunkt immer noch als Goldstandard betrachtet werden, da sie gut etabliert sind. Es ist daher interessant, wie unsere 3D-Segmentierungs- und Zählergebnisse mit stereologischen Daten in der Literatur zusammenhängen. Leider sind Schätzungen der Zelldichte im sekundären visuellen Kortex des Menschen selten. Schätzungen, die mit stereologischen Methoden wie dem isotropen Fraktionierer23 berechnet wurden, werden typischerweise in Zellen pro Gramm Hirngewebe angegeben und lassen sich nicht einfach in unsere Volumenschätzungen umrechnen.

Leuba und Garey24 fanden im Bereich V2 eine durchschnittliche Zellzahl von 14.7600 unter einer kortikalen Fläche von 1 mm2 oder 63.700 Zellen/mm3. Die Gesamtzelldichte in unserem Datensatz über alle Schichten hinweg betrug 81.903 Zellen/mm3. Es wird als unwahrscheinlich angesehen, dass diese höheren Zellzahlen in unseren Daten auf eine durch Clearing verursachte Gewebeschrumpfung zurückzuführen sind, da die beobachtete Größenänderung unserer Proben relativ gering ist (siehe ergänzende Abbildung 3). Dies gilt insbesondere im Vergleich zu anderen lösungsmittelbasierten Gewebereinigungsmethoden, die eine viel höhere Gewebeschrumpfung von 30 %14 oder sogar bis zu 50 %25 aufweisen. Wenn wir die beobachtete Überzählung der automatisierten Zellsegmentierung von durchschnittlich 17 % berücksichtigen (ergänzende Abbildung 5), liegen unsere korrigierten Zellzahlen mit 67.980 Zellen/mm3 relativ nahe an Leuba und Garey. Wenn wir uns auf die einzelnen Schichten konzentrieren, stimmt unsere Zelldichte in Schicht IV im Allgemeinen gut mit Leuba und Garey überein, mit 97.529 Zellen/mm3 (unsere Daten) gegenüber 10.7316 Zellen/mm3. 24 Um die Dichten aller Zellen abzuleiten, haben wir ihre gemeldeten Werte multipliziert Neuronenzahlen mit ihrem gemeldeten Neuronen/Glia-Verhältnis und addierte diese beiden Populationen, da sie nur Gesamtzellpopulationsdichten für das gesamte Gebiet liefern, nicht jedoch in ihrer schichtspezifischen Tabelle. Leider führen Leuba und Garey nicht die Dichten für alle Schichten auf, sondern geben die supragranulären Schichten II und III sowie die infragranulären Schichten V und VI zusammen an. Sie berichten von einer supragranulären Zelldichte von 63.558 Zellen/mm3, was der Anzahl der Zellen ähnelt, die wir in Schicht IIIa fanden (66.884 Zellen/mm3). Allerdings weisen sowohl Schicht II (71.599 Zellen/mm3) als auch Schicht IIIb (82.712 Zellen/mm3) höhere Zellzahlen auf und daher ist auch die kombinierte supragranuläre Zelldichte mit 77.807 Zellen/mm3 höher. Wie bereits erwähnt, war die in Schicht IIIb beobachtete sehr hohe Zelldichte überraschend, da diese Schicht optisch weniger dicht mit spärlicheren, größeren Pyramidenneuronen wirkte. Eine mögliche Erklärung für diese Diskrepanz könnte ein Teilvolumeneffekt der sehr dichten angrenzenden Schicht IV sein, der auf eine unvollständige manuelle Schichtsegmentierung zurückzuführen ist. Ein weiterer wahrscheinlich beitragender Faktor könnte eine beobachtete Tendenz der automatisierten Zellsegmentierung sein, größere Neuronen in mehrere Segmente aufzuteilen, wenn sie Intensitätsunterschiede über ihr Zytoplasmavolumen aufweisen (siehe ergänzende Abbildung 5). Diese Tendenz, größere Zellen in mehrere Segmente zu segmentieren, führte zu einer durchschnittlichen Überzählung der automatisierten Zellsegmentierung von etwa 17 %, nachdem Segmente kleiner als 125 µm3 herausgefiltert worden waren. Wenn wir diese Überzählung berücksichtigen, liegt die kombinierte supragranuläre Zellzahl von 64.580 Zellen/mm3 deutlich näher an Leuba und Garey. Beide Faktoren könnten auch die in unseren Daten für Schichten V beobachteten größeren Zelldichten erklären, da die hohe Dichte von Schicht V (88.781 Zellen/mm3) ähnlich unerwartet war. Partielle Volumeneffekte konnten die ähnlich hohe Dichte der Schicht VI (81.904 Zellen/mm3) nicht erklären, obwohl die Aufspaltung großer Zellkörper wahrscheinlich immer noch zu einer Überzählung führte. Daher ist unsere kombinierte infragranulare Zelldichte wesentlich größer als die von Leuba und Garey berichtete (86.579 Zellen/mm3 gegenüber 53.658 Zellen/mm3). Selbst wenn wir die Überzählung der automatisierten Segmentierung berücksichtigen, wären unsere beobachteten infragranulären Zelldichten höher als die von Leuba und Garey (71.861 Zellen/mm3). Verbesserungen der Segmentierungsqualität könnten zumindest einige dieser Diskrepanzen mildern und die Zellschätzungen in diesem Bereich näher an die stereologischen Schätzungen bringen. Zhao et al. Verwenden Sie eine Deep-Learning-basierte Segmentierung auf volumetrischen Daten des gereinigten menschlichen Gehirns14. Es sollte beachtet werden, dass die Autoren dieser Arbeit über viel höhere Dichten (16.2000–21.6000 Zellen/mm3) berichten als Leuba und Garey oder die hier berichtete Arbeit, obwohl sie keine anderen Gebiete untersucht haben.

