Durch die Kryokonservierung von Pankreasinseln durch Vitrifikation wird eine hohe Lebensfähigkeit, Funktion, Erholung und klinische Skalierbarkeit für die Transplantation erreicht

Nature Medicine Band 28, Seiten 798–808 (2022)Diesen Artikel zitieren

12.000 Zugriffe

22 Zitate

106 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Eine Pankreasinseltransplantation kann Diabetes heilen, erfordert jedoch zugängliche, qualitativ hochwertige Inseln in ausreichender Menge. Die Kryokonservierung könnte die Herausforderungen der Inselversorgungskette lösen, indem sie eine qualitätskontrollierte Lagerung und Bündelung von Spenderinseln ermöglicht. Leider hat die Kryokonservierung dieses Ziel nicht erreicht, da sie gleichzeitig eine hohe Wiederherstellung, Lebensfähigkeit, Funktion und Skalierbarkeit bieten muss. Hier erreichen wir dieses Ziel in von Mäusen, Schweinen, Menschen und menschlichen Stammzellen (SC) abgeleiteten Betazellinseln (SC-beta) durch umfassende Optimierung der Zusammensetzung des Kryoschutzmittels (CPA), der CPA-Lade- und -Entladebedingungen sowie der Methoden zur Vitrifizierung und Aufwärmen (VR). Die Post-VR-Insellebensfähigkeit betrug im Vergleich zur Kontrolle 90,5 % bei Mäusen, 92,1 % bei SC-beta, 87,2 % bei Schweinen und 87,4 % bei menschlichen Inseln und blieb für mindestens 9 Monate der kryogenen Lagerung unverändert. VR-Inseln hatten eine normale makroskopische, mikroskopische und ultrastrukturelle Morphologie. Mitochondriales Membranpotential und Adenosintriphosphat (ATP)-Spiegel waren leicht reduziert, aber alle anderen Messungen der Zellatmung, einschließlich der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) zur Produktion von ATP, blieben unverändert. VR-Inseln hatten in vitro und in vivo eine normale glukosestimulierte Insulinsekretionsfunktion (GSIS). Schweine- und SC-beta-Inseln produzierten Insulin in Xenotransplantationsmodellen, und Mausinseln, die in einem syngenen Transplantationsmodell mit marginaler Masse getestet wurden, heilten Diabetes bei 92 % der Empfänger innerhalb von 24–48 Stunden nach der Transplantation. Für 150 Tage konnte eine hervorragende Blutzuckerkontrolle beobachtet werden. Schließlich verarbeitete unser Ansatz 2.500 Inseln mit einer Inselwiederherstellung von > 95 % und einer Lebensfähigkeit nach dem Auftauen von > 89 % und kann problemlos für einen höheren Durchsatz skaliert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Kryokonservierung nun zur Versorgung mit benötigten Inseln für verbesserte Transplantationsergebnisse zur Heilung von Diabetes eingesetzt werden kann.

Trotz 100 Jahren therapeutischer Entwicklung seit der Entdeckung von Insulin sind aktuelle Diabetestherapien, wie z. B. kontinuierliche Glukosemonitore, Insulinpumpen und Systeme mit geschlossenem Kreislauf, nach wie vor eher eine Behandlung der Erkrankung als eine Heilung der Krankheit1. Obwohl in den letzten Jahrzehnten erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung der Inseltransplantation als potenzielles Heilmittel für Diabetes erzielt wurden2, besteht eine der Hauptbeschränkungen dieses Ansatzes darin, dass Transplantationen von einem einzelnen Spender oft nicht ausreichen, um beim Empfänger eine Insulinunabhängigkeit zu erreichen3,4. Häufig sind für einen „typischen“ 70-kg-Empfänger zwei, drei oder mehr Spenderinselinfusionen mit insgesamt 700.000 bis >1 M Inseläquivalenten (IEQs) erforderlich5,6, was zusätzliche Risiken im Zusammenhang mit wiederholten chirurgischen Eingriffen und mehreren Runden starker Immunsuppressionsinduktion mit sich bringt.

Eine Strategie zur Überwindung des Spenderversorgungsproblems besteht darin, Inseln mehrerer Spender zu bündeln, um mit einer einzigen Infusion eine hohe Inseldosis zu erreichen7,8, wodurch die Wirksamkeit erhöht und das Risiko verringert wird. Obwohl mehrere Gruppen die Machbarkeit der Kultivierung von Inseln über längere Zeiträume (Wochen bis Monate) gezeigt haben9, berichtete die Mehrheit über eine verringerte Inselerholung und einen Verlust der endokrinen Funktion im Laufe der Zeit10,11. Daher beschränken große klinische Studien die Kultur oft auf 48–72 Stunden vor der Transplantation12. Da es jedoch nicht möglich ist, qualitativ hochwertige Inseln länger als ein paar Tage nach der Isolierung zu kultivieren oder zu lagern, ist die Bündelung von Inseln logistisch unpraktisch. Eine zweite Strategie besteht in der Entwicklung einer alternativen Inselquelle, beispielsweise von SC-abgeleiteten Inseln, die das aufregende Versprechen eines unbegrenzten Inselangebots13,14 und einer geringeren Abhängigkeit von einer begrenzten Spenderverfügbarkeit bieten. Von SC abgeleitete Inseln produzieren Insulin als Reaktion auf Glukose, stellen in einigen Tiertransplantationsmodellen die Normoglykämie wieder her und wurden in Phase-1- und Phase-2-Studien am Menschen getestet. Heterogenität in der endokrinen Zellzusammensetzung und Variabilität in der Funktion13 führen jedoch zu einer erheblichen Variabilität von Charge zu Charge15, was eine umfassende Validierung jeder Charge vor der Transplantation erfordert, während der sich die SC-Inseln in der Kultur verschlechtern. Die Unfähigkeit, Inseln vor der Verwendung zu speichern, ist bei beiden Strategien eine gemeinsame Herausforderung. Eine längerfristige Lagerung ist erforderlich, um die Hindernisse in der Lieferkette zu überwinden, die die Verfügbarkeit ausreichender Mengen an Inseln einschränken, und um eine angemessene Qualitätsbewertung vor der Transplantation zu ermöglichen.

Durch Kryokonservierung oder die Stabilisierung von Biomaterialien bei extrem niedrigen Temperaturen (weniger als –150 °C) können lebensfähige Zellen und Gewebe gebündelt, langfristig gelagert und sofort verfügbar gemacht werden16,17. Herkömmliche Kryokonservierungstechniken nutzen die langsame Abkühlung (d. h. <1 °C min−1) biologischer Substanzen in einen dehydrierten gefrorenen Zustand unter Anwesenheit von extrazellulärem Eis. Die Zugabe einer geringen Konzentration (~2 M) von CPAs trägt zur Stabilisierung der Zellen während der Kryokonservierung bei und verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen. Trotz umfangreicher Untersuchungen (Ergänzungstabelle 1 und die in Kojayanet al.18 überprüften Studien) bestehen weiterhin Herausforderungen für die Kryokonservierung von Inseln aufgrund von eisbedingten Verletzungen (d. h. suboptimaler Lebensfähigkeit), der Unfähigkeit, klinische Skalierbarkeit zu erreichen und der Verwendung nicht klinisch akzeptierter Komponenten ( fötales Rinderserum), das zur Verbesserung der Lebensfähigkeit erforderlich ist.

Eine vielversprechende Alternative zu bestehenden konventionellen Kryokonservierungsmethoden ist die eisfreie Vitrifikation; das heißt, schnelles Abkühlen eines Biomaterials in einen glasartigen Zustand19,20. Um eine Eisbildung zu vermeiden, müssen die Abkühlungs- und die anschließende Erwärmungsrate die kritische Abkühlungsrate (CCR) bzw. die kritische Erwärmungsrate (CWR) überschreiten. Eine Erhöhung der CPA-Konzentration (>4 M) kann die erforderlichen CCR- und CWR-Werte auf erreichbare Werte senken, verursacht jedoch Toxizität in Zellen und Geweben, insbesondere bei höheren Temperaturen (>4 °C). Somit gibt es einen kritischen Gleichgewichtspunkt, der sowohl Verletzungen durch Eis als auch durch CPA-Toxizität vermeidet und gleichzeitig die klinische Skalierbarkeit beibehält. Frühere Strategien zur Inselvitrifizierung waren auf kleine Volumina mit geringen Inselmengen (<150 Inseln in Mikrolitervolumina der CPA-Lösung; Ergänzungstabelle 1) beschränkt, um ausreichende Kühl- und Erwärmungsraten sicherzustellen, und die volumetrische Vergrößerung reduzierte die Kühl- und Erwärmungsraten und führte dazu Eisbildung, die die Lebensfähigkeit beeinträchtigt. Nach unserem Kenntnisstand hat keine veröffentlichte Technik gleichzeitig eine Kryokonservierung von Inseln mit hoher Lebensfähigkeit, Funktion und Erholung in einem klinisch skalierbaren Protokoll erreicht (Ergänzungstabelle 1).

Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir systematische Untersuchungen zur CPA (Formulierung, Konzentration, Be- und Entladung) und zur Vitrifikationsmethode (Verbesserung der Kühl- und Wiedererwärmungsraten) durchgeführt, um eine neue Methode zur Kryokonservierung von Inseln zu entwickeln, die gleichzeitig eine hohe Rückgewinnung, Lebensfähigkeit, Funktionalität und Skalierbarkeit erreicht. Wir haben unsere Methoden an von Mäusen, Schweinen, Menschen und menschlichen SC abgeleiteten Inseln validiert. Es wurden umfangreiche In-vitro-Bewertungen der Lebensfähigkeit, der Stoffwechselgesundheit und der Insulinsekretion durchgeführt. Schließlich haben wir mithilfe syngener und xenogener Transplantationsmodelle gezeigt, dass Inseln nach VR in vivo lebensfähig bleiben, Insulin produzieren, auf glykämische Herausforderungen reagieren und Diabetes heilen. Der Überblick über unsere Technik ist in Abb. 1a zusammengefasst.

a: Die Kryokonservierung kann der Eckpfeiler einer Insel-Lieferkette sein und ermöglicht die Bündelung, Lagerung und Qualitätskontrolle vor der Transplantation. Zu den zu dieser Untersuchung verwendeten Modellsystemen gehören Maus-, Schweine- und Menscheninseln sowie SC-Beta-Inseln. Um gleichzeitig eine hohe Wiederherstellung, Lebensfähigkeit, Funktion und Skalierbarkeit zu erreichen, wurde in diesen Inselsystemen eine systematische Optimierung der miteinander verbundenen Parameter, einschließlich CPA-Toxizität, Eisbildung sowie Abkühlungs- und Erwärmungsraten während der VR-Kryokonservierung, durchgeführt. Die erreichten Abkühlungs- und Erwärmungsraten können das Gleichgewicht zwischen CPA-Toxizität und Eisbildung regulieren. Die Morphologie, Lebensfähigkeit, Stoffwechselgesundheit und In-vitro- und In-vivo-Funktion der Inseln wurden nach VR-Kryokonservierung bewertet. hESC, menschliche embryonale Stammzelle. b, Schematische Darstellung von Cryomesh VR (nicht maßstabsgetreu). Nach der CPA-Beladung wurden die suspendierten Inseln in das Kryonetz überführt und überschüssige CPA-Lösung entfernt, bevor sie in flüssigen Stickstoff (LN2) getaucht wurden. c, Repräsentatives gemessenes Temperaturprofil von Cryomesh VR. Eingefügt sind die erreichten Abkühlungs- und Erwärmungsraten (n = 6, Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung mit einzelnen Datenpunkten dargestellt). d, Korrelation von CWR- und CPA-Konzentration (Gleichung (S2) in ergänzenden Materialien) zeigt, dass mindestens ~44 Gew.-% CPA erforderlich sind, um tödliches Eis mit Cryomesh VR zu vermeiden, und zeigt, wo andere Studien es versäumt haben, ein CPA mit einem angemessenen CWR zu verwenden Vermeiden Sie Eis unter ihren thermischen Leistungsbedingungen.

Für diese Studie haben wir die Kryokonservierung und die Nachwärmfunktion von Maus-, Schweine-, Menschen- und SC-Beta-Inseln getestet. SC-beta-Inseln waren Cluster, die durch Differenzierung einer humanen embryonalen SC-Linie (HUES8) in sechs Stadien unter Verwendung nichtgenetischer Programmierung in einer 3D-Suspensionskultur erzeugt wurden21. Ergänzende Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die SC-beta-zellspezifische Charakterisierung in jedem Differenzierungsstadium. Für die anfängliche Entwicklung wurden Maus- und SC-Beta-Inseln verwendet, und der Ansatz wurde dann anhand von menschlichen und Schweine-Inseln validiert.

