In-vivo-Biolumineszenzbildgebung natürlicher Bakterien in tiefen Geweben mittels ATP

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2331 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die meisten vorhandenen Biolumineszenz-Bildgebungsmethoden können nur den Standort gentechnisch veränderter Bakterien in vivo sichtbar machen, was die Bildgebung natürlicher Bakterien im Allgemeinen ausschließt. Dabei nutzen wir bakterienspezifische ATP-bindende Kassetten-Zuckertransporter, um Luciferase und Luciferin zu internalisieren, indem wir sie per Anhalter auf die einzigartige Kohlenstoffquelle der Bakterien transportieren. Typischerweise bestehen die synthetisierten Biolumineszenzsonden aus Glucosepolymer (GP), Luciferase, Cy5 und ICG-modifizierten Silizium-Nanopartikeln und ihre Substrate bestehen aus GP- und D-Luciferin-modifizierten Silizium-Nanopartikeln. Im Vergleich zu Bakterien mit Mutationen in Transportern, die die Sonden in vitro kaum internalisieren (d. h. ~2 % der Aufnahmerate), könnten verschiedene Bakterien die Sonden mit einer hohen Aufnahmerate von etwa 50 % robust verschlingen. Insbesondere ermöglicht die entwickelte Strategie die Ex-vivo-Biolumineszenzbildgebung des menschlichen Glaskörpers, der zehn Arten von Krankheitserregern enthält, die von Patienten mit bakterieller Endophthalmitis gesammelt wurden. Mithilfe dieser Plattform können wir bakterielle und nichtbakterielle Nephritis und Kolitis bei Mäusen weiter differenzieren, während ihre chemilumineszierenden Gegenstücke sie nicht unterscheiden können.

Die Mikroorganismen spielen viele wichtige Rollen bei Gesundheit und Krankheit1,2,3,4,5,6. Die Aktivität von Bakterien in vivo wird stark von ihrer Lage im Wirtsorganismus beeinflusst. Die vorhandenen klinischen Bildgebungsmethoden wie Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) und können eine nicht-invasive Bildgebung bakterieller Infektionen im Körper ermöglichen. Aufgrund ihrer relativ geringen Selektivität sind sie jedoch nicht in der Lage, durch bakterielle Infektionen verursachte Entzündungen von Entzündungen zu unterscheiden, die durch andere Ursachen wie Krebs oder Autoimmunerkrankungen verursacht werden7,8,9,10. In jüngster Zeit können optische Bildgebungstechniken lokalisierte, qualitative und quantitative Informationen über Bakterien auf molekularer Ebene liefern11,12,13,14. Als am weitesten verbreitete optische Bildgebungsmethode erfordert die Fluoreszenzbildgebung eine optische Anregung in Echtzeit. Sie kann jedoch zu einer Hintergrundautofluoreszenz biologischer Gewebe führen, was zu einem relativ schlechten Signal-Hintergrund-Verhältnis führt15,16,17.

Aufgrund der Eliminierung einer externen Lichtbestrahlung bietet die Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) mehrere Vorteile gegenüber der Fluoreszenz-Bildgebung, wie z. B. einen geringeren Hintergrund und eine höhere Empfindlichkeit18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Bis heute können die Biolumineszenzsysteme zum Nachweis von Bakterien grundsätzlich in zwei Typen eingeteilt werden: (1) das endogene BLI-System, das die gentechnische Veränderung von Bakterien zur Expression von Luciferasen beinhaltet29,30,31,32,33; (2) das exogene BLI-System, bei dem die Selbstlumineszenz durch die Oxidation der exogenen Luciferin- oder Käfig-Luciferin-Substrate entsteht, die durch die exogene Luciferase in Gegenwart von bakteriellem Adenosintriphosphat (ATP) katalysiert wird, das durch die Lyse von Bakterien entsteht34. Trotz der großen Fortschritte von BLI weist es intrinsische Mängel bei der bakteriellen Bildgebung auf, wie folgt: „Erstens benötigen die endogenen BLI-Systeme eine genetische Modifikation der Bakterien; zweitens benötigen die exogenen BLI-Systeme die Zerstörung der Bakterienzellen, um sie zu verbrauchen.“ intrazelluläres ATP“ und sind daher nicht in der Lage, lebende Bakterien abzubilden29,30,31,32,33,34.