Ein möglicher Aspekt, der für die unterschiedlichen Zellzahlen bei diesen Ansätzen verantwortlich sein könnte, ist auch das Ausmaß der Schrumpfung, die während der histologischen Verarbeitung entsteht. Da sich der in dieser Studie verwendete Ansatz zur Gewebereinigung von dem von Zhao et al. 26 und bekanntermaßen eine relativ geringe Schrumpfung hervorrufen (12 % im Vergleich zu 30 %, die bei Zhao et al. angegeben wurden; siehe ergänzende Abbildung 3), könnte dies zumindest teilweise für diese Diskrepanz verantwortlich sein. Eine weitere kürzlich veröffentlichte Studie, die eine sehr ausgefeilte Zellsegmentierungspipeline27 anwendete, kam erneut zu völlig anderen Ergebnissen mit Neuronendichten von 14.000–24.000 Neuronen/mm3 (was bei Anwendung des Neuronen/Glia-Verhältnisses von Leuba und Garey etwa 28.000–47.500 Zellen/mm3 bedeutet). Der in dieser Studie verwendete Reinigungsansatz ist ein Reinigungsprotokoll für wässriges Gewebe, das das Gewebe ausdehnt. Dies wiederum könnte die niedrigeren Schätzungen erklären. Darüber hinaus verlassen sie sich zur Identifizierung neuronaler Zellpopulationen auf die Antikörpermarkierung und nicht auf einen allgemeineren organischen Farbstoff mit geringerem Molekulargewicht, der ebenfalls für einige der beobachteten Unterschiede verantwortlich sein könnte. Schließlich ist es auch möglich, dass die von Leuba und Garey verwendete stereologische 2D-Methode zu einer systematischen Unterzählung führt, wenn die 2D-Zellzahlen von Schnitten auf ein großes Gewebevolumen extrapoliert werden.

Die klassische histopathologische Prostatakrebsdiagnostik, insbesondere bei multifokalen Tumoren, ist eine Herausforderung3. Darüber hinaus würde die Beurteilung der gesamten Kernbiopsie oder die Resektion der gesamten Probe bis zu 10 Tage dauern, was ineffizient und sehr teuer ist und in der klinischen Standardpraxis fast nie durchgeführt wird. Daher eröffnet eine mögliche Mosaik-ct-dSPIM-Bildgebung der Prostata in Zusammenarbeit mit Onkologen und Pathologen im örtlichen Krankenhaus neue Möglichkeiten für die zukünftige Krebsdiagnostik.

Jüngste Arbeiten haben die Nützlichkeit von LSFM zur Untersuchung von 1–2,5 mm dicken Kernnadelbiopsien der menschlichen Prostata mithilfe eines selbstgebauten, oben offenen LSFM-Systems gezeigt. Stattdessen wurden hier komplette axiale Whole-Mount-Prostataschnitte mit einer Dicke von 5 mm sowohl mit Mosaik-16- als auch mit 4-ct-dSPIM-Scans innerhalb von ca. 30 Minuten untersucht. 1–5 Stunden, was zeiteffizient ist und eine relativ schnelle Übersichtsbeurteilung der gesamten Biopsie ermöglicht (Abb. 6, 7; Ergänzende Abb. 1, 2; Ergänzendes Video 5). Darüber hinaus ermöglicht dies eine retrospektive Untersuchung einer sehr großen Anzahl archivierter Prostatakrebsproben (bis zu 8 Proben pro Tag). Die hochvolumige 3D-Bildgebung kann die Visualisierung von Tumoren in tieferen Schichten oder Regionen und in der gesamten dicken Prostataresektionsprobe ermöglichen. Dies hat das Potenzial, neue Einblicke sowohl in die krebsartige als auch in die gutartige Gewebestruktur der Prostata zu gewinnen. Bisher sind die aktuellen Informationen zur 3D-Prostata-Architektur begrenzt, da sie auf einer MRT-Untersuchung basieren, die keine detaillierte und hochauflösende Analyse des gesamten Organs, einschließlich Drüsenbildung, Lumen und Epithelschicht, ermöglicht. In der aktuellen histopathologischen Praxis ist jedoch die am häufigsten verwendete Technik eine Kombination aus klassischer Hellfeldmikroskopie und drei bis vier Ebenen von 5 µm dicken Gewebeschnitten, was zu 2D-Gewebeinformationen führt. Dies kann beim multifokalen Karzinom zu einer Untereinstufung des Tumors oder einer falsch-negativen Diagnose führen, da diese meist in den tiefen Schichten von Gewebeblöcken vorhanden sind. Daher ist es für den Pathologen und Onkologen von großem Wert, mithilfe von 5 mm dicken Prostataproben von Patienten neuartige hochauflösende 2D- und 3D-High-Volume-Einblicke in die detaillierte Prostatatumorarchitektur zu erhalten (Abb. 6, 7; ergänzende Abb. 1, 2). ; Ergänzungsvideo 5). Eine quantitative Lichtblatt-Bildgebung dieser dickeren Prostatakrebsproben (Prostatektomie) kann die Präzision der Diagnostik verbessern. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass es mit unserer Methode der ct-dSPIM-Bildgebung von gereinigtem Gewebe möglich ist, Tumore zu erkennen und sogar eine Gleason-Score-Einstufung zu ermöglichen (ergänzende Abbildung 2), einschließlich der Erkennung des neoplastischen Prozesses und der Unterscheidung von normalem, gutartigem Prostatagewebe vom Adenokarzinom. Sowohl die Mosaik-16- (Abb. 6, 7) als auch die Mosaik-4-Scans (ergänzende Abbildungen 1, 2; ergänzendes Video 5) ermöglichten die Erkennung von Tumoren im axialen, gesamten Prostataabschnitt bei verschiedenen Patienten.