Wir haben zunächst verschiedene VR-Ansätze gescreent und ihre Leistung in Bezug auf Kühlung, Wiedererwärmung und Skalierbarkeit bewertet. Wir haben drei häufig verwendete tröpfchenbasierte VR-Strategien verglichen: (1) Kühlung der Kupferschale und konvektive Erwärmung, (2) Kühlung der Kupferschale und Laser-Nanoerwärmung (Gold-Nanostäbe wurden dem Tröpfchen hinzugefügt, um bei Laserbestrahlung Wärme zu erzeugen) und (3) Konvektion Kühlen und Erwärmen mit einem Kryotop-Gerät (Ergänzende Abbildung 2; Einzelheiten in Methoden). Kurz gesagt, 10–20 Inseln in einem 2-µl-Tröpfchen wurden vitrifiziert und anschließend wieder erwärmt. Wir haben die Abkühlungs- und Erwärmungsraten durch direkte Messung oder durch Schätzung mittels Modellierung bewertet (Ergänzungstabelle 2)16. Die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen betrug 56 %, 62 % bzw. 55 % unter Verwendung der Ansätze 1, 2 und 3. Insgesamt litt jeder dieser Ansätze unter einer suboptimalen Durchführbarkeit und potenziellen Herausforderungen bei der Skalierbarkeit (Einzelheiten unter „Ergänzende Ergebnisse und Diskussion“).

Um diese tröpfchenbasierten Einschränkungen zu überwinden, haben wir als Nächstes ein Kryonetzsystem getestet, mit dem Drosophila melanogaster-Embryonen erfolgreich kryokonserviert werden können22. Das Kryonetz besteht aus einem Nylonnetz (Porengröße 38 µm), das an einem Kunststoffgriff befestigt ist. Nach dem Laden von CPA in suspendierte Inseln wurden die Inseln auf einen Kryomesh-Träger übertragen und überschüssige CPA-Lösung durch Dochtwirkung entfernt; Dies ist ein entscheidender Schritt, da er den Großteil der thermischen Masse im System reduziert und eine dünne Inselschicht auf dem Kryonetz zurücklässt, die von einem minimalen CPA-Volumen umgeben ist (Abb. 1b). Durch die Entfernung dieser überschüssigen Flüssigkeit werden die Abkühl- und Erwärmungsraten während der konvektiven Abkühlung/Erwärmung um etwa eine Größenordnung auf 5,4 × 104 bzw. 30,9 × 104 °C min−1 erhöht (Abb. 1c). Die Entfernung von CPA erhöht auch die Dichte der Inseln im System im Vergleich zu einem Tröpfchen. Beispielsweise macht eine dicht gepackte Monoschicht aus Inseln auf einem 2 cm × 2 cm großen Nylonnetz (d. h. 1,7 × 104 Inseln) >95 % des Volumens auf dem Kryonetz aus, während 20 Inseln in einem 2-µl-Tröpfchen nur 1,8 % einnehmen. des Gesamtvolumens. Ergänzende Tabelle 2 fasst die Leistung von Kryonetz-, Tröpfchen- und Kryotop-VR-Ansätzen zusammen und betont sowohl die verbesserten Kühl- und Erwärmungsraten als auch die Möglichkeit, das Kryonetz zu vergrößern.

Nachdem wir die thermische Leistung des Kryomesh-Systems ermittelt hatten, suchten wir nach einer CPA-Formulierung und einem Lade-/Entladeprotokoll, die Eisbildung vermeiden und gleichzeitig die Toxizität minimieren würden. Durch eine Korrelation zwischen CPA-Konzentration und CWR (Gleichung (S2)) haben wir geschätzt, dass die minimale CPA-Konzentration im Inneren einer Insel 42–44 Gew.-% betragen sollte, um eine Entglasung (Eisbildung) während der Wiedererwärmung bei 30,9 × 104 °C zu vermeiden min−1 mit dem Kryonetz (Abb. 1d). CPA-Toxizität kann sowohl durch chemische als auch durch osmotische Schäden entstehen. Um Verletzungen zu vermeiden, haben wir die schrittweise Zugabe von CPA getestet, um osmotische Schäden (d. h. extreme Volumenschrumpfung unter 60 % oder Volumenschwellung über 153 %) während des Be- und Entladens zu minimieren. Außerdem haben wir die chemische Toxizität als Funktion der Schrittdauer und einer Vielzahl von CPA-Formulierungen bewertet .

Um ein optimiertes Lade- und Entladeprotokoll für CPA zu entwickeln, haben wir zunächst ein mikrofluidisches Gerät zur Messung biophysikalischer Parameter der Insel hergestellt, einschließlich des osmotischen inaktiven Volumens (Vb), der Membranwasserpermeabilität (Lp) und der CPA-Permeabilität (ω). Vb wurde gemessen, indem das endgültige Gleichgewichtsvolumen der Inseln in verschiedenen Konzentrationen hypertonischer NaCl-Lösung aufgezeichnet wurde (Abb. 2b, unteres Feld). Die Boyle-van't-Hoff-Diagramme zeigen, dass das osmotisch inaktive Volumen für Maus- und SC-Beta-Inseln 0,5 bzw. 0,4 betrug (Abb. 2c). Die Membranpermeabilitätsparameter (Lp, ω) wurden durch Aufzeichnung des charakteristischen Schrumpf-Schwellverhaltens von Inseln bei Einwirkung von CPA-Lösungen mit 15 Gew.-% Propylenglykol (PG), Ethylenglykol (EG) und Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 4 °C bestimmt C und 21 ° C (Ergänzende Abbildung 3). Die „Schrumpfung“ erfolgt aufgrund der hohen Wasserdurchlässigkeit bei der ersten CPA-Exposition, wodurch der Wasserausfluss aus den Inseln vorangetrieben wird. Auf diese Schrumpfung folgt eine „Schwellung“, da durchlässiges CPA durch die Zellmembran diffundiert und Wasser langsam wieder in die Inseln eindringt (Abb. 2b, oberes Feld). Wir haben das Zwei-Parameter-Modell basierend auf Lp und Ps (=ωRT, R ist die Gaskonstante, T ist die absolute Temperatur) verwendet, um die experimentellen Schrumpfungs-Schwellungs-Kurven anzupassen (Details unter Methoden). Wie in Abb. 2e gezeigt, weisen die Wasser- (Lp) und die CPA-Permeabilität (ω) bei einer höheren Temperatur sowohl für Maus- als auch für SC-Beta-Inseln größere Werte auf. Die unterschiedliche Zellzusammensetzung zwischen Maus- und SC-beta-Inseln führte wahrscheinlich zu den unterschiedlichen Permeabilitätswerten zwischen den beiden Inseltypen. Obwohl das Obige das Schrumpfen und Anschwellen beim Laden beschreibt, tritt beim Entladen das Umgekehrte auf, bei dem es sich um ein Anschwellen gefolgt von einem Schrumpfen handelt, wie an anderer Stelle erwähnt23.

a, Schematische Darstellung des Mikrofluidikgeräts zur Messung der biophysikalischen Eigenschaften der Inseln (nicht maßstabsgetreu). Die morphologischen Veränderungen der Inseln wurden mit einem Mikroskop aufgezeichnet. PDMS, Polydimethylsiloxan. b, oben: Bei Einwirkung von 15 Gew.-% DMSO bei 4 °C schrumpft die Insel zunächst und schwillt dann an. Bei Einwirkung von hypertonem CPA tritt Wasser aus den Zellen aus und die Insel schrumpft. CPA diffundiert dann durch die Zellmembranen, woraufhin Wasser wieder in die Zelle eindringt, was zu einer Rückschwellung in den Ausgangszustand führt. Unten: Die Insel blieb in NaCl-Lösung geschrumpft, da die Zellen für Salz undurchlässig sind. Maßstabsbalken, 100 µm. c: Boyle-van't-Hoff-Diagramme von Maus- und SC-beta-Inseln zeigen das normalisierte Inselvolumen (V/V0) als Funktion des Osmolalitätsverhältnisses von isotonischer und hypertonischer NaCl-Lösung (π0/π). Das osmotisch inaktive Volumen (Vb), das nicht an der osmotischen Reaktion beteiligt ist, kann durch Extrapolation der linearen Anpassung auf π0/π = 0 geschätzt werden. Weitere Details finden Sie in Methoden (n = 4 für SC-Beta-Inseln, n = 8). für Mäuseinseln). d, Normalisiertes Volumen von Maus- und SC-Beta-Inseln im Vergleich zur Zeit, das das Schrumpf-Schwellverhalten zeigt, wenn es 15 Gew.-% DMSO bei 21 °C ausgesetzt wird (n = 3 für Maus-Inseln, n = 9 für SC-Beta-Inseln). e, Übersichtstabelle der Wasser- (Lp) und CPA- (ω) Permeabilität von Mäusen und SC-Beta-Inseln bei 4 ° C und 21 ° C (n = 3–9; die genaue Probengröße finden Sie in der ergänzenden Abbildung 3). Die rote Farbe stellt Mausinseln in den Panels c,d,g,h dar und wird in Panel e verwendet, um die Konsistenz mit den übrigen Panels aufrechtzuerhalten. f, Schrittweises Laden (Schritte 1–3) und Entladen (Schritte 4–7) von 22 Gew.-% EG + 22 Gew.-% DMSO für Inseln. g, Modellierte normalisierte Inselvolumenänderung während der CPA-Beladung/Entladung unter Verwendung der gemessenen biophysikalischen Eigenschaften. Das Volumen sowohl der Maus- als auch der SC-beta-Inseln blieb im sicheren Bereich. h, Modellierte CPA-Konzentration in der Maus und in SC-Beta-Inseln. Für c–e werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Mit diesen Parametern (Vb, Lp und ω) wurden die intrazelluläre CPA-Konzentration, das Inselvolumen und die chemische Toxizität während eines mehrstufigen Be- und Entladens modelliert (Gleichungen (2) und (3) in Methoden, Gleichung S1 in ergänzenden Methoden). Nach der Optimierung verwendete unser CPA-Ladeprotokoll die folgenden 10-Minuten-Schrittintervalle: 21 °C bei 1,3 M, 4 °C bei 3,2 M und 4 °C bei 6,5 M (Abb. 2f; Einzelheiten in den ergänzenden Ergebnissen und der Diskussion). Die Volumenausschläge von Maus- und SC-Beta-Inseln blieben innerhalb der osmotischen Toleranzen (Abb. 2g). Das Modell sagte eine CPA-Konzentration von 6,2 M innerhalb der Mausinseln und 6 M für SC-beta-Inseln voraus (Abb. 2h).

Um die CPA-Formulierung zu optimieren, haben wir drei Gesamt-CPA-Konzentrationen (33 %, 44 % und 54 %) bestehend aus PG, EG, DMSO oder Mischungen getestet. Wir verwendeten qualitative und quantitative Lebend-/Totfärbung, um die Lebensfähigkeit der SC-beta-Inseln für jede CPA nach dem Laden und Entladen (Abb. 2f) und erneut nach der VR zu messen. Qualitative Messungen wurden durch konfokale Bildgebung intakter Inseln nach Färbung mit Acridinorange (AO) und Propidiumiodid (PI) bestimmt (Abb. 3a). Zur quantitativen Messung wurden mit CPA mit oder ohne VR behandelte Inseln in einzelne Zellen dissoziiert und mit AO/PI angefärbt, und der Prozentsatz lebender (AO+/PI–) Zellen wurde gezählt (Abb. 3b). Die nach dem Be- und Entladen gemessene Lebensfähigkeit spiegelte die Toxizität von CPA wider. Ein weiterer Rückgang der Lebensfähigkeit nach VR war vermutlich auf eisbedingte Verletzungen beim Abkühlen und Wiedererwärmen zurückzuführen.

a: Konfokalmikroskopische Bilder lebender und toter Kontrollen von SC-beta-Inseln, gefärbt mit AO (cyan) und PI (rot). b: Konfokale Mikroskopbilder (AO/PI-Merge) von CPA-behandelten (nur CPA-Beladung und -Entladung) und VR-behandelten (CPA-Beladung, VR- und CPA-Entladung) SC-Beta-Inseln. Es wurden verschiedene CPA-Formulierungen untersucht. c, Zelllebensfähigkeit von nur CPA-behandelten (cyan), VR-behandelten (grün) und lebenden Kontroll-SC-beta-Inseln (rot). Die Inseln wurden in einzelne Zellen zerlegt und anschließend wurde die Lebensfähigkeit gemessen. Der gelbe Text in b,c wird verwendet, um den optimalen Zustand hervorzuheben. Zum Vergleich der Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey-Post-hoc-Test verwendet, und P-Werte aus informativen paarweisen Vergleichen werden angezeigt (n = 4). d, e, Für die Lebensfähigkeit von Maus- (d) und SC-beta- (e) Inselzellen nach unterschiedlichen Kulturzeiten (0, 3 und 24 Stunden) nach reiner CPA-Behandlung und dann nach VR-Behandlung. Zum Vergleich der Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test verwendet, und es werden informative paarweise Vergleiche angezeigt (n = 4). Maßstabsbalken, 100 µm. Die Daten werden als einzelne Datenpunkte und als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt

Nach dem Laden und Entladen von CPA zeigte EG die geringste Inseltoxizität der drei einzelnen Komponenten, gefolgt von DMSO und PG (Abb. 3c). Wenn Mischungen mit der gleichen Gesamtkonzentration (44 %) verwendet wurden, lieferte eine Mischung aus EG und DMSO die geringste Toxizität (Zelllebensfähigkeit betrug 96,4 % der Kontrolle) und übertraf damit EG oder DMSO allein. Die Lebensfähigkeit der Inseln blieb auch nach der VR hoch (93,3 % der Kontrolle) und blieb über 24 Stunden nach der VR-Kultur im Wesentlichen unverändert (Abb. 3d, e). Eine Verringerung der Mischungskonzentration (auf 34 %) führte aufgrund der Eisbildung zu einer geringeren Lebensfähigkeit nach der VR; Eine Erhöhung der Konzentration (auf 54 %) führte aufgrund der CPA-Toxizität zu einer geringeren Lebensfähigkeit (Abb. 3c). Während der gesamten Studie wurde die am besten identifizierte CPA-Formulierung (22 % EG + 22 % DMSO) verwendet.

