Parallele Wiederherstellung der Zugänglichkeit von Chromatin und der Genexpressionsdynamik aus gefrorenen menschlichen regulatorischen T-Zellen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 5506 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Epigenetische Merkmale wie die Zugänglichkeit der DNA bestimmen die Transkriptionsregulation auf zelltyp- und zellzustandsspezifische Weise, und die Abbildung dieser Aspekte in Bezug auf Gesundheit und Krankheit in klinisch relevantem Material öffnet die Tür zu neuen mechanistischen Erkenntnissen und neuen Therapiezielen. Der Assay für Transposase Accessible Chromatin Sequencing (ATAC-seq) ermöglicht die Profilierung der Chromatinzugänglichkeit bei geringem Zellinput und macht ihn so für seltene Zellpopulationen wie regulatorische T-Zellen (Treg) nachvollziehbar. Über die Kompatibilität des Assays mit kryokonservierten seltenen Zellpopulationen ist jedoch wenig bekannt. Hier demonstrieren wir die Robustheit eines ATAC-seq-Protokolls, das primäre Treg-Zellen, die aus frischen oder kryokonservierten PBMC-Proben gewonnen wurden, im Steady-State und als Reaktion auf Stimulation vergleicht. Wir erweitern diese Methode, um die Machbarkeit einer gleichzeitigen Quantifizierung der Zugänglichkeit von Chromatin und des Transkriptoms anhand eines einzelnen Aliquots von 50.000 kryokonservierten Treg-Zellen zu untersuchen. Die parallele Profilierung der Zugänglichkeit von Chromatin und der Genexpression innerhalb desselben Zellpools kontrolliert die zelluläre Heterogenität und ist besonders vorteilhaft, wenn sie durch begrenztes Inputmaterial eingeschränkt wird. Insgesamt beobachteten wir eine hohe Korrelation der Zugänglichkeitsmuster und der Transkriptionsfaktordynamik zwischen frischen und kryokonservierten Proben. Darüber hinaus wurden sehr ähnliche transkriptomische Profile von ganzen Zellen und den aus ATAC-seq-Reaktionen gewonnenen Überständen erhalten. Wir heben die Machbarkeit der Anwendung dieser Techniken hervor, um die epigenomische Landschaft von Zellen zu profilieren, die aus Kryokonservierungs-Biorepositorien gewonnen wurden.

Die Genexpression wird durch die Bindung von Transkriptionsfaktoren (TFs) an die proximalen Promotoren und distalen regulatorischen Elemente wie Enhancer reguliert. Die Chromatinstruktur hat einen großen Einfluss auf die Genexpression, indem sie den Zugang von TFs zu Bindungsstellen in diesen Enhancern und Promotoren kontrolliert1. Lokalisierte Muster der epigenetischen Modifikation des Chromatins, wie Histonmodifikation, DNA-Methylierung und Nukleosomen-Remodellierung, korrelieren mit der Enhancer-Aktivität, der TF-Bindung und der Regulierung der Transkription. Die Zugänglichkeit von Chromatin hängt davon ab, inwieweit Proteine in der Lage sind, physisch mit Chromatin zu interagieren, und wird stark von epigenetischen Modifikationen, der Positionierung von Nukleosomen und Chromatin-bindenden Proteinen beeinflusst, die den Zugang zur DNA2 einschränken. Zugänglicheres oder offeneres Chromatin ist mit transkriptionell aktiven Regionen und regulatorischen Elementen verbunden, während geschlossenes Chromatin mit stillen oder unterdrückten Regionen verbunden ist. Obwohl zugängliche DNA beispielsweise etwa 2–3 % des Genoms ausmacht, erfasst sie mehr als 90 % der von TFs besetzten Regionen, die im ENCODE-Projekt2,3,4 untersucht wurden. Die Zugänglichkeit von Chromatin wird normalerweise experimentell durch die Anfälligkeit von Chromatin für enzymatische Methylierung oder Spaltung bestimmt. Herkömmliche Chromatin-Profiling-Methoden wie DNase-seq erfordern jedoch Millionen von Zellen als Eingabeanforderung und erfordern einen komplexen Arbeitsablauf bei der Bibliotheksvorbereitung. Der Assay von Transposase-zugänglichem Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) ist ein relativ neuer genomweiter Ansatz, der gleichzeitig die Chromatinstruktur (Zugänglichkeit und Nukleosomenpositionierung) und, was wichtig ist, die TF-Bindung mit hoher Auflösung und geringerem Eingabeaufwand als andere Techniken untersucht5,6 . Die Entwicklung von ATAC-seq hat es ermöglicht, die Zugänglichkeit von Chromatin mit einer viel geringeren Anzahl von Zellen zu quantifizieren, wodurch es für den klinischen Einsatz und seltene Zellpopulationen von Interesse geeignet ist. Die Messung der Chromatinzugänglichkeit bei Einzelzellauflösung ist auch mit der Entwicklung von Einzelzell-ATAC-Sequenzierungsstrategien (scATAC-seq) möglich geworden7,8,9. In ATAC-seq schneidet und ligiert die Tn5-Transposase, die mit Sequenzierungsadaptern der nächsten Generation vorbeladen ist, gleichzeitig Sequenzierungsadapter an zugänglichen offenen Chromatinregionen5,6. Die zwischen den Adaptern eingefangenen Fragmente können dann durch PCR amplifiziert und einer Hochdurchsatzsequenzierung unterzogen werden5,6.

Epigenetische Mechanismen steuern einen wichtigen Aspekt der Genexpressionsmaschinerie, der für die Zellentwicklung und -differenzierung entscheidend ist10,11. Epigenetische Störungen und veränderte Genexpression wurden bei vielen Autoimmunerkrankungen wie systemischem Lupus erythematodes (SLE), entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), rheumatoider Arthritis (RA) und Multipler Sklerose (MS) berichtet12. Die Profilierung der Zugänglichkeit von Chromatin in Krankheitskohorten wird unser Verständnis der Dysregulation der Epigenetik bei Autoimmunerkrankungen verbessern und die Entwicklung translationaler Forschung und personalisierter Medizin durch die Identifizierung krankheitsrelevanter epigenetischer Signaturen erheblich unterstützen. Obwohl das Protokoll häufig auf frisch verarbeitete Proben angewendet wird, haben nur eine Reihe von Studien die Auswirkungen der Kryokonservierung auf die Chromatinstruktur und die Genexpression untersucht13,14,15,16,17,18,19, bisher wurde keine an primärem menschlichem T. durchgeführt Zelluntergruppen, einschließlich kryokonservierter menschlicher FOXP3+ Regulatory T (Treg)-Zellen. FOXP3+ Regulatory T (Treg)-Zellen sind eine seltene Untergruppe von Lymphozyten, die die Immuntoleranz aufrechterhalten und unangemessene Immunreaktionen verhindern20,21,22,23. Veränderungen in der Häufigkeit und Funktion von Treg-Zellen werden mit einer Vielzahl von Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Typ-1-Diabetes (T1D)24, SLE25, IBD26 und RA27.

Die Kryokonservierung intakter lebender Zellen und Gewebe ist eine gängige Praxis in Anwendungen der Grundlagen- und klinischen Forschung und ermöglicht die Verfolgung von Patienten oder Proben über alle Symptomzustände hinweg und über einen längeren Zeitraum hinweg. Bei großen Kohortenstudien, bei denen große Probenzahlen oder viele Behandlungen oder Zeitpunkte eine Genomik an frischen Proben ausschließen, ist die Kryokonservierung von entscheidender Bedeutung. Solche Biorepositorien leisten zunehmend einen wesentlichen Beitrag zur Verbesserung unseres Verständnisses, der Diagnose, Prävention und Heilung komplexer Krankheiten28,29. In den letzten Jahrzehnten wurden erhebliche Verbesserungen bei der Sammlung und Lagerung menschlicher biologischer Proben beobachtet29, die die Identifizierung von Krankheitsbiomarkern als Grundlage für Diagnose und Prognose sowie für die Arzneimittelentwicklung ermöglichen. Biobanking wird zunehmend in vielen Bereichen eingesetzt, darunter auch in der Autoimmunmedizin. Bei der Anwendung dieser hochmodernen genomischen Ansätze auf Biobankmaterial muss daher unbedingt sichergestellt werden, dass gewonnene Zellen den Phänotyp der frischen Zellen genau wiedergeben, um eine genaue Interpretation und klinische Übersetzung zu ermöglichen. Allerdings wird in Berichten die Wirkung der Kryokonservierung auf die Epigenetik der gewonnenen Zellen untersucht Zellen sind begrenzt13,14.

Damit an diesen Biobanken eine qualitativ hochwertige Multi-Omics-Analyse durchgeführt werden kann, ist nicht nur die Lebensfähigkeit und Erholung nach dem Auftauen eine wichtige Messgröße, sondern die gewonnenen Proben sollten auch den physiologischen und biochemischen Zustand ihres Zustands vor dem Einfrieren genau widerspiegeln. Um dies zu testen, haben wir Biobanking-Standards übernommen, die in der ENDIA-Studie (Environmental Determinants of Islet Autoimmunity)30,31 für die Kryokonservierung von PBMCs von gesunden erwachsenen Probanden festgelegt wurden. Ziel unserer Studie war es, die globale Chromatinzugänglichkeit von kryokonservierten, seltenen Immunzellpopulationen zu bewerten und die Machbarkeit einer parallelen Quantifizierung der Chromatinzugänglichkeit und des Transkriptoms anhand einer einzigen Reaktion von 50.000 Zellen zu testen. Insbesondere fragten wir, ob das Einfrieren vor der Kernisolierung die Kernintegrität beeinträchtigt und die Chromatinstruktur in FOXP3+ Regulatory T (Treg)-Zellen verändert.