Da Mosaikaufnahmen auf dem ct-dSPIM außerdem eine Hochgeschwindigkeits-3D-Untersuchung großer Prostataproben ermöglichen, ist es möglich, Hochdurchsatz-Bildgebungspipelines für ca. 20 Proben in 10 Tagen, wenn jeweils nur eine Probe abgebildet wird. Die Standardverarbeitung der Prostata umfasst eine mindestens 24-stündige Fixierung, gefolgt von der Entnahme und Verarbeitung in einem Vakuuminfiltrations-Gewebeprozessor (mindestens 24 Stunden). Daher könnte dieser Schritt durch die Anwendung des vorgeschlagenen MASH- und ct-dSPIM-Ansatzes auf frische Resektionsproben entfallen. Dies könnte möglicherweise erhebliche Auswirkungen auf die klinische Praxis haben und den diagnostischen Arbeitsablauf beschleunigen. Angesichts der Größe des Bildgebungsbehälters (siehe Abb. 8) könnten mehrere Proben parallel im ct-dSPIM untergebracht werden, was die Bildgebung möglicherweise noch effizienter macht. Dies kann zu einer schnellen Wissensgewinnung führen und ist für verschiedene Patientenproben in unterschiedlichen Stadien der Krankheit durchführbar, während gleichzeitig ausreichende Daten für Statistiken und Quantifizierung der Tumorvariation und -lokalisation bereitgestellt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Methode das Potenzial hat, die Bildgebung menschlicher Prostatakrebsresektionsproben zu verbessern. Es bietet eine neuartige 3D-Visualisierung der gesamten Probe im Detail, was mit herkömmlichen Methoden zeitlich und ressourcenmäßig nicht möglich wäre. Es könnte auch zu einer schnelleren Prostatabildgebung führen, was sich positiv auf die Effizienz der klinischen Praxis auswirkt und neue Möglichkeiten für die (Archivgewebe-)Forschung eröffnet. Darüber hinaus könnte es insbesondere bei multifokalen Karzinomen eine genauere Diagnostik ermöglichen.

Wir demonstrierten großflächige Mosaikbildgebung auf dem ct-dSPIM-System und zeigten, dass wir in der Lage waren, die Einschränkungen anderer vorhandener Lichtblattmikroskope für die Abdeckung sehr großer menschlicher Proben zu überwinden16,28. Im Gegensatz zu anderen kürzlich veröffentlichten Aufbauten17,28 verwendet das ct-dSPIM eine schräge Geometrie, bei der die Objektive direkt von oben in die Bildgebungsflüssigkeit eintauchen17,28. Bei früheren Systemen befanden sich die Objektive unterhalb der Probe, was eine Bildgebung durch den Glasboden der Kammer erforderlich machte. Die Probengröße wird durch diese Geometrie möglicherweise weiter eingeschränkt, da der Arbeitsabstand (WD) durch die Abbildung durch das Glas und eine zusätzliche Linse effektiv verloren geht. Andere Systeme verwenden eine eher standardmäßige (d. h. aufrechte, nicht schräge) Lichtblattgeometrie und verwenden eine neuartige Methode zur Erzeugung des Lichtblatts selbst, um sehr große Proben abzubilden11. Bei diesen Systemen ist die laterale Ausdehnung letztendlich begrenzt, da selbst bei den transparentesten Proben in gewissem Maße Lichtstreuung auftritt und die Bildqualität tiefer im Gewebe nachlässt. Dies kann mit einem schrägen Aufbau wie dem ct-dSPIM vermieden werden, sodass die seitliche Größe der Probe nur durch den Verfahrbereich des Mikroskoptisches begrenzt bleibt.

Weitere Hardware-Änderungen, wie etwa ein Zylinderlinsen-Scanner (anstelle eines digital gescannten Laserlichtblatt-Scanners) und Anpassungen der Bühnenkachelbahn, wie etwa eine Serpentinenbahn, könnten die Bildgebungsgeschwindigkeit möglicherweise um das Zwei- bis Vierfache erhöhen. Dies würde eine völlig neue Dimension in der Untersuchung von postmortalem gesundem und erkranktem Hirngewebe eröffnen. Andere Hardwaremodifikationen des ct-dSPIM-Aufbaus, wie z. B. höhere NA- und Vergrößerungsobjektive sowie ein axial gescannter Lichtblattansatz, könnten möglicherweise eine Erhöhung der Auflösung für die Bildgebung auf Kosten des Sichtfelds oder der Zeit ermöglichen Bild mit der gleichen Stichprobengröße. Diese zukünftigen Entwicklungen könnten es ermöglichen, verschiedene Strukturen und Marker in größeren Teilen des Gehirns abzubilden, mit dem Potenzial, neue Einblicke in die gesunde und pathologische menschliche Neuroanatomie zu liefern.

Darüber hinaus könnten die Möglichkeiten durch die Etablierung weiterer Markierungsoptionen, wie der Markierung kleiner Moleküle der Angioarchitektur des Gehirns sowie von Strategien zur Antikörpermarkierung, die auch für die Bildgebung großer Proben mit ct-dSPIM geeignet sind, weiter erweitert werden. Zukünftig könnte die gesamte Pipeline von der Gewebeverarbeitung (mit MASH-Clearing und -Markierung) bis zur ct-dSPIM-Mosaikbildgebung und Datenanalyse auf größere Teile des Gehirns und Gehirnregionen ausgeweitet werden, beispielsweise auf den gesamten Schläfen- oder Hinterhauptslappen in 3–4 5 mm dicke Platten. Da die laterale Probengröße im aktuellen Aufbau möglicherweise viel größer sein kann, wäre es sogar möglich, ganze Hirnschnitte abzubilden, vorausgesetzt, es wird eine Gewebeverarbeitungspipeline für Proben dieser Größe eingerichtet.

Obwohl wir die Verwendung von MASH-präpariertem menschlichem und Prostatagewebe als Anwendungsfälle für groß angelegte Akquisitionen auf dem ct-dSPIM demonstriert haben, könnte diese Technik möglicherweise auch auf eine Vielzahl anderer menschlicher und nichtmenschlicher Säugetiergewebe ausgeweitet werden. Dies könnte die Kombination von MASH mit der ct-dSPIM-Bildgebung zu einem leistungsstarken Werkzeug für anatomische und pathologische Studien im Allgemeinen machen.

Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass das ct-dSPIM ein hervorragendes Werkzeug für die effiziente quantitative 3D-Lichtblattbildgebung sehr großer menschlicher Gewebeproben ist. Wir konnten die Anwendung der ct-dSPIM-Bildgebung auf optisch gereinigte postmortale menschliche Gehirnproben (Occipitallappen) und Prostatakrebsproben (axiale Ganzkörperprostataschnitte) im cm3-Maßstab zeigen. Mithilfe eines schnellen Überblicks und anschließender hochauflösender Mosaikscans der identifizierten ROIs konnten wir eine Zählung menschlicher Gehirnzellen in den Hinterhauptlappenproben und eine Gleason-Score-Einstufung in den axialen Abschnitten der gesamten Prostata durchführen. In der Zukunft hat die ct-dSPIM-Bildgebung das Potenzial, in umfassenderen grundlegenden und klinischen Untersuchungen großer Gewebeproben eingesetzt zu werden.