Unter Verwendung der optimierten CPA-Formulierung, der Lade- und Entladebedingungen und des Kühl-/Wiedererwärmungs-Kryomesh-Systems untersuchten wir die Inselmorphologie, die Lebensfähigkeit, die DNA-Fragmentierung (TdT-vermittelte dUTP-Nick-End-Markierung (TUNEL)-Färbung) und die Annexin-V-Translokation nach VR. Wir verglichen VR mit gesunden lebenden Kontrollinseln, toten Kontrollinseln (mit Ethanol behandelt) und konventionell kryokonservierten (dh langsames Abkühlen in 15 % DMSO) Inseln (Abb. 4). Nach der VR hatte jeder der vier Inseltypen (Maus, Mensch, Schwein und SC-beta) insgesamt ein ähnliches Erscheinungsbild und eine ähnliche Lebensfähigkeit wie frische Kontrollinseln und war viel besser als konventionell kryokonservierte Inseln (Abb. 4a). VR-Inseln hatten glatte Ränder, eine abgerundete/längliche Form und ein normales histologisches Erscheinungsbild, das von frischen Inseln nicht zu unterscheiden war, wohingegen viele herkömmlich kryokonservierte Inseln eine Störung der makroskopischen Architektur aufwiesen. Noch deutlicher wurden die Unterschiede bei der ultrastrukturellen Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (Abb. 4a, unten). Die TEM-Bildgebung zeigte, dass die Zell- und Kernmembranen, Mitochondrien, sekretorischen Granula und andere Organellen in VR-Inseln intakt zu sein schienen. Im Gegensatz dazu wiesen konventionell kryokonservierte Inseln starke qualitative Veränderungen im Erscheinungsbild der Zellen, eine verringerte Anzahl von Mitochondrien und sekretorischen Granula sowie eine erhebliche Blasenbildung an Zell- und Kernmembranen auf.

a: Die Morphologie von Mausinseln aus lebender Kontrolle, VR (durch VR kryokonserviert) und konventionell (durch konventionelles langsames Einfrieren kryokonserviert) wurde mittels Hellfeldmikroskopie, Hämatoxylin- und Eosin-Histologie (H&E) und TEM bewertet. Bei der konventionellen Gruppe wurde eine Mischung aus intakten und zerstörten Inseln beobachtet. Beispiele für eine gestörte grobe Inselmorphologie aufgrund von Eisbildung werden in der Hellfeld- und H&E-Histologie gezeigt. b, Lebensfähigkeit (Prozentsatz der Lebendkontrolle) von Maus-, SC-beta-, Schweine- und Menscheninseln aus Behandlungsgruppen einschließlich Lebendkontrolle, VR, VR 9 Monate (Inseln wurden 9 Monate lang in LN2 vor dem Wiedererwärmen gelagert), konventionell (kryokonserviert durch herkömmliche langsame Behandlung). Einfrieren) und tote Kontrolle (behandelt mit 75 % Ethanol). ND, nicht fertig. Zum Vergleich von Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Games-Howell-Post-hoc-Test verwendet, und es werden P-Werte aus informativen paarweisen Vergleichen angezeigt (n = 3–34 pro Gruppe; genaue Zahl in der Ergänzungstabelle 3). c: Konfokale Mikroskopbilder (AO/PI) von Maus-, SC-beta-, Schweine- und menschlichen Inseln aus Behandlungsgruppen, einschließlich Live-Kontrolle, VR und konventionell. d, TUNEL-gefärbte Bilder von Maus-, SC-beta- und menschlichen Inseln aus Behandlungsgruppen, einschließlich Live-Kontrolle, VR und konventionell. Das untere Feld zeigt die Annexin-V-Färbung von Mausinseln aus denselben Behandlungsgruppen. Die Maßstabsbalken repräsentieren 2 µm für TEM, 50 µm für Hellfeldbilder, 70 µm für Histologie- und TUNEL-Bilder und 100 µm für alle Fluoreszenzbilder. Die Daten werden als einzelne Datenpunkte und als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt

Als nächstes verwendeten wir die AO/PI-Färbung, um Veränderungen in der Lebensfähigkeit zu messen, die mit jeder Insel-Kryokonservierungstechnik verbunden sind. Qualitativ schienen VR-Inseln den lebenden Kontrollinseln ähnlich zu sein, wobei die Anzahl der roten (nekrotischen oder toten) Zellen (Abb. 4c und ergänzende Abb. 5) für jeden der vier Inseltypen nur geringfügig zunahm. Konventionell kryokonservierte Inseln zeigten viel mehr Zelltod. Nach der Kryokonservierung wurde ein separater Satz von Inseln in eine Einzelzellsuspension dissoziiert und pro Zelle auf ihre Lebensfähigkeit getestet (Abb. 4b). Die Lebensfähigkeit nach VR betrug im Vergleich zur Kontrolle 90,5 % bei Mäusen, 92,1 % bei SC-beta, 87,2 % bei Schweinen und 87,4 % bei Menschen. Die Lebensfähigkeit blieb über 9 Monate Kryokonservierung unverändert (88,3 % für Mausinseln und 91,8 % für SC-beta). Die konventionelle Kryokonservierung führte zu einer geringeren Lebensfähigkeit (59,1–62,2 %) als VR-Inseln.

Obwohl wir in erster Linie die Gesamtlebensfähigkeit der Inselzellen untersuchten, um speziell die Lebensfähigkeit von Insulin exprimierenden (Beta-)Zellen zu bewerten, haben wir intakte oder dissoziierte Inseln mit fixierbaren lebenden/toten Farbstoffen und Anti-Insulin-Antikörpern kogefärbt und dann die Lebensfähigkeit der Betazellen durch konfokale Mikroskopie (qualitativ) beurteilt Messungen, ergänzende Abbildung 6) und FACS (quantitative Messungen, ergänzende Abbildung 7) und stellten fest, dass sowohl insulinpositive als auch -negative Zellen ähnliche Lebensfähigkeiten zu haben schienen (Details in den ergänzenden Ergebnissen und in der Diskussion).

Zusätzlich zu dem beobachteten geringen Grad an Zelltod (PI+-Zellen) bei VR-Inseln beobachteten wir nach VR etwas mehr TUNEL+- und Zelloberflächen-Annexin-V+-Zellen im Vergleich zu frischen Kontrollinseln (Abb. 4d und ergänzende Abb. 8), was darauf hindeutet Sowohl Nekrose als auch Apoptose können zur allgemeinen Verringerung der Lebensfähigkeit um 8–12 % bei VR beitragen. Bei herkömmlich kryokonservierten Inseln wurden viel mehr TUNEL+- und Annexin V+-Zellen beobachtet. Im Vergleich zur herkömmlichen Kryokonservierung führte unsere VR-Technik zu erheblichen Verbesserungen bei der Erhaltung der Lebensfähigkeit und Morphologie der getesteten Inseltypen.

Da die durch Membranpermeabilitätsfarbstoffe gemessene Lebensfähigkeit einen nachlaufenden Indikator für die Funktionsstörung der Insel nach der Behandlung darstellt, haben wir versucht, andere Messgrößen für die Gesundheit der Inseln zu untersuchen, die die erwartete Inselfunktion nach der Kryokonservierung besser definieren könnten. Insbesondere die Stoffwechselgesundheit, insbesondere die Insel-OCR, ist prädiktiv für die Inselfunktion in vivo24,25. Wir untersuchten zunächst den ATP-Gehalt in Inseln unmittelbar nach der VR und stellten fest, dass der ATP-Gehalt zu diesem Zeitpunkt deutlich niedriger war als in Kontrollinseln (ergänzende Abbildung 9). Allerdings waren die ATP-Spiegel und andere Stoffwechselwerte (OCR und Mitochondrienmembranpotential) nach 3 Stunden Kultur weitgehend wiederhergestellt. Wir haben diesen Zeitpunkt für alle weiteren Beurteilungen genutzt.

Das mitochondriale Membranpotential in jedem der vier Inseltypen wurde durch Färbung mit Tetramethylrhodaminethylester (TMRE) sowie qualitative und quantitative konfokale Mikroskopie gemessen. Die Gesamtsignalintensität war bei VR-Inseln etwas geringer als bei der Lebendkontrolle (65,7–86,3 % der Kontrolle), aber unter Berücksichtigung des Gehalts an lebensfähigen Zellen betrug die TMRE-Intensität 75,1–93,7 % der Kontrolle (Abb. 5b, links). Der Unterschied in der TMRE-Intensität könnte auf eine langsamere Erholung in der Mitte der Inseln zurückzuführen sein, wo es eine gewisse zentrale Durchsichtigkeit gab. Dieses Erscheinungsbild schien sich mit einer 24-stündigen Kultur weiter zu verbessern (ergänzende Abbildung 9). Die TMRE-Färbeintensität für konventionell kryokonservierte Inseln betrug 37–42 % der Kontrollinseln (Abb. 5b).

a, Mitochondriales Membranpotential (über TMRE-Färbung) von Maus-, SC-beta-, Schweine- und menschlichen Inseln aus Behandlungsgruppen, einschließlich Lebendkontrolle, VR und konventionell. b, links: Quantifizierung der TMRE-Färbeintensität. Die gezeigten Vergleiche zwischen lebenden Kontroll- und Behandlungsgruppen wurden mit Kruskal-Wallis- und paarweisen Wilcoxon-Tests durchgeführt (n = 3–16 pro Gruppe). Rechts: Messung der ATP-Werte von vier Arten von Inseln aus lebenden und toten Kontrollgruppen und Kryokonservierungsgruppen (VR und konventionell). Zum Vergleich der Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Games-Howell-Post-hoc-Test verwendet, und es werden P-Werte aus informativen paarweisen Vergleichen angezeigt (n = 3–12/Gruppe). c, Beispiel-OCR-Kurve, die die Änderung der OCR während des Mito-Stresstests in SC-beta-Inseln zeigt und Lebendkontrollinseln, VR-Inseln, konventionelle Kryokonservierung und tote Kontrollinseln vergleicht (n = 5–8 pro Gruppe zu jedem Zeitpunkt). d, Zusammenstellung der metabolischen OCR-Parameter für jeden Inseltyp und jede Behandlungsgruppe. Zum Vergleich der Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test verwendet, und es werden signifikante (P < 0,05) paarweise Unterschiede gezeigt (n = 3–33 pro Gruppe). e, In-vitro-GSIS-Assay für Maus-, SC-beta- und menschliche Inseln aus Behandlungsgruppen, einschließlich Lebendkontrolle, VR und konventionell. Zum Vergleich der Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test verwendet, und es werden informative paarweise Vergleiche angezeigt (n = 3–12/Gruppe). In b, d und e sind relevante statistische Vergleichs-P-Werte in den Diagrammen enthalten. Maßstabsbalken, 100 µm. Die Daten werden als einzelne Datenpunkte und als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Für b–e ist die genaue Anzahl der Wiederholungen in der Ergänzungstabelle 3 zu finden. RLU, relative Lichteinheiten.

Die Anzahl und das Erscheinungsbild der Mitochondrien, die durch TEM von VR-Inseln beobachtet wurden, waren qualitativ den Kontrollinselzellen ähnlich (Abb. 4a, unten). Ähnlich wie bei den TMRE-Ergebnissen waren die gesamten ATP-Werte in VR-Inseln etwas niedriger als in den frischen Kontrollinseln (Abb. 5b, rechts). Diese Daten deuten darauf hin, dass die zelluläre Maschinerie zur Produktion von ATP intakt blieb, die ATP-Werte jedoch zum untersuchten Zeitpunkt noch nicht vollständig auf die Kontrollwerte zurückgekehrt waren.

Nachdem wir intakte Mitochondrien gezeigt hatten, untersuchten wir als Nächstes die Zellatmung, um festzustellen, ob VR-Inseln Sauerstoff verbrauchen, um ATP wiederherzustellen. Im Vergleich zu frischen Kontrollinseln zeigten VR-Inseln nach Stimulation mit Oligomycin (ATP-Synthase/Komplex-V-Inhibitor), Carbonylcyanid-4-trifluormetheoxyphenylhydrazon (FCCP) (Mittel zur Entkopplung der Mitochondrienmembran) und einer Mischung aus Rotenon ein ähnliches Muster der Veränderungen der OCR (Komplex-I-Inhibitor) und Antimycin A (Komplex-III-Inhibitor) (Abb. 5c). Konventionell kryokonservierte Inseln zeigten eine gedämpfte OCR-Stressreaktion. Beim Vergleich von VR mit frischer Kontrolle bei Maus-, Menschen- und SC-Beta-Inseln gab es keine Unterschiede in der OCR für die Basalatmung, die ATP-Produktion, das Protonenleck, die maximale Atmung, die freie Atmungskapazität und die nichtmitochondriale Atmung (Abb. 5d). Diese Daten legen nahe, dass VR-Inseln eine normale Stoffwechselfunktion aufrechterhalten, gemessen durch Zellatmung.