Da Immunzellen auf Umweltreize reagieren müssen, verfügen sie über hochkoordinierte Transkriptionsprogramme, die die Induktion von Immunantwortgenen mit speziellen Funktionen für eine angemessene Immunantwort gegen eindringende Krankheitserreger und Krebs vorantreiben. Eine Fehlregulation dieser Transkriptionsprogramme ist hingegen mit Autoimmunität verbunden. Die Empfindlichkeit und Reaktionsfähigkeit von Zellen gegenüber externen Reizen bestimmen entscheidend das Ausmaß der Zugänglichkeit des Chromatins und der Veränderungen der Genexpression, und Störungen hiervon können der Auslöser von Krankheiten sein. Um dies im Zusammenhang mit Immunzellen anzuwenden, haben wir Omni ATAC-seq32 übernommen, da es nachweislich eine erhebliche Verbesserung der Datenqualität bei mehreren Anwendungen, einschließlich gefrorener Materialien, liefert. ATAC-seq wurde an Treg-Zellen durchgeführt, die aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) isoliert wurden, die von gesunden erwachsenen Probanden gewonnen, frisch verarbeitet oder gemäß veröffentlichten Biobankprotokollen kryogen gelagert und aufgetaut wurden31. Wir haben die Zugänglichkeit von Chromatin und die TF-Belegung in Treg-Zellen im Steady State und als Reaktion auf Stimulation untersucht. Wir haben gezeigt, dass die Isolierung intakter Kerne sowohl aus frisch verarbeiteten als auch aus aufgetauten Proben zu Chromatin-Zugänglichkeitsmustern führte, die zwischen den Gruppen praktisch nicht zu unterscheiden waren. Darüber hinaus beschreiben wir einen Arbeitsablauf, der ATAC-seq und RNA-seq einbezieht, um die Zugänglichkeit von Chromatin und die Genexpression gleichzeitig in 50.000 Zellen zu messen und so Rückschlüsse auf die regulatorische Assoziation zwischen den beiden Systemen aus demselben Zellpool zu ermöglichen. Im ATAC-seq-Workflow werden nach einer sanften Zelllyse die Kern- und Zytoplasmasfraktionen durch Zentrifugation getrennt. Der Zellkern wird der ATAC-Sequenz unterzogen, während die überstehende Fraktion, die die zytoplasmatische Fraktion enthält, der RNA-Sequenz unterzogen wird. Wir beobachteten eine hohe Übereinstimmung im transkriptomischen Profil zwischen aus ganzen Zellen gereinigter RNA und ATAC-seq-Überstandsfraktionen aus kryokonservierten Proben, was darauf hinweist, dass die parallele Profilierung der Zugänglichkeit von Chromatin und der Genexpression ein gültiger Ansatz in Experimenten ist, die durch Eingabematerial eingeschränkt sind. Zusammenfassend zeigen wir, dass eine kombinierte ATAC-seq- und RNA-seq-Analyse auf gepoolte Biobank-Zellen angewendet werden kann, und die Ergebnisse zeigen eine starke Korrelation mit denselben Tests, die an frisch isolierten Zellen durchgeführt wurden, unabhängig davon, ob sie ruhen oder aktiviert sind. Dies gibt Sicherheit bei der Anwendung dieser Ansätze auf biobankierte Immunzellen aus klinischen Kohorten.

Um zu testen, ob gefrorenes Biobankmaterial frisches Material originalgetreu widerspiegelt, wurde jede von einem gesunden erwachsenen Probanden gewonnene PBMC-Probe in zwei Hälften geteilt, eine wurde sofort verarbeitet und die andere Hälfte wurde kryokonserviert und vor dem Auftauen zur Zellisolierung und ATAC-seq- und RNA-Analyse gelagert. Folgeexperimente. Die kryogene Lagerung hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen, die Erholung oder die Häufigkeit von CD4+ Tconv- und Treg-Zellen (Abb. 1a – d). Darüber hinaus bewahrte der Gefrierprozess die T-Zell-Komplexität, wie durch die Durchflusszytometrie-Analyse (Abb. 1d) gezeigt wurde, sowie die Erhaltung von T-Zell-Untergruppen, die durch t-verteilte stochastische Nachbareinbettungsanalyse (t-SNE) identifiziert wurden (Abb. 1e, f). und ergänzende Abbildung 1). Gut ausgebildete Zellpopulationscluster wurden sowohl in frischen als auch in aufgetauten CD4 + T-Zellen identifiziert (Abb. 1c) und umfassen Populationen, die T-Zellsignaturen wie FOXP3, CD25, CD127, CD45RA und CCR10 exprimieren (ergänzende Abb. 1). Alle diese Daten zeigen, dass aus aufgetautem Material isolierte T-Zellen lebensfähig sind und Zelloberflächenmarker aufweisen, die denen der frisch verarbeiteten Zellen ähneln.

Die Komplexität gefrorener Proben entspricht der Komplexität frischer Proben. Lebensfähigkeit (a) und absolute Zellzahl (b) der frischen und aufgetauten PBMC-Proben. (c) Wiederherstellung (%) der Wiederherstellung lebender PBMC nach dem Auftauen. Die Lebensfähigkeit der Zellen und die Wiederfindung von PBMC-Proben wurden mithilfe des Trypanblau-Farbstoff-Ausschlusstests bestimmt. (d) Durchflusszytometrisches Profil einer repräsentativen frischen und aufgetauten PBMC-Probe und die Gating-Strategie zur Isolierung konventioneller T-Zellen (Tconv) und regulatorischer T-Zellen (Treg). (e–f) Farbpunktdiagramme, die Ereignisse von frischen (e) und aufgetauten (f) CD4-positiven Zellen zeigen, die zur t-SNE-Verteilung (t-verteilte stochastische Nachbareinbettung) mit manueller Clusterbildung beitragen.

Um zu fragen, ob der Kryokonservierungsprozess die Chromatin-Zugänglichkeitslandschaft von regulatorischen T-Zellen (Treg) verändert, führten wir Omni ATAC-seq an CD4+ CD25hi CD127lo Treg-Zellen aus PBMC durch, die von gesunden erwachsenen Probanden gewonnen wurden. PBMC-Proben wurden aufgeteilt und entweder sofort verarbeitet oder vor der CD4+-Treg-Isolierung kryogen gelagert (ergänzende Abbildung 2). Wir haben Omni ATAC-seq übernommen, da es bekanntermaßen eine hohe Lesekartierungsqualität und Bibliothekskomplexität liefert33 und wir haben dies durch unsere eigene Analyse der Peakidentifizierung in Modelldatensätzen bestätigt (ergänzende Abbildung 11). Um die Reaktionsfähigkeit des wiederhergestellten Treg weiter zu untersuchen, wurden isolierte Treg-Zellen entweder unbehandelt gelassen (ruhend) oder mit Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28 für 48 Stunden vor Omni ATAC-seq stimuliert (Ergänzungstabelle 1 für die Sequenzierungsausgabe). Wir identifizierten durchschnittlich 41.587 reproduzierbare Peaks für frische (ruhende) Proben, 45.534 reproduzierbare Peaks für aufgetaute (ruhende) Proben, 88.631 reproduzierbare Peaks für frische (stimulierte) Proben und 95.670 reproduzierbare Peaks für aufgetaute (stimulierte) Proben (ergänzende Abbildung 5a). . Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Anzahl reproduzierbarer Peaks zwischen Spenderpaaren sowohl in frischen als auch in kryokonservierten Gruppen (ergänzende Abbildung 5b). Die Fragmentgrößenverteilung der amplifizierten ATAC-seq-Bibliotheken, die aus frischen und aufgetauten Treg-Zellen generiert wurden, zeigte ein klares, charakteristisches nukleosomales Leitermuster mit einer Periodizität von 200 bp, entsprechend DNA-Fragmenten aus nukleosomenfreien Regionen (NFRs) oder durch Ganzzahl geschützten Regionen Vielfache von phasengesteuerten Nukleosomen (Abb. 2a, ergänzende Abb. 3 und 4), was auf hochwertige ATAC-seq-Bibliotheken hinweist. Die aufgetauten Treg-Zellen zeigen ein ähnlich strukturiertes ATAC-seq-Signal um Nukleosomen wie die frischen Proben (ergänzende Abbildung 4), wobei sowohl frische als auch aufgetaute Treg-ATAC-seq-Profile ein charakteristisches V-förmiges Muster zeigen, wobei die Spitze das kürzestmögliche Fragment darstellt ist durch ein Nukleosom (~ 117 bp) geschützt. Die am stärksten angereicherte Position im V-Diagramm entspricht Fragmenten von 143 bp, die an der Nukleosomen-Dyade zentriert sind, was der Länge der DNA entspricht, die von einem kanonischen Nukleosom gebunden wird. Dieses Muster der Organisation der Chromatinarchitektur stimmt mit denen von Schep et al.34 überein. Ein auffälligeres nukleosomales Periodizitätsmuster wurde bei der Stimulation sowohl in frischen als auch in aufgetauten Treg-Zellen im Vergleich zu ihren ruhenden Gegenstücken beobachtet (ergänzende Abbildung 4). Dies deutet darauf hin, dass die Stimulation zu erheblichen Veränderungen beim Umbau der Nukleosomen und der Zugänglichkeit des Chromatins führt. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das Einfrieren die Verschiebung und Phasenlage der Nukleosomen entlang der DNA-Sequenz nicht störte.