Menschliche Hinterhauptlappenproben wurden von drei menschlichen Körperspendern (Spender 1: männlich, 98 Jahre; Spender 2: weiblich, 101 Jahre; Spender 3: weiblich, 90 Jahre; keine bekannten neuropathologischen Erkrankungen) im Rahmen des Körperspendeprogramms der Abteilung entnommen für Anatomie und Embryologie, Universität Maastricht (UM). Für die Schrumpfungsbewertung wurde Gewebe der Spender 2 und 3 verwendet (ergänzende Abbildung 3). Die Gewebespender hatten ihre informierte und schriftliche Zustimmung zur Spende ihres Körpers für Lehr- und Forschungszwecke gegeben, wie es im niederländischen Gesetz über die Nutzung menschlicher Überreste für wissenschaftliche Forschung und Bildung („Wet op de Lijkbezorging“) geregelt ist. Dementsprechend wird in der Abteilung für Anatomie und Embryologie der UM, Maastricht, Niederlande, ein handschriftliches und unterzeichnetes Kodizill des Spenders aufbewahrt, das noch lebte und gesund war. Die menschlichen Gehirne wurden zunächst in situ durch Ganzkörperperfusion über die Oberschenkelarterie fixiert. Unter einem Druck von 0,2 bar wurde der Körper innerhalb von 1,5–2 Stunden mit 10 l Fixierungsflüssigkeit (1,8 Vol.-% Formaldehyd, 20 % Ethanol, 8,4 % Glycerin in Wasser) durchströmt. Danach wurde der Körper mindestens 4 Wochen lang in derselben Flüssigkeit eingetaucht zur Nachfixierung konserviert. Anschließend wurden Gehirnproben durch Schädelpräparation gewonnen und 14–30 Monate lang in 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelagert.

Alle Prostataresektionsproben wurden im Zeitraum zwischen 2007 und 2015 aus dem Archiv der Abteilung für Pathologie des Maastricht University Medical Center (MUMC+) abgerufen. Für diese Veröffentlichung wurden drei Proben verwendet. Diese Studie wurde vom Medical Ethics Review Committee des Maastricht University Medical Center in den Niederlanden (2020–1537) genehmigt. Alle Proben wurden gemäß dem Protokoll des niederländischen Verhaltenskodex für Beobachtungsforschung mit personenbezogenen Daten und Gewebe (2004)29 gesammelt und untersucht. Die Proben wurden zu diagnostischen Zwecken entgegengenommen und gemäß den internen Standardarbeitsanweisungen gemäß den nationalen und internationalen Empfehlungen verarbeitet. Die Dicke des axialen Gesamtabschnitts der Prostataprobe liegt zwischen 3 und 5 mm. Kurz gesagt, die Proben wurden zunächst 24 Stunden lang mit 4 % gepuffertem Formalin fixiert und im Vacuum Infiltrating Processor Tissue Tek VIP6 (Sakura Finetek USA, Inc, Torrance, CA, USA) weiterverarbeitet, wo die Proben durch Eintauchen dehydriert wurden eine Reihe von Ethanollösungen mit steigender Konzentration, bis reiner, wasserfreier Alkohol erreicht wurde. Auf diesen Schritt folgte eine Reinigung des Gewebes in einer Xylollösung mit anschließender Infiltration der Probe mit Paraffin. Schließlich wurden die Proben gemäß den routinemäßigen pathologischen Diagnoseverfahren im HistoCore Arcadia Embedding Center (Leica Microsystems BV, Amsterdam, Niederlande) in Paraffin eingebettet.

Alle Proben wurden gereinigt und mit neutralem Rot markiert, wobei das MASH-NR-Protokoll verwendet wurde, wie in unserer vorherigen Veröffentlichung19 beschrieben. Da das klinische Standardprotokoll für die Prostata formalinfixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) Proben produzierte, wurde ein modifiziertes MASH-Protokoll (FFPE-MASH-NR) zur Verarbeitung von FFPE-Prostataproben verwendet. Im FFPE-MASH-NR-Protokoll mussten Prostataproben vor der standardmäßigen MASH-Reinigung entparaffiniert werden. Zu diesem Zweck wurden die Proben je nach Probengröße 3–7 Tage lang in Xylol inkubiert (für jede Probe wurde ein Xylolvolumen von etwa 200 ml verwendet). Paraffinblöcke wurden vor der Inkubation so weit wie möglich manuell zugeschnitten. Danach wurden die Proben jeweils 1 Stunde in 100 ml Xylol, 2 × 100 %, 70 %, 50 % Ethanol (EtOH) und schließlich PBS rehydratisiert. Rehydrierte Proben wurden bis zur Verwendung in 4 % gepufferter PFA-Lösung aufbewahrt. Die Reinigung und Kennzeichnung der Proben mit FFPE-MASH folgte den gleichen Schritten, die unten für die Gehirnproben beschrieben werden. Während all dieser Schritte wurden Prostataproben in einzelnen Glasbehältern aufbewahrt und in mindestens 50 ml der jeweiligen Lösung inkubiert. Die Behälter wurden stets in einem Schüttler aufbewahrt.