Wir führten GSIS-Tests durch, um festzustellen, ob die Inseln in vitro funktionsfähig waren. Mäuse-, SC-beta- und menschliche Inseln sezernierten Insulin als Reaktion auf eine Glukosebelastung und bei Mäusen und SC-beta zusätzlich mit vollständiger Depolarisierung unter Verwendung von KCl (Abb. 5e). Schweineinseln wurden nicht getestet. Menschliche Inseln zeigten bei Belastung mit hohem Glukosespiegel eine maximale Insulinfreisetzung, bei KCl jedoch keine weitere Freisetzung. Die Stimulationsindizes (Verhältnis des bei Exposition gegenüber hoher Glukosekonzentration freigesetzten Insulins zu niedriger Glukosekonzentration) für VR-Inseln jedes gemessenen Inseltyps unterschieden sich nicht von den Kontrollinseln. Herkömmlich kryokonservierte Inseln zeigten ebenfalls eine Insulinfreisetzung als Reaktion auf eine Glukosebelastung, jedoch in geringerem Maße. Diese Daten bestätigen, dass VR-Inseln in vitro lebensfähig, metabolisch aktiv und funktionsfähig sind.

Als abschließendes Maß für die Post-VR-Inselfunktion testeten wir Maus-, Schweine- und SC-Beta-Inseln in syngenen und xenogenen Maustransplantationsmodellen (Abb. 6). Syngene Mäuseinseln, die unter die Nierenkapsel transplantiert wurden, zeigten ihre Funktion und stellten die Normoglykämie innerhalb von 48 Stunden wieder her (Abb. 6a) und zeigten am 60. Tag nach der Transplantation eine intensive Insulinimmunfluoreszenzfärbung ähnlich den Kontrollinseln, ebenso wie Schweine- und SC-beta-Xenotransplantate bei immundefizienten, nicht adipösen Diabetiker-Scid -Il2rgc−/− (NSG)-Empfänger (Abb. 6b). Maus- und Schweineinseln wiesen ebenfalls eine intensive Glucagonfärbung auf, wenn auch möglicherweise mit einer leichten qualitativen Verringerung der Signalintensität im Vergleich zu Kontrollinseln. Wie erwartet zeigten SC-Beta-Transplantate eine schwache Glucagon-Färbung, da diese zu einer Beta-Zelllinie differenziert worden waren21,26. Konventionell kryokonservierte Inseln wiesen eine sehr geringe Intensität der Insulin- oder Glucagon-Färbung auf.

a, Blutzuckerspiegel von Streptozotocin-induzierten diabetischen Mäusen nach syngener Transplantation von Mäuseinseln mit marginaler Masse (250 Inseln pro Empfänger) aus Behandlungsgruppen, einschließlich Lebendkontrolle, VR, VR mit 9-monatiger kryokonservierter Lagerung (Inseln wurden 9 Monate lang in LN2 gelagert). ) und konventionelle Kryokonservierung (450 Inseln pro Empfänger). Alle paarweisen Vergleiche mit P-Wert < 0,05 werden angezeigt (*P < 0,05), bestimmt durch einfaktorielle ANOVA mit Games-Howell-Post-hoc-Test [(n = 10 (Kontrolle und konventionelle Kryokonservierung), 9 (VR), 1 ( VR-Teilfunktion) und 3 (9-Monats-Speicherung und VR)). b: Insulin- (rot) und Glucagon-Färbung (grün) in syngenen (Maus) und xenogenen (Schweine- und SC-beta) Maustransplantationsmodellen. Zu den Behandlungsgruppen der Inseln gehören Live-Kontrolle, VR und konventionell. Die 4′,6-Diamidino-2-phenylindol-Färbung (blau) ist in den zusammengeführten Bildern dargestellt. c, IPGTT von Wildtyp-Mäusen (WT), diabetischen Mäusen und diabetischen Mäusen, denen Lebendkontrolle, VR und konventionell kryokonservierte Inseln transplantiert wurden (links). Fläche unter der Kurve (AUC) von IPGTT (rechtes Feld). Die Gruppen wurden mittels einfaktorieller ANOVA und Tukey-Post-hoc-Test verglichen, und es werden nur informative paarweise Vergleiche angezeigt (n = 9–10 pro Gruppe). d, Xenotransplantation von SC-beta-Inseln in NSG-Mäusen mit nicht nüchternen Plasma-Humaninsulinspiegeln 4, 8 und 12 Wochen nach der Transplantation. e, Nach 14 Wochen, Plasmainsulinspiegel von NSG-Mäusen nach dem Fasten und 30 Minuten nach der stimulierten Insulinproduktion durch intraperitoneale Glukoseinjektion. Für d und e erfolgt der Gruppenvergleich mittels einfaktorieller ANOVA und Tukey-Post-hoc-Test mit informativen Vergleichen (n = 3–5/Behandlungsgruppe). Maßstabsbalken, 200 µm. Die Daten werden als einzelne Datenpunkte und als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Für c–e ist die genaue Anzahl der Replikate in der Ergänzungstabelle 3 zu finden.

Mithilfe eines xenogenen Transplantationsmodells testeten wir als nächstes die Funktion von SC-beta-Inseln in vivo. SC-Beta-Inseln wurden in nicht-diabetische NSG-Mäuse transplantiert und zufällige Serumproben wurden entnommen, um Humaninsulin 4, 8 und 12 Wochen nach der Transplantation zu messen (Abb. 6d). VR-Inseln sonderten während der 12 Wochen menschliches Insulin ab. Herkömmlich kryokonservierte SC-beta-Inseln wiesen eine nachweisbare Produktion von Humaninsulin auf, diese Werte unterschieden sich jedoch statistisch nicht von denen von Scheintransplantatempfängern. Nach 14 Wochen wurden die Empfängermäuse auf Fasten getestet und die Produktion von Humaninsulin durch intraperitoneale Glukoseinjektion stimuliert (Abb. 6e). Konventionell kryokonservierte Inseltransplantatempfänger hatten zwar nachweisbares Humaninsulin, es kam jedoch nach der Stimulation zu keinem Anstieg der Spiegel. Empfänger von VR-Inseln wiesen im nüchternen Zustand höhere Werte auf als künstlich oder konventionell kryokonservierte Inseln und zeigten nach der Stimulation einen 2,3-fachen Anstieg, was die SC-beta-Funktion in vivo bestätigte.

Als nächstes wurden frische Kontroll-, VR- und konventionell kryokonservierte Mausinseln in einem syngenen Inseltransplantationsmodell mit marginaler Masse (250 Inseln pro Empfänger) unter Verwendung von Streptozotocin-induzierten diabetischen Empfängern getestet. Insgesamt stellten VR-Inseln die Normoglykämie bei 92 % (11/12) der Empfänger innerhalb von 24–48 Stunden schnell wieder her (Abb. 6a). Bei der bivariaten Kaplan-Meier-Beurteilung unterschied sich die Zeit bis zur Normoglykämie nicht von der bei lebenden Kontroll-Inseltransplantatempfängern (Log-Rank-Test, P = 0,063). Ein Empfänger von VR-Inseln zeigte nur eine teilweise Funktion, möglicherweise aufgrund technischer Probleme (z. B. Austreten von Inseln aus der Nierenkapsel). Der Blutzucker dieses Empfängers fiel am 13. Tag nach der Transplantation unter 200 mg dl−1 und zeigte dann eine anhaltende moderate Hyperglykämie.

Im Gegensatz dazu gelang es konventionell kryokonservierten Inseln nicht, den Blutzucker (BZ) bei allen Empfängern zu normalisieren, selbst bei einer erhöhten Anzahl von Inseln (450 Inseln pro Empfänger). Bei einer Untergruppe der Transplantate wurde eine einseitige Nephrektomie der inseltransplantierten Niere durchgeführt (ergänzende Abbildung 10). Bei allen Mäusen entwickelte sich schnell eine Hyperglykämie, was bestätigte, dass die transplantierten Inseln und nicht die nativen Empfängerinseln die Blutzuckerspiegel kontrollierten.

Bei den syngenen Transplantationen war die Blutzuckerkontrolle für VR-Inseln äußerst streng. Die zufälligen BZ-Werte waren während des gesamten Posttransplantationsverlaufs (bis 150 Tage nach der Transplantation) nicht höher als die der Kontrollinseltransplantationen. Um das Ergebnis einer verlängerten Kryokonservierungszeit zu testen, haben wir Inseln vitrifiziert, sie 9 Monate lang in LN2 gelagert und dann wieder erwärmt. Diese langfristig gelagerten Inseltransplantationen zeigten auch eine schnelle Normalisierung des Blutzuckerspiegels und eine Glukosestabilität während der gesamten Nachbeobachtungszeit.

Um den Grad der Blutzuckerkontrolle zu demonstrieren, führten wir am 50. Tag nach der Transplantation einen intraperitonealen Glukosetoleranztest (IPGTT) durch (Abb. 6c). Es gab keine Unterschiede in den Glukose-Reaktionskurven (Abb. 6c, links) oder den Flächen unter den Kurven (Abb. 6c, rechts) für unbehandelte Wildtyp-Mäuse, frische Kontrollinseltransplantationen und VR-Transplantationen. Empfänger herkömmlich kryokonservierter Inselzellen zeigten eine ähnliche glykämische Reaktion wie Kontrollmäuse mit Diabetes.

Die Inselrückgewinnung unseres VR-Prozesses im Standardmaßstab (400–2.000 Inseln pro Test) betrug 96,8 ± 1,3 % für Mäuse (n = 26), 96,6 ± 1,7 % für SC-beta (n = 26) und 91,3 ± 3,4 % für Schweine ( n = 3) und 96,7 ± 1,5 % für menschliche (n = 6) Inseln (ergänzende Abbildung 11). Als wir auf den mittleren Durchsatz (2.500 Inseln pro Test) hochskalierten, betrug die Wiederfindung für Mausinseln 95,9 ± 1,2 % (Lebensfähigkeit 89,4 %, n = 3) und die Wiederfindung für SC-beta-Inseln 98,2 ± 1,1 % (n = 4). ). Schließlich betrug die Wiederherstellung in unserem ersten Proof-of-Concept-Test des SC-Beta-Insel-VR mit höherem Durchsatz (10.000 Inseln pro Test) 92,6 % (n = 1).

Da das Kryomesh-System für VR grundsätzlich eindimensional ist, ist die Skalierung in der x- und y-Dimension theoretisch nur durch die Behältergeometrie begrenzt. Für diese Experimente wurden Inseln auf einem 2 cm × 2 cm großen Netz mit bis zu 4.250 Inseln pro cm2 vitrifiziert. Um einen klinisch bedeutsamen Durchsatz zu erreichen, könnten Einheiten von 100.000 Inseln auf 24 cm2 großen Kryomeschen konserviert werden.

Die Transplantation einer ausreichenden Anzahl hochwertiger, lebensfähiger und funktionsfähiger Pankreasinseln bei einem Diabetiker kann diese immer häufiger auftretende und zunehmend schwächende Krankheit heilen. Eine wesentliche Einschränkung, die sich auf den Erfolg der Inseltransplantation auswirkt, ist das Fehlen einer bedarfsgerechten Versorgung mit einer ausreichenden Anzahl hochwertiger nativer oder SC-abgeleiteter Inseln. Diese Einschränkung wird durch die Unfähigkeit, diese Zellprodukte vor der Verwendung zu lagern, noch verschärft. Hier zeigen wir zum ersten Mal eine wirksame Methode zur langfristigen Inselerhaltung, die gleichzeitig eine hohe Lebensfähigkeit, Wiederherstellung, Funktion und Skalierbarkeit erreicht. Eine solche Methode zur Speicherung von Pankreasinseln durch Kryokonservierung könnte die Lieferkette für die Inselisolierung, -zuteilung und -lagerung vor der Transplantation revolutionieren, die Gesamtverwertung der Bauchspeicheldrüsen verstorbener Spender erhöhen und mehr Patienten mit Diabetes heilen.

Frühere Studien untersuchten sowohl die herkömmlichen Methoden (langsames Abkühlen) als auch die Vitrifikation (schnelles Abkühlen) für die Kryokonservierung von Inseln und erzielten dabei unterschiedliche Erfolgsgrade (Ergänzungstabelle 1). Beispielsweise demonstrierten Rajotte et al.27,28 und andere Gruppen29,30 die konventionelle Kryokonservierung von Inseln mit einem Standard-CPA (2 M DMSO), erreichten jedoch nur eine geringe bis mäßige Lebensfähigkeit und Funktion und bei begrenztem Durchsatz (10–100 Inseln). Verbesserungen im Protokoll (d. h. andere CPA) führten zu einer besseren Funktion31,32 oder einem besseren Durchsatz (≥10.000 Inseln)33,34, aber nicht zu beidem gleichzeitig. Die konventionelle Kryokonservierung wurde in begrenzten klinischen Studien getestet35, wurde jedoch nie vollständig übernommen, was teilweise auf die Verwendung von fötalem Rinderserum zurückzuführen ist, das mit dem Risiko einer zoonotischen Infektion verbunden ist. Mittlerweile haben mehrere Gruppen die Vitrifikation (d. h. eisfreie Kryokonservierung) als günstige Alternative zur Verbesserung der Lebensfähigkeit und Funktion getestet23,36,37,38,39. Erste Studien zeigten einen prinzipiellen Nachweis, jedoch mit geringem Inseldurchsatz (50–300 Inseln) und teilweiser Funktion23,40. Durch die Änderung der Systemgeometrie durch den Einsatz von Tröpfchen41, Hohlfasern39 oder Netzträgern37,38 verbesserten andere Gruppen die Kühl- und Heizraten und erzielten geringfügige Funktionsverbesserungen, jedoch auf Kosten eines geringeren Durchsatzes (häufig nur 25–100 Inseln gleichzeitig). ).