Eine theoretisch vielversprechende, aber methodisch unentwickelte Möglichkeit, verschiedene natürliche Bakterien in vivo mit Biolumineszenz sichtbar zu machen, besteht darin, Biolumineszenz-Reporter selektiv in Bakterienzellen zu transportieren und dabei das ATP im Inneren der Bakterien direkt zu verbrauchen. Interessanterweise könnte die Antibiotika-Strategie „Trojanisches Pferd“ Siderophor-gebundene Antibiotika über die Eisentransporter der Bakterien in das bakterielle Zytoplasma transportieren35,36,37,38,39,40,41. In unserer früheren Arbeit haben wir gezeigt, dass mit Glucosepolymer (GP) modifizierte Nanosonden über den bakterienspezifischen ABC-Transporterweg in verschiedene Bakterien internalisiert werden können, wie in der Ergänzungstabelle 142, 43, 44, 45 zusammengefasst. Über den Einsatz einer „Trojanischen Pferd“-Strategie zur selektiven Abgabe von Biolumineszenzindikatoren an Bakterien wurde jedoch unseres Wissens bisher noch nicht berichtet.

Um die technische Lücke zu schließen, haben wir uns zum Ziel gesetzt, Luciferase und Luciferin über Zuckertransporter der ATP-Bindungskassette (ABC) selektiv in verschiedene natürliche Bakterien zu transportieren, indem wir sie per Anhalter auf α(1-4)-glucosidisch verknüpften Glucosepolymeren (Dextroseäquivalent von 4,0) transportieren ~7,0)-verknüpfte Nanopartikel. Abbildung 1 zeigt schematisch, dass sowohl Gram-negative als auch Gram-positive Bakterien die synthetisierten Biolumineszenzsonden (z. B. Glucosepolymer (GP), Luciferase, Cy5 und ICG-modifizierte Siliziumnanopartikel (GP-Si-BPs)) und ihre Substrate aktiv verschlingen könnten (GP- und D-Luciferin-modifizierte Silizium-Nanopartikel (GP-Si-Luc)). GP (z. B. Poly[4-O-(α-D-glucopyranosyl)-D-glucopyranose]) dient als allgegenwärtige Kohlenstoffquelle, die über den ABC-Zuckertransporter robust in Bakterienzellen internalisiert werden kann9,42,46. Am Beispiel des ABC-Zuckertransporters in Escherichia coli (E. coli) besteht er aus fünf Untereinheiten: LamB, MalE, MalF, MalG und MalK. Unter diesen Untereinheiten ist LamB ein typisches Außenmembran-Diffusionsporin, und MalE kann α(1-4)-glucosidisch verknüpfte GP-Moleküle erkennen47,48,49,50,51,52,53. Durch Nutzung dieses Aufnahmemechanismus wurde kürzlich gezeigt, dass kleine (z. B. ~5 nm) GP-modifizierte Nanopartikel, einschließlich Silizium-Nanopartikel, Gold-Nanopartikel und Kohlenstoffpunkte, selektiv und robust in Bakterienzellen internalisiert werden43,44,45. Analog zeigen wir hier, dass verschiedene Bakterien ihre getarnten „Nahrungsmittel“, also GP-Si-BPs und GP-Si-Luc, fressen. Nach der Internalisierung in Bakterienzellen wird das Luciferin in GP-Si-Luc direkt durch ATP in Bakterien aktiviert, gefolgt von der durch die Luciferase in GP-Si-BPs katalysierten Oxidation. Durch den weiteren Einsatz eines Energietransferrelais, das den Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET) zwischen Luciferase und Cy5 und den Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen Cy5 und ICG integriert, ermöglichen die entwickelten Trojan BLI-Sonden die Nahinfrarot-Bildgebung (NIR) von Bakterien im Inneren tiefe Gewebe. Darüber hinaus ermöglicht die Beladung mit ICG die photothermische Abtötung von Bakterien unter NIR-Bestrahlung. Wir demonstrieren, dass die vorgestellte BLI-Strategie des Trojanischen Pferdes eine Ex-vivo-Biolumineszenzbildgebung von zehn Bakterienarten im Glaskörper von Patienten mit bakterieller Endophthalmitis ermöglicht. Wir zeigen auch, dass die vorgestellte BLI-Strategie des Trojanischen Pferdes nicht nur eine selektive und empfindliche Bildgebung, sondern auch eine photothermische Therapie von Krankheitserregern in tiefen Geweben in Proof-of-Concept-Modellen für bakterielle Nephritis und Kolitis bei Mäusen ermöglicht.