Alle Proben wurden gereinigt und mit neutralem Rot markiert, wobei das MASH-NR-Protokoll verwendet wurde, wie in unserer vorherigen Veröffentlichung19 beschrieben. Kurz gesagt, die Proben wurden jeweils 1 Stunde lang in einer wässrigen Mischung (v/v) aus 20, 40, 60, 80 und 100 % Methanol (MeOH) bei Raumtemperatur (RT) und 1 Stunde lang in 100 % MeOH bei 4 dehydriert °C. Danach wurden die Proben über Nacht in einer frisch zubereiteten, gekühlten Lösung von 5 % H2O2 in MeOH bei 4 °C gebleicht. Die Proben wurden dann jeweils 1 Stunde lang in 80 %, 60 %, 40 %, 20 % MeOH rehydriert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung + 0,2 % (v/v) Triton X-100 pH 7,4 permeabilisiert. Darauf folgte eine einstündige Inkubation in frisch filtrierter wässriger Lösung von 50 % Kaliumdisulfit (Gew./Vol.) und fünf schnelle Spülungen, gefolgt von einem einstündigen Waschen in destilliertem Wasser. Die Markierung der Zytoarchitektur erfolgte 5 Tage lang in einer Lösung von 0,001 % Neutralrot in Phosphat-Citrat-Puffer (auch bekannt als McIlvain-Puffer)30 bei pH 4. Die Proben wurden nach der Hälfte der Inkubationszeit gewendet. Nach der Markierung wurden die Proben 2 x 1 Stunde in McIlvain-Puffer pH 4 gewaschen und jeweils 1 Stunde in 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 2 x 100 % MeOH dehydriert. Die Delipidierung wurde über Nacht in 66 % Dichlormethan (DCM)/33 % MeOH durchgeführt, gefolgt von 2×1 Stunde 100 % DCM. Abschließend wurden die Proben mit Ethylcinnamat (ECi) als Lösung zur Anpassung des Brechungsindex (RIMS) inkubiert. Alle Schritte wurden bei RT durchgeführt.

Für die Inkubation mehrerer koronaler Schnitte ganzer Hinterhauptslappen wurde ein Glasgefäß mit einem Durchmesser von 8 cm mit Abstandshaltern aus Polyethylen oder Polytetrafluorethylen verwendet, um die Kompatibilität mit den bei der Delipidierung verwendeten organischen Lösungsmitteln sicherzustellen. Um zu verhindern, dass die Abstandshalter aus Kunststoff Abdrücke auf dem Gewebe hinterlassen, wurden Filterpapierstücke über und unter das Gewebe gelegt. Das Glasgefäß wurde für jeden oben beschriebenen Schritt vollständig gefüllt (ein Volumen von ca. 200 ml) und die Lösungen wurden während der gesamten Verarbeitung ständig mit einem Magnetrührer gerührt.

Um die durch MASH induzierte Gewebeschrumpfung zu bewerten, haben wir die Oberfläche von insgesamt 13 Hirnschnitten von drei verschiedenen Spendern gemessen (Probe „Occlobe16“ n = 4, Gewebe vom gleichen Spender wie in Abb. 3–7 dargestellt; Probe „Occlob10“ n = 6; Probe „Hemi6“ n = 3, koronale Schnitte vor dem Hinterhauptslappen). „Occlobe10“-Schnitte (n = 6) wurden von einem anderen Lappen entnommen, der für ein unabhängiges Projekt abgebildet wurde. „Hemi6“-Schnitte (n = 3) wurden aus vorgeschnittenem Material entnommen, das von der Abteilung für Anatomie und Embryologie der Universität Maastricht bereitgestellt wurde. Diese manuell geschnittenen koronalen Hirnschnitte von ca. 1 cm dicke Proben wurden vor der MASH-Verarbeitung weiter in 5 mm dicke Proben geschnitten. Vor dem Clearing und am Ende des Clearing-Verfahrens, nach dem RI-Matching, wurden skalierte digitale Bilder aufgenommen. Der Umfang der Gewebeschnitte wurde in FIJI manuell segmentiert und die Fläche vor und nach der Reinigung gemessen (Ergänzung Abb. 3).

Für die ct-dSPIM-Bildgebung wurden große kundenspezifische (20 × 15 × 3 cm, Volumen ca. 900 ml) Bildgebungskammern (Abb. 8) entweder aus ECi-beständigem Wassereinzugsgebietsmaterial (Somos®WaterShed XC 11122) oder Polypropylen (PP) 3D-gedruckt ). Der Druck wurde entweder von SKM Rapid Modeling bv (Helmond, Niederlande) mittels Stereolithographie (SLA) für die Wasserscheidendrucke durchgeführt oder mittels Selective Laser Sintering (SLS) von Materialise NV (Leuven, Belgien) für die PP-Kammern hergestellt. Der Bildgebungsbereich der Kammern war mit einem 178 × 127 × 1,2 mm großen Glasobjektträger (Ted Pella Inc., Redding, USA) als Boden ausgestattet, um Lichtreflexionen zu verringern, und mit reinem Silikondichtmittel verklebt. Alle Proben wurden mit Heißkleber (Rapid AB, Hestra, Schweden) auf den Glasobjektträger in der 3D-gedruckten Bildgebungskammer geklebt. Anschließend wurde die Bildgebungskammer mit mindestens 500 ml ECi-Lösung (RI 1,56) gefüllt, wobei je nach Probengröße auch größere Mengen vorhanden waren.

Das ct-dSPIM-Mikroskop dient der 3D-Bildgebung sehr großer, freigelegter Gewebeproben mit einer Dicke von bis zu 5 mm und einer lateralen Größe, die nur durch die Bewegungs- und Bildzeitbegrenzungen des XY-Tisches begrenzt ist. Es wurde vom diSPIM-System (Dual View Inverted Selective Plane Illumination Microscopy)31 abgeleitet und gemeinsam mit Applied Scientific Instrumentation Inc. (ASI, Eugene, USA) entwickelt. Ein optisches Schema des ct-dSPIM-Systems ist in Abb. 9 dargestellt. Die Laserlichtquelle (kohärenter Obis, Laserlinie 552 nm LS 40 mW LASERSYSTEM: FIBER PIGTAIL: FC) hat einen Singlemode-Faserausgang mit einem numerischen Apertur (NA) von 0,12. Das emittierte Laserlicht wird kollimiert und gelangt durch eine elektronisch abstimmbare (ETL) Linse (C 60-TUNELENS-100, ASI) in den Lichtblatt-„Scanner“ (MM-SCAN-1.2, ASI). Die abstimmbare Linse ermöglicht die elektronische Steuerung der axialen Position der Strahltaille an der Probe. Der Scanner enthält einen mikroelektromechanischen 2D-Spiegel (MEMS), der den Gaußschen Strahl einmal pro Kamerabild über die Probe streicht, um ein „virtuelles“ oder „digitales“ Lichtblatt zu erzeugen. Die andere Achse des MEMS-Spiegels wird zur Einstellung des l verwendet, das mit der Brennebene des Detektionsobjektivs zusammenfällt. Der Scanstrahl wird zur hinteren Brennebene des Multi-Immersions-Beleuchtungsobjektivs weitergeleitet (#54-10-12, Special Optics/Applied Scientific Instrumentation (ASI).