Zusätzlich zur Wirksamkeit bei der Kryokonservierung frisch isolierter Pankreasinseln von Mäusen, Schweinen und Menschen erwies sich der VR-Ansatz auch für SC-abgeleitete menschliche Inseln als wirksam. SC-Beta-Inseln stellen eine vielversprechende Quelle menschlicher Zellen für den Betazellersatz dar und demonstrieren in vitro eine auf Glukose reagierende Insulinsekretion und eine langfristige Blutzuckerkontrolle in diabetischen Mausmodellen21,42. Derzeit werden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um die SC-basierte Betazelltechnologie zu verbessern und so eine robuste physiologische Funktion zu erreichen. effiziente und kostengünstige Differenzierungsmethoden schaffen; und die Ergänzung endokriner Zellen verbessern (d. h. mit einer Mischung aus Alpha- und Betazellen produzieren)43,44. Dennoch ist weiterhin eine solide Versorgung mit qualitativ hochwertigen SC-Beta-Inseln erforderlich, wie sie beispielsweise durch Kryokonservierung ermöglicht werden, um eine Standardverfügbarkeit für eine künftige klinische Anwendung zu gewährleisten. Unsere Kryokonservierungsmethode stellt eine mögliche Lösung dar und zeigt eine hohe Lebensfähigkeit (92,1 %) sowie In-vitro- und In-vivo-Funktionalität von SC-beta-Inseln, selbst nach 9-monatiger Lagerung in LN2. Eine Langzeitlagerung würde die Immunmanipulation potenzieller Empfänger ermöglichen, eine umfassende Kontrolle der Inselqualität vor der Transplantation ermöglichen und die Kosteneffizienz steigern, indem große Chargen in funktionsfähigen Einzelpatienteneinheiten kryokonserviert werden könnten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unser neues Kryokonservierungsprotokoll ein wirksames Mittel zur Verbesserung der SC-Beta-Insel-Lieferkette sein könnte und dadurch die Therapieoptionen für Diabetiker erweitert.

Sowohl für SC-Beta-Inseln als auch für Inseln verstorbener Spender ist die Skalierbarkeit der Kryokonservierungsmethode von entscheidender Bedeutung. Eine weitere Skalierung unseres Ansatzes für einen klinisch bedeutsamen Durchsatz (dh ≥ 100.000 Inseln) kann durch die Verwendung größerer Kryonetzgrößen und alternativer Formfaktoren wie Netzstapelung erreicht werden (ergänzende Abbildung 12). Bei einer größeren Kryonetzgröße bleiben die Kühl- und Wiedererwärmungsflüsse und die thermische Masse (pro Flächeneinheit) unabhängig von der Maschengröße und -form, wenn das Netz schnell und gleichmäßig eingetaucht wird, sofern die Kühl-/Wiedererwärmungsbäder ausreichend dimensioniert sind (d. h , größer als das Kryonetz) und das Aufwärmbad wird gerührt. Darüber hinaus „klebt“ die verbleibende CPA-Lösung (die aufgrund der Oberflächenspannung mitgerissen wird) zwischen den Inseln und dem Kryomesh die Inseln vorübergehend am Kryomesh und die Inseln lösen sich während der Lagerung in LN2 nicht vom Cryomesh.

Unsere Ergebnisse legen den Grundstein für die zukünftige klinische Kryokonservierung von Inselzellen und legen nahe, dass bei der Kryokonservierung von Maus-, Schweine-, Menschen- und SC-beta-Inseln gleichzeitig eine hohe Lebensfähigkeit, Funktionalität (in vitro und in vivo) und Skalierbarkeit erreicht werden kann. Weitere Anstrengungen sind erforderlich, um die Einschränkungen unseres Ansatzes zu beseitigen, einschließlich der CPA-Optimierung für menschliche Inseln. weitere Charakterisierung der Stress-, Anpassungs- und Verletzungsreaktionen von Inseln; Skalierung auf einen Durchsatz von >300.000 Inseln pro Charge (typische Ausbeuten für die Einzelspenderisolierung liegen bei <300.000 IEQs5); und Anpassung an die Verarbeitung auf klinischem Niveau (Einzelheiten in den ergänzenden Ergebnissen und in der Diskussion). Wir glauben, dass jede dieser Einschränkungen in der zukünftigen Entwicklung problemlos überwunden werden kann.

Die Auswirkungen einer erfolgreichen Methode zur Kryokonservierung von Inseln vor der Transplantation sind tiefgreifend. Eine solche Technologie bietet die folgenden Vorteile: (1) verbesserte Wirksamkeit durch gepoolte Hochdosis-Spenderinseltransplantationen; (2) bessere Möglichkeiten zur Qualitätskontrolle und -bewertung; (3) bessere Patientenvorbereitung durch Umwandlung einer ungeplanten Operation in ein geplantes Ereignis; (4) verringertes Risiko durch die Verwendung einer einzelnen Inselinfusion anstelle wiederholter Infusionen; (5) verbesserte Möglichkeiten für den HLA-Abgleich von Spender und Empfänger durch Auswahl aus einer Reihe verfügbarer Optionen, anstatt den nächsten Spender in der Reihe zu verwenden; (6) erleichterte Toleranzinduktionsprotokolle, die eine Vorkonditionierung des Empfängers vor Transplantationen erfordern, wie z. B. Toleranz, die durch Infusion apoptotischer Spenderleukozyten erreicht wird45 oder gemischter Chimärismus mit Inseln und vom Spender stammendes hämatopoetisches SC-Transplantat; und (7) verbesserte Organnutzung durch Förderung der Inselisolierung und -sammlung bei allen geeigneten Spendern und nicht nur bei „optimalen“ Spendern, die in der Vergangenheit ausgewählt wurden, um die Erträge in der Hoffnung auf Einzelspendertransplantationen zu maximieren.

Institutionelle Tierpflege- und Nutzungsausschüsse der University of Minnesota (Protokoll 1905-37028A) und der Mayo Clinic (Protokoll A00003973) genehmigten die Tierversuche. Die Mäuse wurden mit einem 14-stündigen Ein-/10-stündigen Aus-Lichtzyklus, einer Umgebungstemperatur von 68–74 °F und einer Luftfeuchtigkeit von 30–70 % in spezifischen pathogenfreien (für NSG-Mäuse) oder konventionellen (für C57BL/6-Mäuse) Einrichtungen gehalten .

Mausinseln wurden aus C57BL/6-Züchterinnen im Ruhestand (Alter nicht angegeben, Charles River Laboratories) durch Kollagenase-Verdau (CIzyme RI, VitaCyte) und Dichtegradientenanreicherung mit Histopaque (Millipore Sigma) isoliert46. Anschließend wurden die Inseln handverlesen und vor der Verwendung 16 Stunden lang in einem Bioreaktor (ABLE-Biott-Reaktor, BWV-S03A) in S3-Medium kultiviert. Menschliche Inseln wurden von einem kommerziellen Anbieter (Prodo Laboratories) gekauft und vor der Verwendung bis zu 7 Tage lang in PIM(S) Complete-Medien (Prodo Laboratories) kultiviert. Schweineinseln wurden aus erwachsenen Landrassenschweinen isoliert47.

HUES8-Zellen wurden als Sphäroide in 500-ml-Spinnerflaschen (Corning, 3153)21 kultiviert. Suspensionskulturen wurden durch Aussäen von 150 Millionen Zellen (5 × 105 Zellen ml-1) in mTeSR1-Medium (STEMCELL Technologies, 85850) mit 10 µM Y27632 (R&D Systems, 1254) hergestellt und bei 70 U/min im befeuchteten Inkubator bei 37 °C gehalten , 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit. Das Medium wurde nach 48 Stunden auf mTeSR1 ohne Y27632 geändert. Die Zellen wurden alle 72 Stunden passagiert, indem sie unter Verwendung von Accutase (Millipore Sigma, A6964) mit mechanischem Aufschluss in einzelne Zellen dispergiert und in frischem mTeSR1 mit Y27632 resuspendiert wurden.

SC-Beta-Differenzierungen wurden nach 3 Tagen SC-Sphäroidbildung und -expansion in mTeSR1-Medien in einem Spinnerkolben eingeleitet21,26. Man ließ die Cluster durch Schwerkraft absetzen und das Medium wurde durch protokollspezifisches Medium einschließlich geeigneter Wachstumsfaktoren ersetzt. Die Zelldifferenzierung erfolgte nacheinander auf das definitive Endoderm, den primitiven Darmschlauch, den Pankreas-Vorläufer 1, den Pankreas-Vorläufer 2, die endokrinen Vorläufer und schließlich auf SC-beta26. Basale Medientypen (S1, S2, S3 und BE5) wurden durch induktive Signale ergänzt (Einzelheiten in den ergänzenden Methoden). Die SC-beta-Inseln wurden durch Durchflusszytometrie charakterisiert (Einzelheiten in den ergänzenden Methoden).

Die zur Messung der biophysikalischen Inselparameter verwendeten Mikrofluidikgeräte wurden mithilfe von Softlithographieverfahren hergestellt (Einzelheiten unter „Ergänzende Methoden“). Handverlesene Inseln wurden retrograd durch das Auslassloch in das Gerät eingeführt. Nach Einleiten des antegraden Flusses unter Verwendung von Inselmedien wurde CPA/Salzlösung der gewünschten Konzentration über eine Spritzenpumpe geladen. Für CPAs wurden 15 Gew.-% EG, PG und DMSO, hergestellt in RPMI, verwendet. Als Salzlösungen wurden 1,8 %, 2,7 %, 3,6 % und 4,5 % Natriumchlorid, zubereitet in entionisiertem Wasser, verwendet. Nachdem sich die Insel auf dem Kanalboden niedergelassen hatte, wurde die Durchflussrate der CPA/Salzlösung schrittweise erhöht und gleichzeitig die Bewegung und Rotation der Insel minimiert. Der Lösungsfluss wurde gestoppt, nachdem mindestens fünf Gerätevolumina Lösung durch das Gerät gepumpt worden waren. Bei Experimenten, die bei 4 °C durchgeführt wurden, wurde das gesamte Experiment in einem Kühlraum mit derselben Temperatur durchgeführt. Änderungen der Inselquerschnittsfläche wurden aufgezeichnet und mit MATLAB analysiert, um Änderungen des sphärischen Inselvolumens abzuschätzen.

Ein Zwei-Parameter-Modell unter Verwendung von Lp (hydraulische Leitfähigkeit, auch Wasserpermeabilität genannt) und ω (CPA-Permeabilität) wurde angewendet, um die experimentellen Schrumpf-Quelle-Daten anzupassen48. Die Annahmen sind in den ergänzenden Materialien detailliert beschrieben. Das osmotisch inaktive Zellvolumen Vb wurde anhand der Boyle-van't-Hoff-Beziehung49 bestimmt. Die Boyle-van't-Hoff-Gleichung korreliert das Zellgleichgewichtsvolumen mit der Osmolalität der nichtpermeierenden Lösung wie folgt:

Dabei ist V das Zellgleichgewichtsvolumen, V0 das isotonische Zellvolumen, Vb der osmotisch inaktive Volumenanteil der Zelle, π0 die isotonische Osmolalität und π die Osmolalität der nichtpermeierenden Lösung.

MATLAB wurde verwendet, um Lp und ω der Maus- und SC-beta-Inseln aus den experimentellen Schrumpfungs-Schwellungs-Kurven anzupassen. Die Modellierung der Änderung des Inselvolumens und der intrazellulären CPA basiert auf dem von Kleinhans48 vorgeschlagenen „entkoppelten“ Zwei-Parameter-Modell wie folgt:

wobei V und A das Inselvolumen bzw. die Oberfläche sind; nC ist die Anzahl der Mol CPA innerhalb der Insel; R ist die Gaskonstante; T ist die absolute Temperatur; Lp und ω sind die hydraulische Leitfähigkeit bzw. Membranpermeabilität für CPA; und C ist die Molalität. Die hochgestellten Zeichen i und e bezeichnen intrazellulär bzw. extrazellulär. Die Indizes C und S bezeichnen durchdringendes CPA bzw. nichtdurchdringende gelöste Stoffe.