Die Qualität von ATAC-seq aus aufgetauten Treg-Zellen entspricht weitgehend der Qualität frischer Zellen. (a) Die Insertgrößenverteilung frischer und aufgetauter Treg ATAC-seq-Bibliotheken. (b) Vollständige Bibliothekskomplexität und extrapolierte Ertragskurve frischer und aufgetauter ATAC-seq-Bibliotheken. Komplexitätsmessungen werden gegen die höchste Komplexität aufgetragen (100 % eindeutig zugeordnete Lesevorgänge). (c) Verteilung des ATAC-seq-Signals an Transkriptionsstartstellen (TSS) von ± 1,5 kb. Die Signalabdeckung wird aus Lesevorgängen pro Million zugeordneter Lesevorgänge für jede Probe berechnet. (d) Prozentsatz der Lesevorgänge, die dem mitochondrialen Genom zugeordnet sind. Eine tiefere Farbe wird verwendet, um den wünschenswertesten Wert der Statistik und des Bereichs darzustellen, der einer linearen Skala folgt, die bei 0 (schwarz) beginnt und beim Maximalwert (gelb) endet. Alle Werte wurden aus der vollen Tiefe der ausgerichteten Lesevorgänge ermittelt. Die statistische Signifikanz des Unterschieds zwischen frischen und aufgetauten Proben wird durch den Paired Student's t-Test berechnet. Die in ac gezeigten Daten sind repräsentativ für Sequenzierungsablesungen, die von drei Spendern gepoolt wurden.

Die frischen und aufgetauten Bibliotheken zeigten eine vergleichbare molekulare Komplexität (Abb. 2b) und eine Anreicherung der Transkriptionsstartstellen (TSSs) (Abb. 2c), ein Schlüsselmaß für das Signal-Rausch-Verhältnis, wie von ENCODE4 empfohlen, sowohl im Ruhezustand als auch im stimulierten Zustand . Es wurde kein signifikanter Unterschied im Anteil der mitochondrialen Lesevorgänge zwischen den ATAC-seq-Bibliotheken beobachtet, die aus frischen und aufgetauten Treg-Zellen generiert wurden (Abb. 2d). Wir beobachteten auch keinen signifikanten Unterschied im Anteil der kartierten Lesevorgänge in den ATAC-seq-Peakregionen (FRiP) (Abb. 3a) oder ihrer genomischen Verteilung (Abb. 3b) in frisch verarbeiteten Proben im Vergleich zu gefrorenen Proben, was darauf hindeutet, dass die Kryokonservierung die Ergebnisse nicht verändert hat Transpositionseffizienz an zugänglichen Chromatinregionen. Ein entsprechender Anstieg der Messwerte pro Peak nach der Zellstimulation deutete darauf hin, dass die Kryokonservierung die Veränderungen der Chromatinorganisation bei Zellaktivierung nicht wesentlich beeinflusste (Abb. 3a und ergänzende Abb. 5a). Darüber hinaus zeigten die frischen und aufgetauten Proben eine hohe Korrelation der Spitzensignale, was darauf hindeutet, dass das Einfrieren und Auftauen weder in ruhenden noch in stimulierten Zellen einen nennenswerten Einfluss auf die zugängliche Chromatinlandschaft hatte (Abb. 3c – e, ergänzende Abb. 6). Es wurde auch festgestellt, dass die Chromatin-Zugänglichkeitslandschaft an Orten, die für die Treg-Funktion und -Entwicklung unverzichtbar sind, wie IL2RA (Interleukin-2-Rezeptor-Untereinheit Alpha) und FOXP3 (Forkhead-Box P3), gut erhalten ist (Abb. 3f, g). Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass die Kryokonservierung die zellulären Reaktionen, die Chromatinlandschaft und die epigenetischen Signaturen nicht stört und das Protokoll auf kryokonservierte primäre menschliche Treg-Zellen angewendet werden kann.

Die Zugänglichkeit von Chromatin wird durch Kryokonservierung aufrechterhalten. (a) Der Anteil der Lesevorgänge in Peaks für frische und aufgetaute Treg ATAC-seq-Bibliotheken. Die statistische Signifikanz des Unterschieds zwischen frischen und aufgetauten Proben wird durch den Paired Student's t-Test berechnet. (b) Verteilung der ATAC-seq-Peaks über verschiedene genomische Merkmale, ausgedrückt als Anteil der kommentierten Peaks. Promotoren werden durch die TSS-Region von -1 kb bis + 100 bp definiert. Sonstige Peaks mit Anmerkungen zu 3'-UTR, 5'UTR, miRNA, nicht-kodierender RNA und TTS (Transkriptionsterminationsstelle). (c, d) Streudiagramm der Leseanzahl pro Million (CPM) Lesevorgänge in ATAC-seq-Peaks, die aus frischen und aufgetauten Proben während der Ruhephase (c) und als Reaktion auf die Stimulation (d) identifiziert wurden. Der Wert des Korrelationskoeffizienten nach Pearson wird angezeigt. (e) Korrelogramm, das die Assoziation von CPM-Lesevorgängen für alle für diese Studie generierten ATAC-seq-Proben zeigt. (f, g) Chromatin-Zugänglichkeitsprofile von frischen und aufgetauten Treg-Zellen im Ruhe- und stimulierten Zustand an den IL2RA- (f) und FOXP3- (g) Loci. Das ATAC-seq-Signal wird mit T-Zell-Super-Enhancern, Treg-Chromatin-Zuständen aus dem Roadmap Epigenomics Project und FOXP3-Bindungsstellen gekreuzt. Jede ATAC-seq-Spur stellt ein von drei Spendern gepooltes Signal dar. Die Browseransicht wurde mit dem UCSC-Genombrowser erstellt. Die Berechnung für ag wurde anhand gepoolter Daten durchgeführt, die repräsentativ für drei Spender waren.

Immunzellen reagieren auf Umweltreize ständig mit einer Neuprogrammierung von Chromatindomänen, was zu Transkriptionsprogrammen führt, die die Induktion von Immunantwortgenen mit speziellen Funktionen vorantreiben. T-Zell-Stimulations-spezifische Genomregionen werden für GWAS-eQTLs oder SNPs angereichert, die mit Autoimmunerkrankungen wie IBD und RA assoziiert sind, sowie für T-Zell-Untergruppen-spezifische Enhancer, was die Bedeutung der Profilierung stimulierter Immunzellen zur Identifizierung krankheitsrelevanter regulatorischer Faktoren unterstreicht Elemente und Mechanismen35,36. In Übereinstimmung mit früheren Studien35,36 führt die Stimulation zu einem globalen Anstieg der Chromatinveränderungen. Als Reaktion auf die Stimulation wurde in den frischen und aufgetauten Treg-Zellen eine hohe Übereinstimmung der genomweiten Veränderungen der Chromatinzugänglichkeit und der TF-Belegung beobachtet (Abb. 4a, ergänzende Abb. 7 und ergänzende Tabelle 2), auch bei klassischen Treg-Signaturgenen . Wir haben diese Analyse erweitert, um die Korrelation zwischen dem Promotor-Zugänglichkeitssignal und der entsprechenden Genexpression zu bewerten, die aus aufgetauten Treg-Zellen unter Verwendung von Ganzzell-RNA-Sequenz generiert wurde, da allgemeiner Konsens darin besteht, dass ein zugänglicher Promotor auf eine aktive Genexpression hinweist. In Übereinstimmung mit anderen Studien 38, 39 war die Korrelation zwischen der Zugänglichkeit des Promotors und der jeweiligen Genexpression signifikant (Abb. 5a und Ergänzungstabelle 2), was darauf hindeutet, dass das Einfrieren die Induktion des auf Aktivierung reagierenden Epigenoms und der Genexpression in Treg-Zellen nicht beeinträchtigte.

Aufgetaute Treg-Zellen zeigen eine vergleichbare TF-Aktivität wie frische Zellen. ATAC-seq wurde an sortierten ruhenden und stimulierten frischen und aufgetauten Treg-Zellen durchgeführt. (a) Korrelation der auf Stimulation reagierenden Veränderungen der Chromatin-Zugänglichkeit in frischen und aufgetauten Treg-Zellen (ausgedrückt als fache Änderungen der Messwerte in Peaks zwischen Ruhe- und stimuliertem Zustand). Unterschiedlich zugängliche genomische Loci zwischen Ruhe- und stimulierten Zuständen wurden als Gene mit einem FDR von weniger als 0,05 und einer logarithmischen Änderung definiert, die deutlich größer (rot) oder kleiner (blau) als 1,2 ist (entspricht einem 2,3-fachen Unterschied zwischen den Bedingungen). . ATAC-seq-Peaks wurden mit dem nächstgelegenen TSS annotiert, und häufige, differenziell zugängliche Peaks mit einer logarithmischen Faltungsänderung, die deutlich größer/kleiner als 4 ist, werden durch das Gensymbol annotiert. Die 20 häufigsten, differenziell zugänglichen Treg-Signaturgene (Ferraro et al. 37) sind grün hervorgehoben. (b–d) Histogramm zum Vergleich von Fragmenten aus frischen und aufgetauten Proben an den Bindungsmotiven FOXP3 (b), CTCF, RUNX1, CREB1, GATA3, IRF1 und YY1 im Ruhezustand (c) und im stimulierten Zustand (d). Das TF-Belegungssignal wird anhand der genomweiten ATAC-seq-Footprints berechnet, die mit den entsprechenden Motiven aus der JASPAR-Datenbank übereinstimmen. Histogramme werden aus Treg-Chromatin-Zugänglichkeitssignalen erstellt, die aus gepoolten Sequenzierungsdaten berechnet werden, die für drei Spender repräsentativ sind.