Die Nanosonden bestehen aus GP-, Cy5-, ICG- und Luciferase-modifizierten Silizium-Nanopartikeln (SiNPs) (GP-Si-BPs) und GP-, D-Luciferin-modifizierten SiNPs (GP-Si-Luc).

Ergänzende Abbildung 1 veranschaulicht Schritt für Schritt den Syntheseweg für GP-Si-BPs und GP-Si-Luc. Kurz gesagt, wir haben zunächst GP-konjugierte SiNPs (GP-SiNPs) durch die Schiff-Base-Reaktion synthetisiert, bei der die Schiff-Base basierend auf der Reaktion zwischen den Aldehydgruppen von GP (0,56 mM, 100 µL) und den Aminogruppen am gebildet wurde Oberfläche von SiNPs (0,08 mM, 200 µL). Anschließend wurden durch Nutzung der elektrostatischen Adsorption die Farbstoffmoleküle von Cy5 (0,56 mM, 2 µL) und ICG (0,56 mM, 12 µL) auf GP-SiNPs adsorbiert. Durch weitere Konjugation mit Glühwürmchen-Luciferase (0,06 mM, 100 µL) über eine durch N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC)/N-Hydroxysuccinimid (NHS) aktivierte Kondensationsreaktion erhielten wir schließlich die Biolumineszenzsonden von GP-Si-BPs. Analog dazu synthetisierten wir durch Konjugation von GP-SiNPs mit D-Luciferin (0,30 mM, 100 µL) basierend auf der EDC/NHS-Kondensationsreaktion die biolumineszierenden Substrate von GP-Si-Luc. Die chemische Ausbeute an GP-Si-BPs betrug 76,1 % und die chemische Ausbeute an GP-Si-Luc betrug 78,8 %, die gemäß dem angegebenen Protokoll berechnet wurden54. Die auf SiNPs geladenen Mengen an GP, ​​Cy5, ICG, Luciferase und D-Luciferin wurden durch die entsprechenden Kalibrierungsabsorptionskurven streng quantifiziert (ergänzende Abbildung 2). Typischerweise betrug die tatsächliche Menge an auf den GP-SiNPs adsorbiertem Cy5 etwa 0,0044 mM und die tatsächliche Menge an auf den GP-SiNPs adsorbiertem ICG etwa 0,026 mM. Um die äquivalente Dosis zu erhalten, sollte die detektierte Absorption von Cy5 und ICG zwischen den Gruppen gleich bleiben.

Wie aus den Bildern der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und dem hochauflösenden TEM-Bild von SiNPs, GP-Si-BPs und GP-Si-Luc (Abb. 2a) und der entsprechenden Größenverteilung (ergänzende Abb. 3) hervorgeht, ist der Durchschnitt Der Durchmesser von GP-Si-BPs betrug ~2,8 nm und der durchschnittliche Durchmesser von GP-Si-Luc betrug ~2,9 nm, was beides etwas größer war als der von nackten SiNPs (z. B. ~2,2 nm). Der hydrodynamische Durchmesser von GP-Si-BPs, GP-Si-Luc und reinen SiNPs betrug ~5,6 nm, ~4,1 nm und ~3,1 nm, gemessen durch dynamische Lichtstreuung (DLS) (ergänzende Abbildung 4). Die mit DLS gemessene Partikelgröße ist etwas größer als die mit TEM, was auf unterschiedliche Oberflächenzustände derselben Probe unter den beiden Messbedingungen zurückzuführen sein kann. Insbesondere muss das Lösungsmittel in der Probe für die TEM-Charakterisierung strikt entfernt werden, wodurch sich ein kleinerer Durchmesser ergibt als der mit DLS gemessene, wie in früheren Berichten erläutert55,56. Darüber hinaus haben wir systematisch die gute Stabilität von Luciferase und Luciferin nach der SiNP-Konjugation nachgewiesen (ergänzende Abbildung 5).