Die Kryokonservierung der Inseln erfolgte über einen leicht modifizierten Ansatz des langsamen Einfrierens, der auf dem zuvor von Rajotte et al.50 etablierten Protokoll basierte. In der CPA-Lösung war kein fötales Rinderserum oder fötales Kälberserum enthalten. Bei 21 °C wurde der Inselsuspension DMSO zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2 M in einem Kryoröhrchen zu erreichen. Nach einer 25-minütigen Inkubation mit DMSO wurde das Kryoröhrchen 5 Minuten lang in ein Ethanolbad mit –7,5 °C gestellt. Ein Metallstab wurde in LN2 gekühlt und dazu verwendet, Eis durch Berühren der Suspension im Kryoröhrchen zu säen. Nach 15-minütiger Freisetzung der latenten Fusionswärme wurde das Kryoröhrchen unter Verwendung eines Gefrierschranks mit kontrollierter Geschwindigkeit (Kryo 560, Planer Limited) mit 0,25 °C pro Minute auf –40 °C abgekühlt und dann in LN2 getaucht. Das Auftauen erfolgte mit einem 37 °C warmen Wasserbad. Die aufgetauten Inseln wurden 30 Minuten lang bei 0 °C in 0,75 M Saccharose gelegt, um das intrazelluläre CPA zu entfernen.

Das verwendete CPA in voller Stärke bestand aus 22 Gew.-% EG + 22 Gew.-% DMSO, hergestellt in RPMI-Medium. Um die CPA zu laden, wurden die Inseln zunächst 10 Minuten lang bei 21 °C in 20 % CPA (d. h. 4,4 Gew.-% EG + 4,4 Gew.-% DMSO) inkubiert, gefolgt von 10 Minuten lang 50 % CPA bei 4 °C und in 100 % CPA. CPA für 10 Min. bei 4 °C. Die Inselsuspension wurde dann auf das Kryonetz übertragen, das auf einem feuchtigkeitsableitenden Material (d. h. einem Papiertuch) lag. Die CPA-Lösung wurde durch das Nylonnetz abgesaugt und auf dem Kryonetz verblieben Inseln. Eine Verklumpung der Inseln wurde vermieden. Das Kryonetz wurde schnell in LN2 getaucht und in einem LN2-Tank gelagert. Um die Inseln aufzutauen, wurde das Kryomesh zur CPA-Entfernung schnell in die Wiedererwärmungslösung getaucht, die aus 11 Gew.-% EG, 11 Gew.-% DMSO und 5 Gew.-% Saccharose bei 4 °C bestand. Nach 10 Minuten wurde die Aufwärmlösung mit eiskalter 10 Gew.-%iger Saccharoselösung zweifach verdünnt und die Inseln weitere 10 Minuten bei 4 °C inkubiert. Die Inseln wurden dann auf 21 °C gebracht und die Suspension wurde mit 10 Gew.-%iger Saccharoselösung zweifach verdünnt. Nach 5 Minuten wurden die Inseln als letzter CPA-Entfernungsschritt für 15 Minuten wieder in RPMI-Medium gelegt. Zu diesem Zeitpunkt lösten sich alle Inseln vom Nylonnetz.

Unter Verwendung des gleichen CPA-Ladeverfahrens wie beim Cryomesh-VR-Ansatz wurden 10–20 Inseln in einem 2-µl-Tröpfchen eingeschlossen und auf dem Kryotop platziert. Das Kryotop wurde zur Vitrifizierung schnell in LN2 getaucht. Der Wiedererwärmungs- und CPA-Entfernungsprozess war derselbe wie im Cryomesh VR.

Ein 2-µl-Tröpfchen, einschließlich 10–20 Inseln, wurde zur Vitrifizierung auf eine in LN2 schwimmende Kupferschale getropft. Der verglaste Tropfen wurde in der Entladelösung konvektiv erneut erwärmt. Die Schritte zur CPA-Entfernung wurden dieselben wie beim Cryomesh-VR-Ansatz beibehalten.

Dem Tröpfchen wurden Goldnanostäbe (nanoComposix) zugesetzt, um eine Konzentration von 2,8 × 1010 Teilen ml−1 zu erreichen. Nach der Vitrifizierung der Insel und des in Goldnanostäbchen eingebetteten Tröpfchens (2 µl) auf der vorgekühlten Kupferschale wurde ein 1064-nm-Pulslaser verwendet, um das Tröpfchen erneut zu erwärmen17. Die Pulslänge betrug 7,5 ms und die Laserspannung 250 V. Mit einer Hochgeschwindigkeitskamera (Nac Image Technology, Q1v) wurde der Lasererwärmungsprozess mit 4.000 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet.

Die Ultrastrukturen der Inseln wurden mittels TEM analysiert. Kurz gesagt, die Inseln wurden in 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumkacodylatpuffer (pH 7,4) über Nacht bei 4 °C fixiert und 1 Stunde lang in 2 % wässrigem Osmiumtetroxid nachfixiert und in allmählichem Ethanol (30 % bis 100 %) und Propylenoxid dehydriert , eingebettet in Epon812 und 48 h bei 60 °C ausgehärtet. Anschließend wurden ultradünne 65-nm-Schnitte auf 200-Mesh-Kupfergittern gesammelt und vor der TEM-Untersuchung mit Uranylacetat (15 Min.) und Bleicitrat (2 Min.) angefärbt. Die Bilder wurden mit einem FEI Tecnai G2 Spirit Transmissionselektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific) aufgenommen.

Die qualitative Messung der Lebensfähigkeit intakter Inseln wurde mit AO und PI durchgeführt. Intakte Inseln wurden 2 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 8 ng ml AO und 20 ng ml PI (Millipore Sigma) angefärbt, abgedeckt und unter Verwendung eines inversen konfokalen Olympus Fluoview 3000-Mikroskops (Olympus) mit 502/525-nm-Filtern abgebildet für AO und 493/636-nm-Filter für PI. Die Bilder wurden mit einer Auflösung von 4.020 × 4.020 Pixel und einem Objektiv mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen. Beachten Sie, dass die Inseldurchmesser in allen konfokalen Bildern, hier und während der gesamten Studie, aufgrund der Deckglaskomprimierung erhöht werden, die zur Erhöhung der effektiven Bildtiefe verwendet wird.

Die quantitative Lebensfähigkeit wurde an dissoziierten Inselzellen gemessen. Nach der Inselbehandlung wurden die Inseln in einem dynamischen Kulturkolben bei 70 U/min, 37 °C und 5 % CO2 3 Stunden lang in S3-Medium inkubiert. Die Inseln wurden in TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific, 12605010) in Einzelzellsuspensionen dissoziiert, mit S3, das fötales Rinderserum enthielt, gequencht und mit 8 ng ml–1 AO plus 20 ng ml–1 PI angefärbt. Nach 15 s Inkubation wurden 10 µl der Suspension auf die Countess Cell Counting Chamber Slides (Thermo Fischer Scientific, C10228) pipettiert und die Lebensfähigkeit mit einem Countess II FL-Zellzähler (Invitrogen von Thermo Fisher Scientific, AMQAF1000) quantifiziert. Die Genauigkeit der dissoziierten quantitativen Lebensfähigkeitsmesstechnik wurde durch den Vergleich der Werte mit denen validiert, die durch Bildanalyse von 3D-Rekonstruktionen konfokaler Bilder von AO/PI-gefärbten intakten Inseln erhalten wurden.

Vor der Durchführung des Tests wurden die erhaltenen Inselcluster in einem dynamischen Kulturkolben bei 70 U/min, 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Inseln wurden mit 25 µl 50 ng ml-1 rekonstituiertem TMRE, Perchlorat (Biotium, 70005) bei Raumtemperatur für 1 Minute und 45 Sekunden auf Objektträgern angefärbt, mit einem Deckglas versehen (Chase Scientific, ZA0294) und mit einem Konfokalgerät Olympus Fluoview 3000 abgebildet inverses Mikroskop (Anregungs-/Emissionsfilter: 594/574 nm). Die Bilder wurden mit einer Auflösung von 4.020 × 4.020 und einem Objektiv mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen. Das Membranpotential der Insel wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität mit der Olympus CellSens Dimension-Software (v1.17) quantifiziert.

Die Inseln wurden vor jedem Assay in einem dynamischen Kulturkolben bei 70 U/min, 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Inseln in Standardgröße (~150 µm) wurden handverlesen und drei IEQs pro Vertiefung in jede Vertiefung von schwarzen 96-Well-Platten (Greiner Bio-One, 89131-680) in 50 µl RPMI bei 37 °C gegeben. Anschließend wurden jeder Vertiefung 50 µl vorgewärmtes Promega CellTiter-Glo 3D-Zelllebensfähigkeitsreagenz zugesetzt. Als Positivkontrolle und zur Kalibrierung der Ergebnisse wurde ATP-Standard (Roche) verwendet. Die Platte wurde versiegelt, mit Aluminiumfolie abgedeckt und 5 Minuten lang bei 80 U/min bei Raumtemperatur auf einen Orbitalschüttler gestellt. Anschließend wurde die Platte 25 Minuten lang ohne Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Erfassung der Lumineszenz wurde ein BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader verwendet, der mit der BioTek Gen5-Software analysiert und als relative Lichteinheiten pro IEQ angegeben wurde.

Die Inseln wurden in einem dynamischen Kulturkolben bei 70 U/min, 37 °C und 5 % CO2 3 Stunden lang inkubiert, bevor der Test durchgeführt wurde. Die Zellatmung wurde mit dem Agilent Seahorse XF Mito Stress Test und Agilent SeaHorse xFe24 Islet Capture FluxPak (Agilent, 103418-100) Platten und Gittern gemessen. Die Inseln wurden von Hand in ausreichender Anzahl in Vertiefungen mit 500 µl Kulturmedium gepflückt, um 50 % des inneren Kreises jeder Probenvertiefung abzudecken. Der Inselfangschirm wurde sorgfältig und sicher auf der Platte befestigt. Die Inseln wurden zweimal mit SeaHorse-Medium (SeaHorse Die Testreagenzien wurden in eine zuvor hydrierte Sensorkartusche geladen. Die Testplatte wurde in einen kalibrierten Agilent SeaHorse xFe24-Analysator eingesetzt und der Mito-Stresstest wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers mit den folgenden optimierten Reagenzkonzentrationen durchgeführt: Mausinseln (5 µM Oligomycin, 1 µM FCCP und jeweils 10 µM Rotenon und Antimycin A ), SC-beta-Inseln (10 µM Oligomycin A, 2 µM FCCP und je 10 µM Rotenon und Antimycin A), menschliche Inseln (50 µM Oligomycin A, 10 µM FCCP und je 10 µM Rotenon und Antimycin A) und Schweine-Inseln (50 µM Oligomycin A, 2,5 µM FCCP und je 10 µM Rotenon und Antimycin A). OCR-Werte wurden über 200 Minuten ermittelt. Wenn die Probenahmerate zwischen den Platten unterschiedlich war, wurde der Zeitverlauf über den Standardbeobachtungszeitraum skaliert.

Zur Normalisierung zwischen den Vertiefungen wurden die Inseln in jeder Vertiefung in 1 M Ammoniumhydroxid + 0,2 % Triton X-100 lysiert. Der DNA-Gehalt wurde mit dem PicoGreen-Assay (Molecular Probes) unter Verwendung standardisierter Kalibrierungskontrollen zur Quantifizierung auf einem BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek) gemessen. Einzelne Zellatmungsparameter, einschließlich OCR für Basalatmung, ATP-Produktion, Protonenleck, maximale Atmung, freie Atmungskapazität und nichtmitochondriale Atmung, wurden berechnet und auf den für einzelne Wells erhaltenen DNA-Gehalt normalisiert.

Die erhaltenen Inselcluster wurden in einem dynamischen Kulturkolben bei 70 U/min, 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bevor der Test durchgeführt wurde. Gemäß dem Protokoll des Herstellers wurden apoptotische Zellen mit dem ApopTag Peroxidase in situ Apoptosis Detection Kit (Millipore Sigma, S7100) gefärbt. Nach dem Färben und Waschen wurde der Objektträger durch Dehydrieren mit Xylol montiert und ein Deckglas mit Eindeckmedium aufgetragen. Die Anzahl der apoptotischen Zellen in jeder Insel wurde unter einem Lichtmikroskop gezählt.

Die erhaltenen Inselcluster wurden in einem dynamischen Kulturkolben bei 70 U/min, 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bevor der Test durchgeführt wurde. Dann wurde 5× Annexin V-Bindungspuffer (Biotium, 99902) in entionisiertem Wasser verdünnt, um 1× Bindungspuffer zu erhalten. Die Inseln wurden zweimal mit 1× Bindungspuffer gewaschen. Die Färbelösung wurde durch Verdünnen des Annexin V-Konjugats in 1× Bindungspuffer auf eine Endkonzentration von 2,5 µg ml−1 hergestellt und mit den Inseln lichtgeschützt 15–30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inseln wurden dann dreimal mit 1×-Bindungspuffer gewaschen und innerhalb von 30 Minuten mit dem konfokalen Umkehrmikroskop Olympus Fluoview 3000 mit einer Anregung/Emission von 490/515 nm unter einem 20×-Objektiv abgebildet. Das Ca2+-Phospholipid-bindende Protein mit einer hohen Affinität für Phosphatidylserin wurde durch Gating der Falschfarben-Mapping-Fluoreszenz mit der Olympus CellSens Dimension-Software (v1.17) quantifiziert und statistisch analysiert.