Parallele Messung der Zugänglichkeit von Chromatin und der Transkriptomdynamik in menschlichen Treg-Zellen. Die RNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung von RNA durchgeführt, die aus ganzen Zellen oder einer überstehenden (zytoplasmatischen) Fraktion isoliert wurde, die aus der ATAC-Seq-Reaktion gewonnen wurde und aus aufgetauten Treg-Zellen hergestellt wurde. (a) Korrelation der stimulationsresponsiven Zugänglichkeit von Chromatin und Veränderungen der Genexpression in aufgetauten, ganzen Treg-Zellen (ausgedrückt als Faltungsänderungen zwischen Ruhe- und stimuliertem Zustand). Unterschiedlich zugängliche Promotor-/exprimierte Gene zwischen Ruhe- und stimuliertem Zustand wurden als Gene mit einem FDR von weniger als 0,05 und einer logarithmischen Änderung von deutlich mehr oder weniger als 1,5 definiert. Promotoren mit unterschiedlicher Chromatinzugänglichkeit und Expressionsänderungen bei Stimulation werden hervorgehoben. Die blaue Linie zeigt die Lössanpassung an die Verteilung an. (b) Differentialanalyse von Transkriptomprofilen, die aus der ATAC-seq-Überstandsfraktion (Zytoplasmafraktion) und ganzen Treg-Zellen erstellt wurden. Differenziell exprimierte Gene wurden als Gene mit einem FDR von weniger als 0,05 und einer logarithmischen Änderung deutlich größer (rot) oder kleiner (blau) als 1,5 definiert. Die 20 am häufigsten differenziell zugänglichen Gene sind mit Gensymbolen versehen. (c) Korrelation transkriptomischer Profile, die aus der ATAC-seq-Überstandsfraktion und ganzen Zellen generiert wurden. Die Expression für jedes Gen wird durch die Logzahl pro Million (CPM) der Sequenzierungslesungen dargestellt. Differenziell exprimierte Gene werden rot hervorgehoben. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für vier Spender.

Innerhalb des zugänglichen Chromatins sind an den Transkriptionsfaktor (TF) gebundene DNA-Sequenzen selektiv resistent gegen die Tn5-Spaltung, was zu kurzen Regionen geschützter DNA oder Fußabdrücken führt. Die Footprint-Analyse von Omni ATAC-seq wurde mit gepoolten zugänglichen Fragmenten durchgeführt, die nukleosomenfreie Regionen (NFRs) und durch ein Nukleosom gebundene Regionen (1N) darstellen40. In unseren Treg ATAC-seq-Daten wurden insgesamt 551 TF-Footprints entdeckt (Ergänzungstabelle 3). Wir beobachteten klare, diskrete TF-Fußabdrücke in zugänglichen Regionen, die aus unseren frischen und aufgetauten Treg-Zellen im Ruhezustand und als Reaktion auf die Stimulation identifiziert wurden (Abb. 4b – d). Die Überlagerung des genomweiten Footprint-Signals im Zusammenhang mit frischen und aufgetauten Treg-Proben deutete darauf hin, dass ähnliche Zugänglichkeitsniveaus rund um die Positionen der vorhergesagten TF-Bindungsstellen für eine Vielzahl von TFs beobachtet wurden, einschließlich FOXP3, dem Master-TF von Treg-Zellen (Abb. 4b). ) sowie TF mit wichtigen Rollen in T-Zellen wie CTCF, RUNX1, CREB1, GATA3, IRF1 und YY1 (Abb. 4c, d). Diese Daten deuten stark darauf hin, dass die Chromatinlandschaft und die TF-Belegung in offenen Chromatinregionen in frischen und aufgetauten Treg-Zellen nicht unterscheidbar sind. Das Einfrieren oder Biobanking hatte keinen Einfluss auf die Fähigkeit, die Zugänglichkeitsmuster der TF-Belegung einzelner Basenpaare aufzulösen, und hatte keine globale Auswirkung auf TF -DNA-Interaktionen.

Die parallele Profilierung der Zugänglichkeit von Chromatin und des Transkriptoms innerhalb desselben Zellpools ermöglicht die Aufklärung der komplexen Beziehung zwischen regulatorischen Elementen und Genexpressionsprogrammen. Dieser Ansatz wird Einzelzellexperimente ergänzen, da Bibliotheken, die zur Profilierung der Zugänglichkeit von Chromatin und des Transkriptoms verwendet werden, aus derselben Zellpopulation stammen und die stochastische Genfluktuation in verschiedenen Zellen einer Population zu einem bestimmten Zeitpunkt kontrolliert. Dieser Arbeitsablauf ist besonders vorteilhaft für Experimente, die durch begrenztes Inputmaterial eingeschränkt sind, wie z. B. die Verwendung kryokonservierter, seltener menschlicher Zellpopulationen. Im ATAC-seq-Workflow werden die gesamten Zelllysate durch Zentrifugation in Kern- und Zytoplasmafraktionen getrennt. Wir haben den Zellkern einer ATAC-Sequenz unterzogen, während RNA aus der überstehenden Komponente isoliert und einer RNA-Sequenz unterzogen wurde. Bei der Bewertung der Machbarkeit der Verwendung von RNA, die aus aus Zytoplasma stammendem ATAC-seq-Überstand (ATAC-SN) gewonnen wurde, untersuchten wir zunächst die globalen Genexpressionsmuster von ATAC-SN im Vergleich zur Gesamt-RNA, die aus intakten menschlichen Treg-Zellen isoliert wurde. Die ATAC-SN- und die Gesamtzellfraktion zeigten eine signifikant hohe Korrelation (R = 0,94; p-Wert < 2,2 × 10–16) der Transkripthäufigkeit, wobei 90,7 % (10.472 von 11.548 Genen) des Transkriptoms nicht signifikant verändert waren beide Kompartimente (Abb. 5b, c und Ergänzungstabelle 2). Als Signifikanzkriterium wurde eine False Discovery Rate (FDR) von weniger als 0,05 definiert. Diese bestätigen, dass die Methode nur minimale Verzerrungen hervorruft.

Ein kleiner Teil (9,4 %) der Gene war im zytoplasmatisch abgeleiteten ATAC-SN im Vergleich zu den gesamten Zellkompartimenten unterschiedlich angereichert. Die Mehrzahl der Gene, die für Unterschiede in den Expressionsniveaus verantwortlich sind, waren Gene, die in der ATAC-SN-Fraktion herunterreguliert wurden. Anreicherungsanalysen zur Genontologie (GO) wurden für Gene durchgeführt, die in der ATAC-SN-Fraktion deutlich häufiger oder weniger häufig vorkamen. Transkripte, die im ATAC-SN unterrepräsentiert waren, waren mit nuklearbiologischen Prozessen und molekularen Funktionen verbunden, einschließlich Kernteilung, Histonmodifikation, Kernteilung, Chromosomenorganisation und Glykoprotein (ergänzende Abbildung 8a, c). Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse auch, dass Gene, die im ATAC-SN in geringeren Mengen im Vergleich zur gesamten Zellfraktion nachgewiesen wurden, mit einer verringerten RNA-Stabilität in den humanen HapMap-Lymphoblastoidzelllinien (LCLs) verbunden waren,41 (ergänzende Abbildung 9). . Im Gegensatz dazu waren Transkripte, die mit der ATAC-SN-Fraktion angereichert waren, an membranassoziierten Prozessen beteiligt, wie z. B. dem kotranslationalen Protein-Targeting auf die Membran, dem Protein-Targeting auf das endoplasmatische Retikulum (ER) sowie der zytoplasmatischen Translation, der Mitochondrienorganisation und dem Ribosom Biogenese (Ergänzende Abb. 8b, d). Diese Ergebnisse zeigen eine hohe Überschneidung mit Studien in anderen Geweben, die eine unterschiedliche Anreicherung von mRNA-Molekülen im nuklearen und zytoplasmatischen Kompartiment identifizierten42,43,44. Beispielsweise wurde in Zaghlool et al.44 gezeigt, dass viele mRNAs des nuklear kodierten mitochondrialen Proteins (NEMPs) im zytosolischen Kompartiment verschiedener menschlicher Gewebetypen signifikant angereichert sind. Um festzustellen, ob NEMPs-mRNAs auch bevorzugt in der ATAC-SN-Fraktion menschlicher T-Zellen lokalisiert waren, haben wir eine vollständige Liste der Gene (n = 1158), die Proteine kodieren, die mit der mitochondrialen Lokalisierung assoziiert sind, aus Mitocharta2.045 abgerufen und eine Genanreicherungsanalyse für differenziell exprimierte Proteine durchgeführt Gene, die in der ATAC-SN-Fraktion und in menschlichen NEMPs entweder hoch- oder runterreguliert sind. In Übereinstimmung mit der vorherigen Studie beobachteten wir eine Fülle von NEMP-Transkripten im zytosolischen Kompartiment. Unsere Ergebnisse zeigen, dass insgesamt 71 (20,6 %) Gene, die im zytoplasmatisch abgeleiteten ATAC-SN signifikant hochreguliert waren, mit dem menschlichen NEMPs-Datensatz überlappten, wohingegen nur 13 (1,6 %) im ATAC-SN herunterregulierte Gene NEMPs waren (ergänzende Abb. 10 A). Es wurde gezeigt, dass NEMPs nur in der ATAC-SN-Fraktion (p-Wert = 6 × 10–10) und nicht in ganzen Zellextrakten signifikant angereichert sind (ergänzende Abbildung 10b), was damit übereinstimmt, dass die ATAC-SN-Fraktion hauptsächlich aus Zytosolen stammt . Insgesamt kommen wir zu dem Schluss, dass die vom ATAC-SN und ganzen Zellen abgeleiteten Transkriptome einen hohen Grad an Übereinstimmung (> 90 %) aufwiesen und dass ATAC-SN zur Untersuchung globaler Genexpressionsmuster aus Ressourcen mit geringem Input wie seltenen Zellpopulationen verwendet werden kann oder klinische Proben. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass ATAC-SN die subzelluläre Lokalisierung von zytoplasmatisch angereicherter mRNA beibehält, was durch die Anreicherung von NEMPs bestätigt wurde.