Die Fluoreszenz wird von einem identischen Multi-Immersions-Detektionsobjektiv (#54-10-12, Special Optics/ASI) gesammelt und führt zu einer lateralen Auflösung von ~1 μm (abhängig vom RI der Bildgebungslösung). Die Objektive sind mit einem Brechungsindex (RI)-Bereich von 1,33 bis 1,56 und einem Arbeitsabstand (WD) von 12 mm kompatibel. Sowohl die numerische Apertur (NA) als auch die effektive Brennweite (EFL) variieren mit dem Brechungsindex, aber für ECi beträgt die NA ~0,43, die EFL 11,2 mm und die Vergrößerung 17,9x. Die maximale Abbildungstiefe beträgt 5 mm und wird durch den physischen Abstand der beiden Objektive begrenzt. Die Objektive werden von einer Mechanik gehalten, die über manuelle Feineinstellungen zur Ausrichtung der beiden Objektive verfügt (SPIM-DUAL-K2, ASI).

Die Anregungs- und Detektionspfade werden auf einem polychromatischen Spiegel (ZT488/543/635rpc-UF2, Chroma) und einem motorisierten Filterrad (FW) (FW-1000-8, ASI) mit drei Emissionsfiltern (ET519/26 m; ET576) kombiniert /31 m; ET655lp, Chroma), was eine dreifarbige Bildgebung ermöglicht. In dieser Arbeit war das Ziel eine effiziente einfarbige Abbildung über sehr große Volumina und es wurde nur das mittlere Farbband mit dem Emissionsfilter ET576/31 m verwendet. Die gefilterte Fluoreszenz wird durch eine Tubuslinse (C60-TUBE-B, ASI; f = 200 mm) auf eine 2048 × 2048 Pixel große wissenschaftliche Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (sCMOS)-Kamera (ORCA-Flash4.0 V3, Hamamatsu) fokussiert. . Die Tubuslinse bietet eine Nyquist-Abtastung von 0,3625 μm/Pixel bei einem RI von 1,56, mit einem horizontalen Sichtfeld von 0,74 mm über die 2048 Pixel der Kamera.

Bildstreifen werden mit einer Kombination aus Tischscannen (d. h. die Probe wird mit dem XY-Tisch durch ein stationäres Lichtblatt bewegt, ergänzende Abbildung 4) und seitlicher/vertikaler Kachelung mit einem motorisierten XY-Tisch (MS-8000, scanoptimiert) gesammelt ) und motorisierte Z-Aktuatoren (Focusing Translation Platform (FTP-2050), ASI). Die Aufnahmegeschwindigkeit beträgt >108 Voxel/Sek. bei einer Belichtungszeit von 10 ms. Die Stage-Scanning-Firmware sendet einen internen (Time-to-Live) TTL-Trigger aus, der die reproduzierbare Startpositionierung (<1 μm) jedes Bildstreifens gewährleistet. Ein ASI-Tiger-Controller (TG-1000) enthält Steuerelektronik für die motorisierten Tische, einen MEMS-Spiegel, ein abstimmbares Objektiv sowie Kamera- und Laserauslöser. Es synchronisiert alle diese Elemente mit einer Präzision im Subms-Bereich während jedes Bildstreifens basierend auf dem Scan-Trigger in der Anfangsphase.

Das Mikroskop wird durch µManager 1.4.22 gesteuert, eine kostenlose Open-Source-Mikroskopsteuerungssoftware32. Das ASI diSPIM-Plug-in im µManager wird sowohl zum Ausrichten des Mikroskops als auch zum Einrichten und Durchführen von Aufnahmen verwendet. Das Bühnensteuerungs-Plugin wird verwendet, um statische ETL-Anpassungen an beiden ETLs (V, links; W, rechts) vorzunehmen.

Für einige Anwendungen reichen die 3D-Informationen einer einzelnen Ansicht oder eines Stapels aus. Für die hier angestrebte Abbildung großer Proben wird jedoch eine umfangreiche Kachelung entlang der yz-Mosaikaufnahmen verwendet, normalerweise in Kombination mit langen Bildstapeln, die in x-Richtung gescannt werden (ergänzende Abbildung 4). Als Dual-View-System bietet das ct-dSPIM den weiteren Vorteil, dass die Rolle der beiden Objektive vertauscht werden kann, um einen weiteren Stapel aus einer senkrechten Richtung zu sammeln, was auf Kosten der doppelten Bildgebungszeit geht. Da der Schwerpunkt hier jedoch auf der schnellen Bildgebung großer Volumina mit einer Auflösung von > 1 μm liegt, wird der Dual-View-Bildgebungsmodus in dieser Arbeit nicht verwendet.

Die MASH-NR-markierten menschlichen Gehirn- und Prostatagewebeproben wurden mit der 552-nm-Laserlinie bei 1 mW (OBIS) und einer durchgehenden Belichtungszeit von 10 ms abgebildet. Für beide Proben wurde ein Übersichtsscan der gesamten Gewebeschnitte im Kubikzentimeterbereich mit einer isotropen Abtastauflösung von 16,4 µm durchgeführt (was wir als Mosaik-16-Aufnahme bezeichnen). Zusätzlich haben wir für die menschliche Gehirnprobe einen Multiskalen-Scan durchgeführt, der aus Folgendem besteht: (a) einem Mosaik-16-Übersichtsscan des gesamten Gewebeschnitts, (b) einer Aufnahme für einen großen ausgewählten FoV (~15 × 17 × 3 mm) mit 4,1 µm isotroper Abtastauflösung (Mosaik 4 genannt) und (c) eine Erfassung für ein kleineres FoV (~5 × 10 × 3 mm) mit hoher Auflösung (0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm) für einen bestimmten Interessenbereich ( wird als Mosaik 0,5 bezeichnet). Die Imaging-Geschwindigkeit ist unterschiedlich, je nachdem, welches Mosaik-Imaging eingesetzt wird. Für schnelle Mosaik-16-Übersichtsscans liegt die Bildgebungsgeschwindigkeit bei 1,7 h/1 cm3 und für ROI-Scans von Mosaik 4 und Mosaik 0,5 mit höherer Auflösung liegt die Bildgebungsgeschwindigkeit bei 5 h/1 cm3 bzw. 15,8 h/1 cm3 (Tabelle 2).