GSIS-Assays wurden durchgeführt, um die In-vitro-Funktion von Inseln zu bewerten26. Kurz gesagt, die Inseln wurden zweimal in Krebs-Ringer-Puffer (KRB) mit niedrigem Glucosegehalt (3,3 mM Glucose) (128 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,7 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3) gewaschen. 10 mM HEPES und 0,1 % FAF-BSA in entionisiertem Wasser). Die Inseln wurden dann in Transwell-Einsätze mit 24 Vertiefungen (Millicell, Zellkultureinsatz, PIXP01250) geladen und 1 Stunde lang bei 37 ° C in KRB mit niedrigem Glucosegehalt gefastet. Die Inseln wurden einmal in KRB mit niedrigem Glucosegehalt gewaschen und dann 1 Stunde lang bei 37 ° C in KRB mit niedrigem Glucosegehalt inkubiert. Das Volumen des KRB mit niedrigem Glucosegehalt, hohem Glucosegehalt und KCl betrug 1 ml pro Vertiefung. Nach der Inkubation wurde der Überstand gesammelt und bis zur Analyse bei –20 °C gelagert. Die Inseln wurden dann 1 Stunde lang bei 37 °C in KRB mit hohem Glucosegehalt (16,7 mM) überführt, und der Überstand wurde gesammelt und gelagert. Die Inseln wurden dann auf KRB mit niedrigem Glucosegehalt mit 30 mM KCl übertragen, um die Depolarisationsbedingungen zu beobachten, und in diesem Puffer 1 Stunde lang inkubiert, und der Überstand wurde gesammelt. Schließlich wurden die Inseln durch Inkubation mit TrypLE dispergiert und unter Verwendung eines automatischen Countess-Zellzählers (Thermo Fisher Scientific) gezählt. Die gesammelten Überstände wurden durch einen enzymgebundenen Immunosorbens-Assay auf Humaninsulinkonzentrationen (ALPCO, 80-INSHUU-E01.1) analysiert und hinsichtlich der Zellzahl normalisiert. Das Inselinsulin der Maus wurde mittels HTRF-Assay (homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz) (Cisbio PerkinElmer, 62IN1PEG) gemessen.

C57BL/6-Mäuse (6 bis 8 Wochen alte Männchen, Charles River Laboratories) wurden durch intraperitoneale Injektion einer Einzeldosis (220 mg kg−1) Streptozotocin (Millipore Sigma, S0130) diabetisch gemacht. Der Blutzuckerspiegel wurde nach 4–7 Tagen gemessen und Diabetes wurde durch zwei aufeinanderfolgende tägliche Messungen von >400 mg dl−1 bestätigt. Unter der linken Nierenkapsel der Empfängermaus wurden marginale Inselzelltransplantationen von 250 Inseln pro Empfänger51 durchgeführt. Für alle Behandlungsgruppen wurden Inseln nach dem Zufallsprinzip zur Transplantation ausgewählt, darunter Inseln aller Größen, sowohl morphologisch gestörte als auch intakte Inseln. Blutzuckermessungen wurden täglich durchgeführt. Der Transplantationserfolg wurde am ersten Tag von zwei aufeinanderfolgenden täglichen Messungen von BZ < 200 mg dl−1 gemessen. Als Transplantatversagen wurde der erste Tag von zwei aufeinanderfolgenden Messungen von >250 mg dl−1 definiert.

Am 50. Tag nach der Transplantation wurde IPGTT durchgeführt, indem Mäuse 16 Stunden lang (über Nacht) fasten ließen und dann 2,5 g kg-1 Glucose intraperitoneal injizierten und der Blutzuckerspiegel alle 15 Minuten 150 Minuten lang gemessen wurde.

Um zu bestätigen, dass die transplantierten Inseln den Blutzuckerspiegel kontrollierten und nicht zu einer Wiederherstellung der nativen Betazellfunktion führten, wurde für eine Untergruppe der Transplantationen am 60. Tag nach der Transplantation eine linke Nephrektomie (einschließlich Inseltransplantation) durchgeführt und das Wiederauftreten einer Hyperglykämie überprüft. Explantate vom Tag 60 wurden fixiert und auf Insulin und Glucagon gefärbt.

SC-beta- und Schweineinseln wurden unter die Nierenkapsel nichtdiabetischer 6 bis 12 Wochen alter männlicher (NSG) Mäuse transplantiert (Jackson Laboratory)21. Kurz gesagt, Inselcluster mit insgesamt 5 × 106 Zellen wurden unter die Nierenkapsel männlicher NSG-Mäuse injiziert. Kontrollmäuse wurden einer Scheinoperation unterzogen, bei der Kochsalzlösung in die Nierenkapsel injiziert wurde. Nach der Transplantation wurden Gesichtsblutungen in den Wochen 4, 8 und 12 durchgeführt, um den Humaninsulinspiegel zu messen. 14 Wochen nach der Transplantation wurde eine modifizierte IPGTT durchgeführt. Die Mäuse ließen 16 Stunden lang fasten und Blut wurde vor und 30 Minuten nach der intraperitonealen Injektion von 2,5 g/kg Glucosebolus gesammelt. Das Serum wurde mithilfe von Mikrovetten (Sarstedt, 20.1292.100) vom Blut getrennt und Humaninsulin wurde mithilfe des Enzymimmunoassays (ALPCO, 80-INSHUU-E01.1) für ultraempfindliches Insulin beim Menschen quantifiziert. Nach der IPGTT wurden die transplantathaltigen Nieren explantiert und auf Insulin und Glucagon gefärbt.

Für Schweine-Insel-Xenotransplantationen wurden 350 Inseln unter die Nierenkapsel von NSG-Mäusen (männlich oder weiblich, Alter 6–12 Wochen) transplantiert. 60 Tage nach der Transplantation wurden die transplantathaltigen Nieren entnommen, fixiert und auf Insulin und Glucagon gefärbt.

Geborgene Nieren mit transplantierten Inseln unter der Nierenkapsel wurden in 70 % alkoholischem Formalin (BBC Biochemical, 0460) fixiert und in Paraffinblöcke eingebettet. Anschließend wurden mit einem Mikrotom 5-µm-Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden mit Xylol und abnehmenden EtOH-Konzentrationen von 100 %, 90 %, 80 % und 70 % entparaffiniert. Die Objektträger wurden mit Blockierungspuffer (5 % Rinderserumalbumin (Millipore Sigma, B6917) in DPBS mit Ca2+ und Mg2+ (Thermo Fisher Scientific, 14040141)) 20 Minuten lang inkubiert und dann wie folgt mit artspezifischen Reagenzien gefärbt. Für betazellspezifische Lebensfähigkeitsexperimente wurden intakte Mausinseln vor der Fixierung, Permeabilisierung und Färbung mit Anti-Insulin-Antikörpern mit fixierbarem, lebendem, totem Farbstoff (Biotium, Live-or-Dye NucFix) angefärbt (siehe unten).

Nierenschnitte wurden bei Raumtemperatur mit dem polyklonalen Meerschweinchen-Anti-Insulin-Antikörper FLEX (Agilent, IR002) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schnitte wurden fünfmal vorsichtig mit dem Blockierungspuffer gewaschen und dann mit rekombinantem Kaninchen-Anti-Glucagon-Antikörper (Abcam, ab92517) in Blockierungspuffer (1:570) 1 Stunde lang inkubiert. Die Schnitte wurden dann fünfmal sanft mit Blockierungspuffer gewaschen und mit Ziegen-Anti-Meerschweinchen-Immunglobulin G (IgG) (H+L) Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488) (Abcam, ab150185; 1:250) und Ziegen-Anti-Kaninchen inkubiert IgG H&L (Alexa Fluor 647) (Abcam, ab150079) in Blockierungspuffer (1:250) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach vorsichtigem Waschen der Schnitte mit 4 °C DPBS mit Ca2+ und Mg2+ wurden die Schnitte mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (Millipore Sigma, F6057) markiert, abgedeckt (Chase Scientific, ZA0294) und bei 4 °C aufbewahrt für 2 Stunden vor der Bildgebung.

Nierenschnitte wurden bei Raumtemperatur mit monoklonalem Maus-Anti-Insulin-Antikörper (K36aC10) (Abcam, ab6995) in Blockierungspuffer (1:50 Verdünnung) und rekombinantem Kaninchen-Anti-Glucagon-Antikörper (Abcam, ab92517) in Blockierungspuffer (1:570) inkubiert ) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Schnitte fünfmal vorsichtig mit Blockierungspuffer gespült und mit Ziegen-Anti-Maus-IgG H&L (Alexa Fluor 647) (Abcam, ab150115) in Blockierungspuffer (1:250) und Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H&L (Alexa Fluor 488) inkubiert. (Abcam, ab150077) in Blockierungspuffer (1:300) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach vorsichtigem Waschen der Schnitte mit 4 °C DPBS mit Ca2+ und Mg2+ wurden die Schnitte mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (Millipore Sigma, F6057) markiert, abgedeckt (Chase Scientific, ZA0294) und bei 4 °C gehalten für 2 Stunden vor der Bildgebung auf einem inversen konfokalen Olympus Fluoview 3000-Mikroskop.

Die statistische Analyse wurde in R Version 4.0.3 (R Foundation for Statistical Computing) durchgeführt. Wir haben die genaue Anzahl unabhängiger Experimente (n) und technischer Wiederholungen für jede relevante Zahl in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Die Normalität wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test für kontinuierliche Variablen oder grafisch mithilfe von qq-Diagrammen und Verteilungshistogrammen getestet. Die Homogenität der Varianz wurde mithilfe des Levene-Tests bewertet. Für normale oder nahezu normale Gruppenvergleiche wurden ANOVA-Tests mit paarweisem Post-hoc-Tukey-HSD-Test verwendet, um statistische Unterschiede zu bestimmen. Für Gruppen mit ungleicher Varianz wurde der Games-Howell-Test verwendet. Nichtnormale Variablen wurden mit dem nichtparametrischen Kruskal-Wallis-Test für die Gesamtsignifikanz und dem paarweisen Wilcox-Test (Mann-Whitney U) für den Einzelgruppenvergleich getestet. Die P-Werte wurden für mehrere Vergleiche angepasst. Die Zeit-bis-Ereignis-Analyse wurde unter Verwendung der Kaplan-Meier-Methode mit dem Log-Rank-Signifikanztest durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben. Die vollständige statistische Behandlung für jede Zahl ist in den Zusatzdaten 2 dargestellt. Die statistischen Tests waren zweiseitig und ein P-Wert von <0,05 wurde als signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle Rohdaten wurden für den öffentlichen Zugriff archiviert (https://doi.org/10.13020/yrva-zr31)52.

Für die statistische Analyse wurde R Version 4.0.3 verwendet. MATLAB 2018b wurde zur Berechnung von Volumenänderungen von Inseln aus den experimentell aufgezeichneten Shrink-Swell-Videos verwendet. MATLAB 2019a wurde für die Schrumpf-Quelle-Kurvenanpassung und die Kosten-Funktions-Bewertung der chemischen Toxizität verwendet. Die benutzerdefinierten Codes sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Latres, E., Finan, DA, Greenstein, JL, Kowalski, A. & Kieffer, TJ Navigieren auf zwei Wegen zur Glukosenormalisierung bei Diabetes: automatisierte Insulinabgabegeräte und Zelltherapie. Zellmetabolismus 29, 545–563 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shapiro, AJ et al. Inseltransplantation bei sieben Patienten mit Typ-1-Diabetes mellitus unter Verwendung einer glukokortikoidfreien immunsuppressiven Therapie. N. engl. J. Med. 343, 230–238 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hering, BJ et al. Phase-3-Studie zur Transplantation menschlicher Inseln bei Typ-1-Diabetes, kompliziert durch schwere Hypoglykämie. Diabetes Care 39, 1230–1240 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vantyghem, MC et al. Zehn-Jahres-Ergebnis von Inselzellen allein oder Inselzellen nach Nierentransplantation bei Typ-1-Diabetes: eine prospektive Parallelarm-Kohortenstudie. Diabetes Care 42, 2042–2049 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Kaddis, JS, Danobeitia, JS, Niland, JC, Stiller, T. & Fernandez, LA Multizentrische Analyse neuer und etablierter Variablen, die mit erfolgreichen Ergebnissen der Isolierung menschlicher Inseln verbunden sind. Bin. J. Transplantation. 10, 646–656 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Plesner, A. & Verchere, CB Fortschritte und Herausforderungen bei der Inseltransplantation: Inselbeschaffungsraten und Lehren aus suboptimaler Inseltransplantation. J. Transplantation. 2011, 979527 (2011).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Scharp, DW et al. Ergebnisse unserer ersten neun intraportalen Insel-Allotransplantate bei insulinpflichtigen Typ-1-Diabetikern. Transplantation 51, 76–85 (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Warnock, GL, Kneteman, NM, Ryan, EA, Rabinovitch, A. & Rajotte, RV Langzeit-Follow-up nach Transplantation von insulinproduzierenden Pankreasinseln bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1 (insulinabhängig). Diabetologia 35, 89–95 (1992).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gaber, AO & Fraga, D. Fortschritte in der langfristigen Inselkultur. Zellbiochem. Biophys. 40, 49–54 (2004).