Obwohl postuliert wurde, dass die Kryokonservierung die Lebensfähigkeit und Funktionalität von PBMCs beeinträchtigen kann46,47 und wiederholte Einfrier-Auftau-Zyklen sich negativ auf die Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen auswirken48, stellt die Verwendung frischer Proben aus großen Kohorten oder Längsschnittstudien mehrere Herausforderungen hinsichtlich des Batch-Effekts dar , und Biobanking mildert diese. Bei frischen Proben, die über einen längeren Zeitraum verarbeitet wurden, besteht im Vergleich zu kryokonservierten Batch-Proben ein höheres Potenzial für die Einführung von Störvariablen in nachgelagerten Tests. Darüber hinaus verhindert die alleinige Abhängigkeit von frischen Proben den Zugang zukünftiger Forschung zu Validierungsstudien. ATAC-seq wird häufig bei frisch verarbeiteten Proben angewendet und es wurden nur wenige Studien durchgeführt, um die Auswirkungen der Kryokonservierung auf die Chromatinstruktur zu bewerten13,14. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass ATAC-seq zuverlässig zur Beurteilung der globalen Chromatinzugänglichkeitslandschaft primärer regulatorischer T-Zellen (Treg) verwendet werden kann, die aus kryokonserviertem menschlichem peripherem Blut gewonnen wurden, und dass dies wahrscheinlich für andere T-Zell- oder Immunsubtypen zugänglich ist. Wir haben zunächst gezeigt, dass die Kryokonservierung keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit von T-Zellen oder die Populationskomplexität hatte. Anhand der vom ENCODE-Konsortium4 empfohlenen Kriterien haben wir gezeigt, dass aus aufgetauten Zellen hergestellte ATAC-seq-Bibliotheken ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis lieferten, vergleichbar mit den aus frisch verarbeiteten Zellen hergestellten Bibliotheken. Darüber hinaus beobachteten wir qualitativ hochwertige Daten zur Zugänglichkeit von Chromatin in kryokonservierten Treg-Zellen hinsichtlich der Bibliothekskomplexität, der TF-Belegung und der Reaktionsfähigkeit der Zellen auf Stimulation, die den mit frisch isolierten Zellen erzielten Ergebnissen sehr ähnlich waren. Schließlich zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass das Zugänglichkeitssignal an Genorten und TF-Belegungs-Footprints, die für die Treg-Aktivierung und -Funktion wesentlich sind, in aus der Kryokonservierung gewonnenen Zellen gut konserviert waren, was bestätigt, dass der Prozess die epigenetischen Signaturen, die für die Regulierung des Transkriptoms entscheidend sind, nicht gestört hat Treg-Zellen. Diese Ergebnisse spiegeln die Ergebnisse von Scharer et al.13 und Fujiwara et al.14 in primären B-Zellen und Brustkrebszelllinien wider, die auch eine hohe Korrelation von Signal-Rausch-Verhältnissen, Zugänglichkeitsniveaus und TF-Footprint-Mustern zwischen frischen und biobankierten Proben fanden. Eine hohe Korrelation zwischen frischen und gefrorenen Zellen wurde auch in Einzelzell-ATAC-seq-Profilen beobachtet, die aus PBMC-Proben erstellt wurden49.

Während sich frühere Forschungen auf die Auswirkungen des Einfrierens auf die genomweite Chromatinarchitektur in Zellen im stationären Zustand konzentrierten, bauen unsere Ergebnisse darauf auf, indem sie die nicht unterscheidbare Zugänglichkeit von Chromatin und die TF-Belegung in T-Zellen zeigen, die aus biobankierten PBMC-Proben im Ruhezustand isoliert wurden, und entscheidend als Reaktion auf die Zellstimulation. Es hat sich gezeigt, dass die Stimulation zu globalen, großflächigen Veränderungen der Zugänglichkeit von Chromatin führt35,36. Es ist bekannt, dass eine Fehlregulation der Immunhomöostase und -aktivierung eine Rolle bei Krebs und Autoimmunität spielt, und Hunderte genetischer Varianten wurden mit der stimulationsspezifischen Transkriptionsregulation und der Genexpression in T-Zellen in Verbindung gebracht50,51. Es ist erwähnenswert, dass auf der Ebene der genomweiten Zugänglichkeit von Chromatin die zwischen den frischen und aufgetauten Treg-ATAC-seq-Bibliotheken erfassten Unterschiede minimal waren und deutlichere Veränderungen festgestellt wurden, wenn man Ruhe und Stimulation sowohl in den frischen als auch in den aufgetauten Proben vergleicht ( Ergänzende Abbildungen 5 und 6). Es ist ermutigend, dass die Ergebnisse dieser Studie auch darauf hinweisen, dass die Reaktionsfähigkeit der aus kryokonservierten PBMC gewonnenen Treg-Proben auf die Aktivierung nahezu nicht von den frischen Proben zu unterscheiden war, was bestätigt, dass der Biobanking-Prozess die Empfindlichkeit der Zellen, auf die Aktivierung und epigenetische Neuprogrammierung zu reagieren, nicht beeinträchtigt hat Immunreaktionen. Wichtig ist, dass die Chromatinzugänglichkeit der kryokonservierten Proben positiv mit der Expression der Zielgene korrelierte. Dies liefert wertvolle Einblicke in regulatorische Netzwerke, die mit transkriptomischen Profilen allein nicht möglich sind. Zusammengenommen bestätigt dies, dass die Biobankproben zuverlässig zur Identifizierung genetischer oder epigenetischer Treiber verwendet werden können, um Krankheitsmechanismen aufzudecken, die auf eine Immunschwäche zurückzuführen sind.

Um die Anwendbarkeit der Genomik auf biobankierte Proben mit geringer Zellzahl oder auf seltene Zellen im Blut zu erweitern, haben wir außerdem einen Arbeitsablauf entwickelt, der für die parallele Profilierung der Chromatinzugänglichkeit und des Transkriptoms innerhalb derselben Population von 50.000 Zellen konzipiert ist. Dieser Arbeitsablauf wurde entwickelt, um Experimente zu ermöglichen, die durch begrenztes Eingabematerial eingeschränkt sind, wie z. B. die Verwendung klinischer pädiatrischer Proben oder seltener Zelltypen. Im Krankheitskontext hilft uns die Überbrückung von ATAC-seq und RNA-seq nicht nur zu verstehen, wie sich die Epigenetik verändert, sondern bietet auch Einblick in die molekularen Mechanismen, durch die regulatorische Elemente zur Krankheitspathologie beitragen. Im ATAC-seq-Protokoll trennt die Zentrifugation nach der Zelllyse das lysierte Zellmaterial in zwei Fraktionen: 1) Pellet, das intakte Kerne enthält, das für die Tn5-Transposition in ATAC-seq verwendet wird, und 2) Überstand, der abgeleitete Lysate enthält hauptsächlich aus dem Zytoplasma und nichtnukleären Organellen. Wir haben ein Protokoll zur Profilierung des Transkriptoms aus dem Kernlysatüberstand („ATAC-SN“) erstellt und eine hohe Korrelation in der relativen Verteilung der von ATAC-SN abgeleiteten Transkripte und der gesamten Zellextrakte in primären menschlichen Treg-Zellen festgestellt. Diese Ergebnisse bestätigen, dass der Großteil des Transkriptoms in beiden Kompartimenten kongruent war und ein hoher Anteil an Genen in ähnlichen Mengen nachgewiesen wurde. Obwohl Transkriptomanalysen wie RNA-seq und Microarray überwiegend mit aus ganzen Zellen extrahierter RNA durchgeführt wurden, betonen zunehmende Erkenntnisse die Bedeutung der Untersuchung des subzellulären Repertoires von RNA-Molekülen und des Verständnisses der räumlichen Dimension, die ihre Verteilung innerhalb der Zelle regelt52,53, 54,55. Ein Großteil der ATAC-SN-Fraktion besteht aus zytoplasmatischer RNA und Studien haben gezeigt, dass das zytoplasmatische Transkriptom stark mit dem gesamten Zelltranskriptom korreliert42,56. Zytoplasmatische RNA ist möglicherweise ein besserer Indikator für die Proteinspiegel, da vermutet wird, dass die zytoplasmatische Fraktion eine legitimere Darstellung der Steady-State-mRNA liefert43,57. Trask et al.43 beschrieben, dass für eine genaue und reproduzierbare Quantifizierung der Genexpression die Kernkomponenten ausgeschlossen oder zumindest getrennt von den zytoplasmatischen Fraktionen analysiert werden müssen. Es wurde berichtet, dass der Einschluss von Kern-RNA, die 10–15 % der gesamten RNA42 ausmacht, das mRNA-Profil verzerrt und zu einer erheblichen Anzahl falsch-positiver Ergebnisse beiträgt. In dieser Studie wurde argumentiert, dass durch das Weglassen einer Untergruppe von Kerntranskripten mit variabler oder stochastischer Expression unterschiedlich exprimierte Gene wiederhergestellt wurden, die bei Verwendung der gesamten Zellfraktionen übersehen worden wären oder statistisch nicht signifikant waren.