Während die Scans von „Mosaic 16“ 3D-Datensätze eines gesamten Gewebeblocks mit einer isotropen mesoskopischen Abtastauflösung von 16,4 µm liefern, zeigen die Scans „Mosaic 4“ und „Mosaic 0.5“ interessierende Bereiche mit einer isotropen Abtastauflösung von 4,1 µm bzw. fast 1 µm. Die Schnittschritte bei der Aufnahme betragen 11,60 µm für Mosaik 16 und 2,90 µm für Mosaik 4, was aufgrund der √2-Skalierung zu isotropen Abtastauflösungen nach der Entzerrung führt (ergänzende Abbildung 4). Die Rohdatensätze wurden wie folgt weiter heruntergerechnet: Für Mosaik 16 16× in der Ebene (32 × 45 Pixel) und für Mosaik 4 4× (128 × 186 Pixel), um der Schrittgröße des Mikroskops zu entsprechen und eine Isotropie zu erzeugen Datensatz von 16,4 µm (Mosaic 16) oder 4,1 µm (Mosaic 4) isotrop nach Entzerrung. Für das Mosaik 0,5 betrug der Schnittschritt 0,363 µm und es wurde ein Downsampling in der Ebene von 2 × 2 durchgeführt. Mit diesen Parametern werden die Mosaik-16-Scans mit der höchstmöglichen Geschwindigkeit erfasst, die nur durch die maximale Scangeschwindigkeit der Bühne begrenzt ist. Die Mosaik-4-Scans werden in der Nähe einer Nyquist-Abtastung mit einer axialen optischen Auflösung von ~8 µm (d. h. der theoretischen Lichtschichtdicke) erfasst, und die Mosiac-0,5-Scans werden in der Nähe einer Nyquist-Abtastung mit einer lateralen optischen Auflösung in der Ebene von ~1 µm erfasst Auflösung. Bei der Erfassung von Bildvolumina mit dem ct-dSPIM, bei dem die Probe mittels Bühnenscannen durch die Bildebene (d. h. das Lichtblatt) bewegt wird, entsprechen die Achsen nicht den orthogonalen XYZ-Koordinaten. Stattdessen befindet sich die Z-Achse der Kamera in einem Winkel von 45° zur Scanrichtung des Tisches (ergänzende Abbildung 4). Daher führt die stufenweise gescannte Bildaufnahme zu einer verzerrten parallelepipeden Stapelform mit nicht orthogonalen Achsen, die bei Betrachtung im orthogonalen Achsensystem verzerrt wird. Eine Entzerrungsoperation wandelt den verzerrten Parallelepipedstapel in einen rechteckigen Stapel mit den traditionellen orthogonalen Achsen um (ergänzende Abbildung 1b). Die in den Abbildungen dieser Arbeit verwendete Achsenbeschriftung ist die Achsenbeschriftung des Bildbetrachters mit der x-Achse entlang der 3–5 mm dicken Gewebedicke und der z-Achse entlang der Scanrichtung der Bildstapel (ergänzende Abbildung 4c).

Das Downsampling erfolgt durch Skalieren der Bilder auf die endgültige Pixelgröße mit der Skalierungsfunktion in Fiji33. Durch das Downsampling wurde die Größe des Datensatzes für einen Mosaik-16-Scan eines gesamten Okzipitallappenschnitts auf etwa 3–4 GB reduziert. Diese heruntergesampelten Daten wurden mit dem FIJI PlugIn BigSticher34 weiterverarbeitet. Zuerst wurden die Daten mit der Option „(de)skewing“ entzerrt und dann ohne weiteres Downsampling mit der Option „Phasenkorrelation“ zusammengefügt. Die zusammengefügten Daten wurden dann als 16-Bit-TIF-Datei erneut gespeichert. In einigen Fällen wurde der endgültige isotrope, fusionierte Datensatz zur Visualisierung in FIJI entlang der YZ-Richtung neu geschnitten, um eine koronale Ansicht der Proben zu ermöglichen. Die gesamte Downsampling-Zeit für einen Mosaik-16- und einen Mosaik-4-Scan beträgt 12 Stunden auf einer PC-Workstation mit 32 RAM, Intel(R) Xeon(R) CPU E5-1650 v3 bei 3,50 GHz und 10 Festplattenspeicher. Darüber hinaus ist für ein Mosaik 0,5 kein Downsampling erforderlich. Die gesamte Stitching-Zeit mit dem BigStitcher PlugIn beträgt etwa 1 Stunde für den Mosaik-16-Scan und 2 Stunden für den Mosaik-4-Scan. Für das Mosaik 0,5 werden in BigStitcher ca. 3 Tage Stickzeit benötigt.

Die 3D-Visualisierung und Zellzählung von Volumenstapeln wurden mit der Software arivis Vision4D (Version 3.4.0) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde ein einzelner Stapel aus einer Mosaik-0,5-Aufnahme im menschlichen Gehirnbereich V2 verwendet, der alle kortikalen Schichten abdeckt. Der entzerrte, zusammengefügte und neu geschnittene Stapel wurde mit einer automatisierten Pipeline in Vision4D verarbeitet. Die Rohdaten wurden zunächst mit der Morphologiefilteroption gefiltert und die Zellen wurden mit der Segmentierungsmethode „Blob Finder“ segmentiert. Um die Zellzahlen pro Schicht abzuleiten, wurden die kortikalen Schichten und die weiße Substanz manuell mit dem Polygonauswahlwerkzeug über das gesamte Volumen segmentiert. Schicht III wurde in zwei Unterschichten IIIa und IIIb unterteilt, basierend auf bemerkenswerten Dichte- und Zellgrößenunterschieden (z. B. erscheinen große Pyramidenneuronen in Schicht IIIb). Anschließend wurde eine zweite Pipeline angewendet, um Kompartimente basierend auf den manuell segmentierten Schichten zu erstellen, die nur die segmentierten Objekte aus der Zellsegmentierungspipeline umfassten, die vollständig innerhalb der Schichtensegmentgrenzen enthalten waren und eine Größe von mehr als 125 µm3 hatten. Aus diesen unterteilten Segmenten abgeleitete Merkmale wurden dann in itemised.csv-Tabellen extrahiert.