PubMed Google Scholar

Schmied, BM et al. Transdifferenzierung menschlicher Inselzellen in einer Langzeitkultur. Pankreas 23, 157–171 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kin, T. et al. Risikofaktoren für Inselverlust während der Kultur vor der Transplantation. Transpl. Int. 21, 1029–1035 (2008).

PubMed Google Scholar

Ricordi, C. et al. Von den National Institutes of Health gesponserte Phase-3-Studie des Clinical Islet Transplantation Consortium: Herstellung eines komplexen Zellprodukts in acht Verarbeitungsanlagen. Diabetes 65, 3418–3428 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tremmel, DM, Mitchell, SA, Sackett, SD & Odorico, JS Nachahmung natürlich hergestellter Betazellen: jüngste Fortschritte bei aus Stammzellen gewonnenen Inseln. Curr. Meinung. Organtransplantation. 24, 574–581 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pepper, AR et al. Posttransplantationscharakterisierung von langfristig funktionellen hesc-abgeleiteten Pankreas-Endoderm-Transplantaten. Diabetes 68, 953–962 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Velazco-Cruz, L. et al. Erwerb dynamischer Funktionen in aus menschlichen Stammzellen gewonnenen β-Zellen. Stem Cell Rep. 12, 351–365 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Khosla, K. et al. Charakterisierung der Laser-Gold-Nanoerwärmung: eine Plattform für die Kryokonservierung im Millimeterbereich. Langmuir 35, 7364–7375 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhan, L. et al. Konduktionskühlung und plasmonische Erwärmung erhöhen das Vitrifizierungsvolumen der Tröpfchen für die Kryokonservierung von Zellen erheblich. Adv. Wissenschaft. 8, 2004605 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Kojayan, GG, Alexander, M., Imagawa, DK & Lakey, JRT Systematische Überprüfung der Kryokonservierung von Inseln. Inseln 10, 40–49 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Khosla, K. et al. Kryokonservierung und Laser-Nanoerwärmung von Zebrafischembryonen, gefolgt von Schlüpfen und Laichen. Adv. Biosystem. 4, 2000138 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Song, YC, Khirabadi, BS, Lightfoot, F., Brockbank, KG & Taylor, MJ Die Kryokonservierung des Glaskörpers erhält die Funktion von Gefäßtransplantaten aufrecht. Nat. Biotechnologie. 18, 296–299 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pagliuca, FW et al. Erzeugung funktioneller menschlicher Pankreas-β-Zellen in vitro. Zelle 159, 428–439.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhan, L., Li, MG, Hays, T. & Bischof, J. Kryokonservierungsmethode für Drosophila melanogaster-Embryonen. Nat. Komm. 12, 2412 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Taylor, MJ & Baicu, S. Übersicht über die Kryokonservierung von Glaskörperinseln: Einige praktische Probleme und ihre Lösung. Organogenesis 5, 155–166 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Papas, KK et al. Die Dosis der Insel-Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) sagt die Insulinunabhängigkeit bei der klinischen Insel-Autotransplantation voraus. PLoS ONE 10, e0134428 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Papas, KK et al. Die Sauerstoffverbrauchsrate menschlicher Inseln und DNA-Messungen sagen eine Diabetesumkehr bei Nacktmäusen voraus. Bin. J. Transplantation. 7, 707–713 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Veres, A. et al. Darstellung der zellulären Identität während der menschlichen In-vitro-β-Zelldifferenzierung. Natur 569, 368–373 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rajotte, RV, Stewart, HL, Voss, WA & Shnitka, TK Lebensfähigkeitsstudien an gefrorenen–aufgetauten Ratten-Langerhans-Inseln. Cryobiology 14, 116–120 (1977).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rajotte, RV, Warnock, GL & Kneteman, NN Kryokonservierung von Insulin produzierendem Gewebe bei Ratten und Hunden. Welt J. Surg. 8, 179–186 (1984).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bank, HL & Reichard, L. Kryogene Konservierung isolierter Langerhans-Inseln: zweistufige Kühlung. Cryobiology 18, 489–496 (1981).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakagawara, G., Kojima, Y., Mizukami, T., Ono, S. & Miyazaki, I. Transplantation kryokonservierter Pankreasinseln in die Pfortader. Transplantation. Proz. 13, 1503–1507 (1981).

CAS PubMed Google Scholar

Miyamoto, M. et al. Entwicklung eines Kryokonservierungsverfahrens unter Verwendung eines Gefrierbeutels für Pankreasinseln unter Verwendung eines neu entwickelten Kryoschutzmittels. Zelltransplantation. 10, 363–371 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kojayan, G. et al. Verbesserte Kryokonservierungsausbeute von Pankreasinseln durch Kombination von durchlässigen Kryoschutzmitteln mit geringerer Dosis. Kryobiologie 88, 23–28 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lakey, JR, Warnock, GL, Ao, Z. & Rajotte, RV Massenkryokonservierung isolierter Langerhans-Inseln. Zelltransplantation. 5, 395–404 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Miranda, PM et al. Menschliche Inselmasse, Morphologie und Überleben nach Kryokonservierung unter Verwendung des Edmonton-Protokolls. Inseln 5, 188–195 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Warnock, GL et al. Normoglykämie nach Transplantation frisch isolierter und kryokonservierter Pankreasinseln bei Diabetes mellitus Typ 1 (insulinabhängig). Diabetologia 34, 55–58 (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yamanaka, T. et al. Direkter Vergleich der Cryotop®-Vitrifizierung und des Bicell®-Einfrierens bei der Wiederherstellung funktionsfähiger Ratten-Pankreasinseln. Kryobiologie 73, 376–382 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Yamanaka, T., Goto, T., Hirabayashi, M. & Hochi, S. Nylonnetzgerät zur Vitrifizierung großer Mengen von Ratten-Pankreasinseln. Biokonserv. Biobank 15, 457–462 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakayama-Iwatsuki, K. et al. Transplantation von vitrifiziert-erwärmten Ratten-Pankreasinseln auf dem Nylonnetzgerät und der Seidenfibroinschwammscheibe. Inseln 12, 145–155 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagaya, M. et al. Ein wirksames neues Kryokonservierungsverfahren für Pankreasinseln mittels Hohlfaservitrifikation. Horm. Metab. Res. 48, 540–549 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jutte, NH, Heyse, P., Jansen, HG, Bruining, GJ & Zeilmaker, GH Vitrifizierung von Maus-Langerhans-Inseln: Vergleich mit einer konventionelleren Gefriermethode. Cryobiology 24, 292–302 (1987).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sasamoto, H., Futami, M., Ando, ​​Y. & Nakaji, S. Kryokonservierung von Ratten-Langerhans-Inseln durch Vitrifikation. J. Artif. Organe 15, 283–289 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vegas, AJ et al. Langfristige Blutzuckerkontrolle mithilfe von Polymer-verkapselten Betazellen aus menschlichen Stammzellen in immunkompetenten Mäusen. Nat. Med. 22, 306–311 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Odorico, J. et al. Bericht über das Treffen der wichtigsten Meinungsführer zu aus Stammzellen gewonnenen Betazellen. Transplantation 102, 1223 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Peterson, QP et al. Eine Methode zur Erzeugung von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen Alphazellen. Nat. Komm. 11, 2241 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Singh, A. et al. Durch apoptotische Spenderleukozyten induzierte Langzeittoleranz von Insel-Allotransplantaten bei nichtmenschlichen Primaten. Nat. Komm. 10, 3495 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Melli, K. et al. Verstärkung der Autoimmunreaktion durch Induktion der Reifung dendritischer Zellen in entzündeten Geweben. J. Immunol. 182, 2590–2600 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Anazawa, T. et al. Eine verbesserte Methode zur Gewinnung der Bauchspeicheldrüse von Schweinen mit arterieller Spülung und duktaler Injektion verbessert das Ergebnis der Inselisolierung. Transplantation. Proz. 42, 2032–2035 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kleinhans, FW Membranpermeabilitätsmodellierung: Kedem-Katchalsky vs. ein Zwei-Parameter-Formalismus. Cryobiology 37, 271–289 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

de Freitas, RC, Diller, KR, Lakey, JR & Rajotte, RV Osmotisches Verhalten und Transporteigenschaften menschlicher Inseln in einer Dimethylsulfoxidlösung. Cryobiology 35, 230–239 (1997).

Artikel PubMed Google Scholar

Cattral, MS, Lakey, JR, Warnock, GL, Kneteman, NM & Rajotte, RV Wirkung der Kryokonservierung auf das Überleben und die Funktion muriner Insel-Isotransplantate und Allotransplantate. Zelltransplantation. 7, 373–379 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Emmaullee, JA et al. Der Caspase-selektive Inhibitor EP1013 steigert die Funktion und Langlebigkeit menschlicher Inseltransplantate bei der Transplantation marginaler Inselinseln bei Mäusen. Diabetes 57, 1556–1566 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bischof, John C; Finger, Erik B. Cryopreservation of Pancreatic Islets Experimental Data Repository 2022. Abgerufen aus dem Data Repository der University of Minnesota, https://doi.org/10.13020/yrva-zr31 (2022).

Referenzen herunterladen

JSR wurde vom Schulze Diabetes Institute und der Transplantationsabteilung der Abteilung für Chirurgie der University of Minnesota unterstützt. Die Autoren danken F. Zhou und W. Zhang von der Characterization Facility der University of Minnesota für ihre Hilfe bei TEM und C. Forster und A. Lewis vom University of Minnesota Clinical and Translational Science Institute für technische Unterstützung bei histologischen Experimenten. Die Autoren danken dem Schulze Diabetes Institute, Abteilung für Chirurgie, für die Nutzung ihres konfokalen Mikroskops und die Bereitstellung von Schweineinseln. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse von Regenerative Medicine Minnesota (EBF und JCB), der National Science Foundation (EEC 1941543, JCB und EBF) und den National Institutes of Health (R01DK131209, JCB und EBF; R01DK117425, JCB und EBF; und R01HL135046) unterstützt. JCB und EBF). LZ dankt für das Doctoral Dissertation Fellowship der University of Minnesota und JCB dankt für die Unterstützung durch den Kuhrmeyer Chair in Mechanical Engineering und den Bakken Chair am Institute for Engineering in Medicine der University of Minnesota. PPQ möchte der JW Kieckhefer Foundation, der Familie Stephen und Barbara Slaggie und der Khalifa Bin Zayed Al Nahyan Foundation für die Unterstützung dieser Arbeit danken.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Li Zhan, Joseph Sushil Rao.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: John C. Bischof, Erik B. Finger.

Fakultät für Maschinenbau, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA

Li Zhan, Zonghu Han, Michael Etheridge, Cari S. Dutcher und John C. Bischof

Abteilung für Chirurgie, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA

Joseph Sushil Rao, Diane Tobolt und Erik B. Finger

Schulze Diabetes Institute, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA

Joseph Sushil Rao

Abteilung für Chemieingenieurwesen und Materialwissenschaften, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA

Nikhil Sethia und Cari S. Dutcher

Abteilung für Physiologie und Biomedizinische Technik, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA

Michael Q. Slama und Quinn P. Peterson

Zentrum für Regenerative Medizin, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA

Quinn P. Peterson

Abteilung für Biomedizintechnik, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA

John C. Bischof

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

LZ, JSR, JCB und EBF konzipierten und gestalteten die Studie. LZ, JSR, NS, MQS und DT führten Experimente durch und stellten die Daten zusammen. ZH, NS und LZ führten eine Modellierung durch und stellten die Daten zusammen. CSD, QPP, JCB und EBF koordinierten und überwachten die Studie. JCB und EBF sind die Co-Senior-Autoren. Alle Autoren beteiligten sich an der Diskussion und Interpretation der Daten. LZ, JCB und EBF haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Erik B. Finger.

LZ, JSR, ZH, NS, ME, CSD, JCB und EBF haben eine vorläufige Patentanmeldung (Seriennummer 63/270,192) eingereicht, die für diese Studie relevant ist.

Nature Medicine dankt Gordon Weir, Klearchos Papas und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Jerome Staal und Jennifer Sargent waren die Hauptherausgeber dieses Artikels und leiteten den Redaktionsprozess und die Begutachtung durch Fachkollegen in Zusammenarbeit mit dem Rest des Redaktionsteams.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Ergebnisse und Diskussion, Methoden, Abbildungen 1–12, Tabellen 1–3 und Referenzen.

Hochgeschwindigkeitsvideo (4.000 Bilder pro Sekunde) der Laser-Nanoerwärmung (7,5-ms-Laserimpuls) eines 2-μl-Tröpfchens, das mit Inseln eingekapselt ist.

Zusammenfassung der statistischen Behandlung für jede Zahl, einschließlich P-Werten, Teststatistiken und Konfidenzintervallen.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhan, L., Rao, JS, Sethia, N. et al. Durch die Kryokonservierung von Pankreasinseln durch Vitrifikation wird eine hohe Lebensfähigkeit, Funktion, Erholung und klinische Skalierbarkeit für die Transplantation erreicht. Nat Med 28, 798–808 (2022). https://doi.org/10.1038/s41591-022-01718-1

Zitat herunterladen

Eingegangen: 24. September 2021

Angenommen: 26. Januar 2022

Veröffentlicht: 14. März 2022

Ausgabedatum: April 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-022-01718-1

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Annalen der biomedizinischen Technik (2023)

Naturkommunikation (2022)