Insgesamt stellten wir bei Vergleichen ganzer Zellen und ATAC-SN-Fraktionen (FDR < 0,05) eine hohe Überlappung der Transkriptome fest (90,7 %; R = 0,94). Obwohl es nur einen kleinen Teil des gesamten Transkriptoms ausmacht, haben wir die Ursachen dieses Unterschieds untersucht. Insgesamt gab es im ATAC-SN, in dem der Zellkern fehlt, im Vergleich zur gesamten Zellfraktion eine höhere Anzahl herunterregulierter Gene. Eine kleine Anzahl von Transkripten, die im ATAC-SN abgereichert wurden, zeigen eine Überrepräsentation biologischer Prozesse und molekularer Funktionen, die mit dem Kern verbunden sind, einschließlich Kernteilung, Kernmembran, Histonmodifikation, Chromosomenorganisation und Glykoprotein. Dies ist zwar nicht überraschend, da dieses Kompartiment technisch ausgeschlossen ist und daher als DE angezeigt wird, es gibt jedoch Prozesse, die mit diesen Transkripten verknüpft sind. Die Geschwindigkeit des Transports vom Zellkern zum Zytoplasma kann einen Einfluss auf die Menge der in beiden Kompartimenten nachgewiesenen Transkripte haben, und es wurde berichtet, dass mRNA-Moleküle, die nicht unmittelbar für die Produktion von Proteinen benötigt werden, im Zellkern zurückgehalten werden57,58. Es wurde gezeigt, dass die Transkription bei Säugetieren ein pulsierender Prozess ist, der stochastische Ausbrüche der mRNA-Produktion, gefolgt von Intervallen der Promotorruhe59, umfasst und die mRNA-Kompartimentierung dient dazu, diese Transkriptionsschwankungen im Zytoplasma und schließlich in den Proteinspiegeln abzupuffern58. Die nukleare Retention von unvollständig gespleißten60, reifen oder übereditierten mRNAs61 spielt auch eine wichtige Rolle bei der Genregulation und ermöglicht es der Zelle, schnell auf Stress, Virusinfektionen oder sich ändernde Umweltreize zu reagieren62,63. Das vorgeschlagene Modell für die nukleare Retention könnte die mäßige Abnahme der Transkripte in der ATAC-SN-Fraktion erklären. Darüber hinaus können Transkripte mit einer intrinsisch hohen Abbaurate im Zytoplasma in geringeren Mengen im Zytoplasma nachgewiesen werden als die gesamten Zellfraktionen. Ebenso könnte die Anreicherung der Transkripte im ATAC-SN in Bezug auf die gesamte Zellfraktion auf deren hohe Stabilität im Zytoplasma und niedrige Transkriptionsraten zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu zeigte die aus Zytosolen stammende ATAC-SN-Fraktion im Einklang mit Zaghlool et al.44 eine Anreicherung nukleär kodierter mitochondrialer Proteine (NEMPs). Es war bekannt, dass sich NEMPs-mRNAs im Zytoplasma ansammeln, bis ihre Translation von den Mitochondrien benötigt wird64, und im Vergleich zu anderen proteinkodierenden Transkripten eine deutlich längere mRNA-Halbwertszeit aufweisen, was ihre bevorzugte und längere Lokalisierung im ATAC-SN unterstützt. Dennoch deuten unsere Daten stark darauf hin, dass die Mehrheit der Transkripte eine gleiche Häufigkeitsverteilung in den beiden Kompartimenten aufweist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das von ATAC-SN abgeleitete Transkriptom auf globaler Ebene dem des gesamten Zelllysats sehr ähnlich ist, was die Machbarkeit und Zuverlässigkeit der Verwendung des kombinierten Arbeitsablaufs von ATAC-SN und RNAseq für eine hochauflösende Darstellung der Genregulation und der Expressionsniveaus demonstriert biobankierte Zellen. Dies weist darauf hin, dass bei den meisten Transkripten weder die selektive zelluläre Lokalisierung noch die RNA-Stabilität ihre Verteilung innerhalb der Zelle beeinträchtigt.

Obwohl wir erkennen, dass eine bescheidene Probengröße eine potenzielle Einschränkung dieser Studie darstellen kann, zeigen wir eine hohe Machbarkeit und Zuverlässigkeit der Profilierung der Chromatinzugänglichkeit mithilfe von ATAC-seq an menschlichen Primärzellen, die aus Biobankmaterialien gewonnen wurden. Diese Experimente wurden mit 50.000 Zellen durchgeführt, aber in unseren anderen Studien haben wir nur 25.000 Zellen verwendet und ähnliche Ergebnisse erzielt (Daten nicht gezeigt). Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass wir aufgrund der ethischen Implikationen der Probenentnahme bei gesunden Personen nicht in der Lage waren, die Reproduzierbarkeit dieser Omics-Ansätze auch an normalen Gewebeproben zu untersuchen. Möglicherweise wären Tumorbiopsien eine alternative Möglichkeit, dies zu testen. Unsere Studie ist jedoch von Bedeutung, da sie zeigt, dass die Kryokonservierung die zellulären Reaktionen, die Chromatinlandschaft und die epigenetischen Signaturen (Genzugänglichkeitssignal und TF-Belegung) kryokonservierter primärer Treg-Zellen nicht beeinträchtigt und das Protokoll von Forschungsgruppen verwendet werden kann, die mit ähnlichen Zellen arbeiten Arten von Interesse.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Ergebnisse erhebliche Auswirkungen auf Studien haben, die darauf abzielen, die Zugänglichkeit von Chromatin und das Transkriptom gleichzeitig aus Ressourcen mit begrenztem Inputmaterial zu erhalten, und bis die Tiefe, Auflösung und Kosten, die mit den Einzelzelltechnologien verbunden sind, denen von Massenansätzen entsprechen, wird dies immer noch der Fall sein Es besteht ein Bedarf an Arbeitsabläufen, die Biobankmaterial nutzen und parallele Entdeckungen durchführen können. Die Anwendung dieser Techniken auf biobankiertes Material aus Krankheitskohorten mit der Gewissheit, dass die Daten aus gefrorenem Material frisch isolierte Zellen genau widerspiegeln, gibt die Zuversicht, dass die Ergebnisse wertvolle mechanistische Einblicke in molekulare Krankheitsprofile liefern und die Tür zu neuen therapeutischen Zielen und personalisierter Medizin öffnen.

Vollblutproben wurden mit Einverständniserklärung von vier männlichen gesunden erwachsenen Spendern im Alter zwischen 36 und 57 Jahren entnommen. Die Proben waren nicht identifizierbar und es wurden im Rahmen der Studie keine personenbezogenen Daten erhoben. Diese Forschung wurde vom Women's and Children's Health Network-Human Research Ethics Committee (WCHN-HREC) genehmigt (Genehmigungscode: HREC/19/WCHN/65; Genehmigungsdatum: 11. Juni 2019) und alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Vorschriften durchgeführt Richtlinien und Vorschriften. PBMCs wurden aus frischem Vollblut gesunder erwachsener Spender durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung einer Ficoll-Paque-Lösung isoliert. Kurz gesagt, in heparinhaltigen Röhrchen gesammelte Blutproben wurden 1-fach mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt und 35 ml der verdünnten Blutprobe auf 15 ml Ficoll-Paque™ PLUS in 50-ml-Falcon-Röhrchen geschichtet, gefolgt von einer Zentrifugation bei 800 xg für 20 min in einem Ausschwingrotor mit ausgeschalteter Bremse. Die mononukleäre Zellschicht an der Grenzfläche wurde in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt und mit PBS auf ein Endvolumen von 50 ml aufgefüllt. PBMCs wurden zweimal durch 10-minütige Zentrifugation bei 500 xg und RT bei eingeschalteter Bremse gewaschen. PBMCs wurden in zwei Gruppen eingeteilt, die Hälfte zur Frischverarbeitung und die andere Hälfte zum Einfrieren/Biobanking. Die einzufrierenden Proben wurden in 1 ml Gefriermedium (hitzeinaktiviertes FCS mit 10 % DMSO) bei einer Konzentration von 1 × 107 Zellen/ml resuspendiert, in ein 2-ml-Kryoröhrchen überführt und in einen Mr. Frosty™ Gefrierbehälter gegeben zum allmählichen Einfrieren auf −80 °C mit einer Geschwindigkeit von -1 °C/Minute. Anschließend wurden die Kryoröhrchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt.