Um die isotrope Auflösung der Datensätze „Mosaik 16“ und „Mosaik 4“ mit niedrigerer Auflösung zu visualisieren, wurden in FIJI33 orthogonale Ansichten erstellt, indem die Daten neu segmentiert und MIPs für jede Achse erstellt wurden. Videos wurden sowohl mit FIJI als auch mit Vision4D erstellt. Die Figuren wurden mit Biorender (https://www.biorender.com) erstellt.

Um die automatisierte Zellsegmentierungspipeline zu validieren, wurde eine manuelle Zellzählung für denselben Datensatz durchgeführt. Das Datenvolumen wurde in der Vision4D-Umgebung mit einem maßgeschneiderten Python-Skript in ein 100 × 100 µm großes Raster aufgeteilt, das sich über die gesamte Tiefe des Stapels erstreckt. Anschließend wurden 10 Ebenen und 5 verschiedene ROIs pro Ebene pseudozufällig ausgewählt, wobei die „Randi“-Funktion in MATLAB (R2015b, MathWorks Inc.) als Zufallszahlengenerator verwendet wurde. Die Zellen wurden in jedem ROI manuell gezählt, wobei nur Zellen berücksichtigt wurden, die entweder vollständig innerhalb der ROI-Grenzen lagen oder sich mit dem linken und/oder unteren Rand des 100 × 100 µm-Kastens kreuzten (ergänzende Abbildung 3A). Violindiagramme der Datenverteilung wurden in MATLAB mit dem Skript von Bechtold (2016; https://doi.org/10.5281/zenodo.4559847) für die manuell gezählten Zellen, die ungefilterten „Blob Finder“-Segmentierungsergebnisse sowie erstellt Die gefilterten Ergebnisse enthalten nur Segmente größer als 125 µm3 („Zellkörper gefiltert“; ergänzende Abbildung 5b).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Rohdaten der Mikroskopie werden auf einem lokalen Fakultätsserver gespeichert. Numerische Quelldaten für die Validierung und Schrumpfungsmessungen des menschlichen Gehirns sind in den Zusatzdaten 1 und 2 aufgeführt. Alle anderen Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Maurizio Abbate (Arivis AG) für die freundliche Bereitstellung des maßgeschneiderten Python-Skripts für die Vision4D-Umgebung zur Aufteilung des Datenvolumens in ein 100 × 100 µm großes Raster. Darüber hinaus danken wir Dr. Jon Daniels (Applied Scientific Instrumentation) für die technische Beratung und die Bereitstellung von Abb. 9 mit dem optischen Layout des ct-dSPIM. Dieses Projekt wurde teilweise durch den Talent Program Veni AES 2020 Grant der niederländischen Wissenschaftsstiftung (NWO) finanziert, der an Dr. Schueth vergeben wurde (Aktenzeichen: 18139). Prof. Roebroeck wurde durch einen ERC Starting Grant (MULTICONNECT, #639938) und einen VIDI Grant der niederländischen Wissenschaftsstiftung (NWO) (#14637) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Anna Schueth, Sven Hildebrand.

Abteilung für kognitive Neurowissenschaften, Fakultät für Psychologie und Neurowissenschaften, Universität Maastricht (UM), Maastricht, Niederlande

Anna Schueth, Sven Hildebrand, Shubharthi Sengupta, Annemarie Kiessling, Michael Capalbo & Alard Roebroeck

Abteilung für Pathologie, Maastricht University Medical Center (MUMC+), Maastricht, Niederlande

Iryna Samarska & Axel zur Hausen

Abteilung für Anatomie, Universität Maastricht (UM), Maastricht, Niederlande

Andreas Herrler

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AS führte alle Lichtblattmikroskopie-Experimente durch, betrieb das ct-dSPIM-Mikroskop mit Wartung und arbeitete an der gemeinsamen Entwicklung des Prototyps (zusammen mit Applied Scientific Instrumentation, ASI, Eugen, Oregon, USA); SH führte die Probenvorbereitung und optische Reinigung durch und entwickelte das FFPE-MASH-Protokoll. SH und AS erstellten die Zahlen und Analysen; SS leistete Unterstützung beim 3D-Druck der Bildgebungskammern; AK leistete Laborunterstützung (optische Reinigung und Bilderfassung); AH stellte das menschliche Gehirngewebe und Fachwissen zur menschlichen Anatomie zur Verfügung; IS und AzH waren die Pathologen in diesem Projekt und stellten Prostatakrebsmaterial und Fachwissen zu Prostatakrebs zur Verfügung und führten die Gleason-Score-Bewertung des Patientenmaterials durch; AR entwarf die Studie, die gemeinsame Entwicklung des ct-dSPIM-Mikroskop-Prototyps und übernahm die Aufsicht; MC übernahm die Co-Supervision; AS, SH, AR und MC haben den Artikel geschrieben. Alle Autoren haben den Artikel gelesen, kommentiert und/oder bearbeitet.

Korrespondenz mit Anna Schueth oder Alard Roebroeck.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Ludovico Silvestri und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Chao Zhou und Karli Montague-Cardoso.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schueth, A., Hildebrand, S., Samarska, I. et al. Effiziente 3D-Lichtblatt-Bildgebung sehr großer, optisch gereinigter menschlicher Gehirn- und Prostata-Gewebeproben. Commun Biol 6, 170 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04536-4

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Eingegangen: 26. Juli 2022

Angenommen: 26. Januar 2023

Veröffentlicht: 13. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04536-4

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