Kryokonservierte PBMCs wurden aus flüssigem Stickstoff entfernt und 10 Minuten lang in einem 37 ° C warmen Wasserbad aufgetaut. Aufgetaute PBMCs wurden in ein konisches 10-ml-Röhrchen überführt und mit vorgewärmten vollständigen inaktiviertes Humanserum) mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/5 s. Das konische 10-ml-Röhrchen mit der Zellsuspension wurde zum Mischen vorsichtig umgedreht und 10 Minuten lang bei RT mit 500 xg geschleudert, was insgesamt zwei Wäschen ermöglichte. Anschließend wurden die Zellen in vorgewärmten vollständigen X-VIVO 15-Kulturmedien bei 3–4 × 106/ml resuspendiert. Nach dem Auftauen konnten sich die PBMCs vor der FACS über Nacht in vollständigem X-VIVO 15-Kulturmedium in einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen erholen.

Nach dem Ruhen über Nacht in der Kultur wurden frisch isolierte oder aufgetaute PBMCs 10 Minuten lang in PBS, ergänzt mit 2 % FCS, bei 500 xg bei RT gewaschen. Die Zellen wurden mit den folgenden Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Anti-Human-Antikörpern markiert: Anti-CD4 (BD Biosciences, BUV395 Mouse Anti-Human), Anti-CD25 (BD Biosciences, BV421), Anti-CD127 (BD Biosciences, PE-CF594). und Lebensfähigkeitsfarbstoff (BD Biosciences, BD Horizon Fixable Viability Stain 700) für die FACS-Analyse. Treg-Zellen wurden als CD4+ CD25hi CD127dim-Population unter Verwendung eines BD FACSAria Fusion-Durchflusszytometers isoliert. Ein Teil der isolierten Populationen wurde mittels Durchflusszytometrie auf Zellreinheit analysiert. Nach der Zellsortierung wurden Treg-Zellen mit 100.000 Zellen pro Vertiefung in einer U-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen ausplattiert und in vollständigem X-VIVO 15-Kulturmedium gehalten (X-VIVO 15-Medium, ergänzt mit 2 mM HEPES, pH 7,8, 2 mM L-Glutamin). und 5 % hitzeinaktiviertes menschliches Serum) in Gegenwart von 500 U/ml rekombinantem menschlichem IL-2 für 2 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator vor der Zellvorbereitung für ATAC-seq- und RNA-seq-Experimente.

Nach einer zweistündigen Erholung nach dem Sortieren wurden Treg-Zellen entweder unbehandelt gelassen oder mit Perlen stimuliert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern (Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28, Gibco Nr. 11141D, Life Technologies) in vollständigem X konjugiert waren -VIVO 15-Kultur in Gegenwart von 500 U/ml rekombinantem humanem IL-2 bei einem Zell/Kügelchen-Verhältnis von 1:1 für 48 Stunden. Nach 48 Stunden wurden die Dynabeads durch magnetische Trennung aus dem Kulturmedium entfernt.

Frische und aufgetaute Proben wurden mit den folgenden fluoreszierenden konjugierten Antikörpern gefärbt (CD25-BV421, CXCR3-BV650, CCR6-BV786, CCR10-BB515, CD127-PE-CF594, CCR4-PE-Cy7, FOXP3-AF647 (PCT), CD45RA- APC-H7) und der LIVE/DEAD-Diskriminierungsfarbstoff AF700. Anschließend wurden lebensfähige CD4+-T-Zellereignisse (280.000) aus frischen (n = 4) und aufgetauten Proben (n = 4) zur t-SNE-Analyse exportiert. Bei den verwendeten Markern handelt es sich um ein definiertes phänotypisches Panel, das mithilfe von Chemokinrezeptoren verschiedene Subpopulationen sowohl in konventionellen T-Zellen (Tconv) als auch in regulatorischen T-Zellen (Treg) bestimmen soll. Treg-Zellen wurden durch die Expression von CD25+, CD127lo und FOXP3+ definiert. CD45RA wird zur Identifizierung naiver T-Zellen (CD45RA+) und Gedächtnis-T-Zellen (CD45RA-) verwendet. Die Chemokinrezeptoren CXCR3, CCR4, CCR6 und CCR10 sind enthalten, da sie bekanntermaßen auf den Helferlinien-Subpopulationen Th1, Th2, Th17 und Th22 exprimiert werden und in einem ähnlichen Muster auf Treg-Zellen gefunden werden können. Die FOXP3-Expression wurde vor der Dateiverkettung von der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) in den Prozentsatz des maximalen MFI (bezeichnet als „PCT“) jeder Datei umgewandelt. Die MFI von CD25, CXCR3, CCR6, CCR10, CD127, CCR4, FOXP3(PCT) und CD45RA wurden beim maschinellen t-SNE-Lernen für den gesamten (1,12 × 106) CD4+-T-Zell-Ereignisdatensatz verwendet. Der Datensatz wurde intervallmäßig auf 100.000 Ereignisse heruntergerechnet, bevor er 700 Iterationen der tSNE-Gleichung mit den folgenden Einstellungen Perplexität von 50 und einer Barnes-Hut-Näherung von 0,5 unterzogen wurde. Nicht abgetastete Ereignisse, die aus dem Downsampling resultierten, wurden geschätzt und mit den 100.000 Ereignissen grafisch dargestellt (FCS Express v6). Dies ermöglicht die Zuordnung nicht abgetasteter Ereignisse zu ihrem nächstgelegenen abgetasteten Ereignis für die Teilnahme an der t-SNE-Berechnung. Zellpopulationscluster wurden aus der Verteilung und Kombination von Fluoreszenzmarkern bestimmt.

Omni ATAC-seq wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Änderungen durchgeführt32. Kurz gesagt, die Zellen wurden vor dem ATAC-seq-Experiment 30 Minuten lang bei 37 °C mit 200 U/µL DNase (Worthington) vorbehandelt. Die Zellzählungen wurden manuell mit einem Hämozytometer durchgeführt und 50.000 Treg-Zellen wurden in 50 µL kaltem Resuspensionspuffer (RSB: 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl und 3 mM MgCl2), ergänzt mit 0,1 % NP40, 0,1 % Tween-, lysiert. 20 und 0,01 % Digitonin auf Eis für 3 Min. Unmittelbar nach der Lyse wurde die Reaktion mit 1 ml ATAC-seq RSB, das 0,1 % Tween-20 enthielt, durch 10-minütige Zentrifugation bei 500 xg und 4 °C gewaschen. Nach der Pelletierung der Kerne wurde der Überstand gesammelt und 3 Volumina TRIzol LS-Reagenz (Invitrogen, 10296010) zum Überstand gegeben (aufgeteilt in fünf 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen) und bei –80 °C für RNA-seq-Experimente gelagert. Die Kerne wurden in 50 µL Transpositionsmix (30 µL 2 × TD-Puffer, 3,0 µL Tn5-Transposase, 16,5 µL PBS, 0,5 µL 1 % Digitonin und 0,5 µL 10 % Tween-20) resuspendiert. TD-Puffer und Tn5-Transposase wurden von Illumina Inc. gekauft. Die Transpositionsreaktion wurde 45 Minuten lang bei 37 °C in einem Thermomixer mit Mischgeschwindigkeit von 1000 U/min inkubiert. Die Reaktion wurde mit einem Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (D4014) Kit gereinigt. Die anschließende Vorbereitung der ATAC-seq-Bibliothek wurde wie beschrieben durchgeführt32. Alle Bibliotheken wurden über insgesamt 9 PCR-Zyklen amplifiziert und die Größenselektion wurde mit SPRIselect (Beckman Coulter) durchgeführt, um vor der Sequenzierung ein Fragmentgrößenfenster von 100 bis 800 bp einzuschließen. Bibliotheken mit Barcodes wurden gepoolt und auf einer Paired-End-75-Zyklen-Plattform Illumina NextSeq 550 High-Output mit einer durchschnittlichen Lesetiefe von 37,2 Millionen Lesevorgängen (± 6 Millionen) pro Probe sequenziert (Ergänzungstabelle 1).

RNA-seq-Profile wurden von 50.000 ganzen Zellen (ruhende und stimulierte Treg-Zellen) und Überstandsfraktionen (nur stimulierte Treg-Zellen) aus Omni ATAC-seq-Lysereaktionen (ATAC-SN) für 4 Personen gesammelt, von denen 3 übereinstimmende ATAC-seq-Zellen aufweisen Profile. Die Proben wurden mit TRIzol LS-Reagenz (Invitrogen, 10296010) homogenisiert und die Gesamt-RNA wurde mit einem miRNeasy Micro Kit (Qiagen; Kat.-Nr. 217084) extrahiert. Die RNA-Integrität wurde mit dem Agilent RNA 6000 Pico Kit unter Verwendung eines Agilent Bioanalyzers bestimmt. Für die mRNA-Sequenzierung wurden Proben mit einer RNA-Integritätszahl (RIN) > 7,5 verwendet. Die RNA-Proben wurden mit dem NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (New England Biolabs #E7490) auf Poly(A)-RNA angereichert, bevor cDNA-Bibliotheken mit einem NEBNext Ultra Directional II RNA-Bibliotheksvorbereitungskit für Illumina (New England) erstellt wurden Biolabs #E7760S) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Mit Barcodes versehene Bibliotheken wurden gepoolt und auf einem Paired-End-150-Zyklen-Illumina-Hiseq-X-Sequenzer bis zu einer durchschnittlichen Lesetiefe von 37,5 Millionen Lesevorgängen (± 16 Millionen) pro Probe sequenziert.

Für die ATAC-seq-Datenanalyse wurden die folgenden Tools und Versionen verwendet: FastQC ver. 0.11.7, Samtools ver. 1.3.1, Picard ver. 2.2.4, Bowtie2 ver. 2.2.9, MACS2 Ver. 2.1.2, BEDTools ver. 2.25.0, Bedmap Version 2.4.36, Subread Version. 1.5.2.

Die Qualität der Sequenzierungsdaten wurde mit FastQC (Version 0.11.7) bestimmt, gefolgt vom Trimmen der Nextera-Adapter mit Cutadapt (Version 1.14). Zugeschnittene Lesevorgänge wurden mithilfe von Bowtie2 (Version 2.2.9) mit der Einstellung „-X 2000“ auf das GRCh37-Genom ausgerichtet. Für jede Stichprobe wurde eine Qualitätsbereinigung mit der Option „-q 10“ durchgeführt, wobei nicht zugeordnete und nicht primär zugeordnete Lesevorgänge mit der Option „-F 2828“ unter Verwendung von Samtools Version gefiltert wurden. 1.3.1. Anschließend wurden eindeutig zugeordnete gepaarte Lesevorgänge mithilfe von Picard Version gefiltert, um PCR-Duplikate auszuschließen. 2.2.4. Mitochondriale Lesevorgänge, Lesezuordnungen zu Regionen auf der schwarzen Liste von ENCODE hg19 (Regionen mit anomal hohem Signal über mehrere genomische Tests und Zelltypen hinweg) und Regionen auf der schwarzen Liste mitochondrialer Zellen (Regionen mit hohem Signal auf dem Kerngenom aufgrund von Sequenzhomologie mit dem mitochondrialen Genom) wurden mithilfe von BEDTools herausgefiltert ver. 2.25.0. Nach der Filterung wurde ein Median von 28 Millionen Lesevorgängen (± 3 Millionen) Lesevorgängen pro Probe erhalten. Für Peak Calling und TF Footprinting wurden die Lesestartstellen so angepasst, dass sie das Zentrum des Tn5-Transposase-Bindungsereignisses darstellen. Da die Tn5-Transposase als Dimer bindet und zwei durch 9 bp65 getrennte Adapter einfügt, waren alle Lesevorgänge, die auf den Vorwärtsstrang ausgerichtet waren, um +4 bp versetzt, wohingegen alle Lesevorgänge, die auf den Rückwärtsstrang ausgerichtet waren, um –5 bp versetzt waren.

Um eine unterschiedliche Zugänglichkeit zwischen ruhenden und stimulierten Treg-Proben zu gewährleisten, wurden die verarbeiteten ATAC-seq-Messwerte, die frische und gefrorene Proben aus ruhenden oder stimulierten Proben repräsentieren, verkettet. Peaks wurden aus den zusammengeführten BAM-Dateien mit MACS2 Version aufgerufen. 2.1.266 mit den Parametern „callpeak -f BAMPE -g hs -nolambda -min-length 100 -max-gap 50 -call-summits -bdg -keep-dup all -p 0.1“. Für jeden Peaksatz wurden überlappende Peaks mit BEDTools Version zusammengeführt. 2.25.0 und die Anzahl der Lesevorgänge in jeder einzelnen Proben-/Spenderzuordnung zu jedem Peak wurde mit featureCounts67 berechnet, wobei nur Fragmente berücksichtigt wurden, bei denen beide Enden erfolgreich ausgerichtet waren (-B) und mit Lesevorgängen, die mehrere Merkmale überlappten, die dem Merkmal mit der größten Überlappung zugewiesen wurden ( -größteÜberlappung). Die Zähldaten wurden dann in R importiert und mit EdgeR68 verarbeitet, wobei alle Peaks mit weniger als 3 Zählungen pro Million in mehr als drei Proben entfernt wurden. Die Zählungen wurden auf die Größe der Probenbibliothek normalisiert und allgemeine, trendmäßige und tagweise Streuungen wurden berechnet. Die Analyse der differenziellen Zugänglichkeit wurde mit voom aus dem Limma-Paket69 durchgeführt. Eine signifikante unterschiedliche Zugänglichkeit wurde als Regionen mit einem Benjamini-Hochberg-FDR unter 0,05 und einer Faltungsänderung von mehr als 1,5 definiert. IGV ver. 2.5.2 (Broad Institute) und der UCSC-Genombrowser (University of California Santa Cruz) wurden zur Visualisierung von ATAC- und RNA-seq-Tracks verwendet. Peaks wurden mithilfe von ChIPpeakAnno70 mit dem nächstgelegenen TSS versehen. HINT-ATAC40 wurde verwendet, um Footprints unter den ATAC-seq-Peaks aus den ATAC-seq-Daten mit den Parametern „-atac-seq -paired-end -organism = hg19“ abzurufen.

Alle RNA-seq-Proben wurden zunächst mit FastQC v0.11.7 (Babraham Institute) unter Verwendung von Standardparametern auf konsistente Qualität validiert. Rohlesevorgänge wurden mithilfe von AdapterRemoval/2.2.1 mit den Parametern „-minquality 30 -minlength 50“ gekürzt, um Adapter und Basen mit geringer Qualität zu entfernen. Adapter- und qualitätsgetrimmte Lesevorgänge wurden anschließend unter Verwendung von Kallisto mit den Parametern „-b 50“ und „-fr-stranded“ pseudo-ausgerichtet auf das menschliche GRCh38-Genom. Kurz gesagt wurden Rohzählungen importiert und gefiltert, um Gene mit geringer oder keiner Expression zu entfernen (weniger als zwei Zählungen pro Million in allen Versuchsgruppen). Die differenzielle Expression wurde unter Verwendung von voom aus dem Limma-Paket69 berechnet, wobei Gene mit einer Benjamini-Hochberg-False-Discovery-Rate (FDR) von weniger als 0,05 und einer Fold Change von mehr als 1,5 als signifikant angesehen wurden (sofern nicht anders angegeben). Die Daten wurden mit ggplot2 (Version 3.0.0) visualisiert.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind im Repository des European Nucleotide Archive (ENA) mit dem Zugangscode PRJEB55015 verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Benjamin Ramoso, Alison Gwiazdzinski und Sarah Beresford (ENDIA-Studie, WCH) für ihre Unterstützung bei der Blutentnahme. Wir möchten allen Freiwilligen danken, die sich bereit erklärt haben, für diese Studie Blut zu spenden. Wir danken Dr. Randall Grose (SAHMRI Research and Core Facilities) für die Zellisolierung und Durchflusszytometrie-Expertise, Dr. Stephen Wilcox (WEHI Genomics Hub) und Genewiz für die Illumina-Sequenzierung. Wir danken außerdem Dr. Kristian Handler (DZNE) und Dr. Simone Picelli (IOB) für ihr Fachwissen und ihren Rat bei der Verbesserung experimenteller Verfahren zur Vorbereitung und Sequenzierung der ATAC-seq-Bibliothek. Ein Teil dieser Arbeit wurde durch die ENDIA-Studie (Environmental Determinants of Islet Autoimmunity) unterstützt. Die ENDIA-Studie wurde von JDRF Australia, dem Empfänger des Commonwealth of Australia-Stipendiums für beschleunigte Forschung im Rahmen des Medical Research Future Fund, und mit Mitteln des Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust (Stipendium Nr. 3-SRA-2020) unterstützt -966-MN). Darüber hinaus wurde ein Teil dieses Zuschusses auch durch einen Zuschuss der Women's and Children's Hospital Research Foundation (Sadlon und Barry) finanziert.

Robinson Research Institute, Universität Adelaide, Adelaide, Australien

Ying Y. Wong, Jessica E. Harbison, Christopher M. Hope, Batjargal Gundsambuu, Katherine A. Brown, Soon W. Wong, Cheryl Y Brown, Jennifer J. Couper, Jimmy Breen, Ning Liu, Stephen M. Pederson, Timothy Sadlon & Simon C. Barry

Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen, Universität Bonn, Bonn, Deutschland

Maren Köhne, Kathrin Klee, Joachim Schultze & Marc Beyer

Frauen- und Kinderkrankenhaus, North Adelaide, Australien

Jessica E. Harbison, Christopher M. Hope, Cheryl Y Brown, Jennifer J. Couper, Timothy Sadlon und Simon C. Barry

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YYW trug zur Erfassung, Interpretation der NGS-Daten und zum Verfassen des Manuskripts bei. CMH trug zur Erfassung und Interpretation von Daten zur Phänotypisierung von Immunzellen durch Durchflusszytometrie bei. JEH und JJC trugen zur Biobanking-Methodik bei. BG und CB trugen zur Zellkultivierungsmethodik und Interpretation der Daten bei. YYW führte die Datenanalyse mit Unterstützung und Anleitung von JB, NL, SMP durch und SWWKAB trug zur Überarbeitung des Manuskripts bei. MB, JS, MK und KK boten Schulungen zur Vorbereitung der ATAC-seq-Bibliothek und zur Datenanalyse an. TS und SCB überwachten die Experimente und trugen zur Dateninterpretation und kritischen Überarbeitung des Manuskripts bei. SCB leitete das Projekt, die Beschaffung von Mitteln und andere Ressourcen.

Korrespondenz mit Simon C. Barry.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wong, YY, Harbison, JE, Hope, CM et al. Parallele Wiederherstellung der Zugänglichkeit von Chromatin und der Genexpressionsdynamik aus gefrorenen menschlichen regulatorischen T-Zellen. Sci Rep 13, 5506 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32256-6

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Eingegangen: 15. Juli 2022

Angenommen: 24. März 2023

Veröffentlicht: 04. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32256-6

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