a TEM-Bilder und hochauflösende TEM-Bilder von SiNPs, GP-Si-BPs und GP-Si-Luc. Maßstabsleiste, 20 nm und 1 nm. b Ringförmige Hochwinkel-Dunkelfeld-TEM-Bilder (HAADF-STEM) von MDR E. coli oder MRSA, behandelt mit PBS, 0,06 mM Si-BPs, Si-Luc, GP-Si-Luc, GP-Si-BPs bei 37 °C für 2,5 Stunden. Nach der Inkubation wurden die behandelten Bakterien mehrmals mit PBS-Puffer gespült. Die Bakterienzellkonzentration beträgt ~1,0 × 107 KBE. Maßstabsbalken, 200 nm. c Biolumineszenzsignale von MDR E. coli mit unterschiedlichen Behandlungen wie angegeben. Nach der Inkubation wurden die behandelten Bakterien mehrere Male mit PBS-Puffer gespült, gefolgt von einer Bildgebung (IVIS Lumina III). Alle Bildgebungsexperimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA-Analyse durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwerte +/− SD (n = 3) dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Die Cartoons wurden von Prof. Houyu Wang erstellt.

Um vor allem zu untersuchen, ob GP-Si-BPs und GP-Si-Luc in natürliche Bakterien eindringen können, wurden für die folgenden Zwecke zwei klinisch gewonnene multiresistente Escherichia coli (MDR E. coli) und multiresistente Staphylococcus aureus (MRSA)-Zellen isoliert Experimente. Sie wurden von Patienten mit Keratitis gewonnen, die im Shanghai Eye, Ear, Nose and Throat Hospital der Fudan-Universität diagnostiziert und behandelt wurden. Die isolierten Stämme (~1,0 × 107 KBE) wurden mit GP-Si-BPs (0,06 mM), GP-Si-Luc (0,06 mM) 2,5 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und dann mehrere Male mit PBS-Puffer gewaschen. Die Rasterelektronenmikroskopbilder (REM) in der ergänzenden Abbildung 6 zeigten, dass die Oberfläche und Morphologie der behandelten MDR-E. coli- und MRSA-Zellen mit denen unbehandelter Zellen vergleichbar waren. Wie in der Elementkartierung in Bildern des ringförmigen Dunkelfeld-Rastertransmissionselektronenmikroskops (HAADF-STEM) mit großem Winkel (Abb. 2b) gezeigt, erschienen in jeder Gruppe Kohlenstoff-, Stickstoff- und Sauerstoffelemente, während Siliziumelemente nur in den behandelten Bakterien vorkamen mit GP-Si-BPs oder GP-Si-Luc. Offenbar wurden die beobachteten Siliziumsignale SiNPs in GP-Si-BPs oder GP-Si-Luc zugeordnet, was direkt die Internalisierung von GP-Si-BPs oder GP-Si-Luc in Bakterienzellen belegt. Schließlich ergab der Ex-vivo-BLI der behandelten Bakterien, dass die deutliche Lumineszenz nur in der GP-Si-BPs + GP-Si-Luc-Gruppe gefunden wurde, die etwa zehnmal stärker war als bei anderen Gruppen (Abb. 2c). Die hohe Helligkeit war auf die Menge an ATP zurückzuführen, die zur Aktivierung von Luciferin in der Luciferase-vermittelten Lichtemissionsreaktion erforderlich war und innerhalb der Bakterien genau etwa zehnmal höher war als außerhalb (ergänzende Abbildung 7). Der ATP-Gehalt wurde mit dem ATP-Assay-Kit bestimmt. Interessanterweise wurden die vergleichbaren Biolumineszenzsignale in den lysierten Bakterien nach Zugabe von Sonden ohne Modifikation der GP-Moleküle (Si-BPs + Si-Luc) beobachtet (Abb. 2c). Wir haben die Bakterien vor der Inkubation mit GP-Si-BPs + GP-Si-Luc auch mit dem ATP-Inhibitor von DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) behandelt. Wie erwartet traten keine deutlichen Signale auf (ergänzende Abbildung 8). Zusammengenommen bewiesen diese Ergebnisse, dass die konstruierten Trojaner-BLI-Sonden tatsächlich in Bakterien eindrangen und die Helligkeit der erzeugten Biolumineszenz von der ATP-Menge im Inneren der Bakterien abhing.

In den entwickelten Biolumineszenzsonden dienten die Kern-SiNPs als Vektoren zum Laden von Biolumineszenzindikatoren. Zu den Biolumineszenzindikatoren gehörten die Selbstlumineszenzquelle Luciferase (λem = 560 nm) sowie zwei organische Farbstoffe von Cy5 (λex = 646 nm, λem = 664 nm) und ICG (λex = 780 nm, λem = 840 nm) (Abb . 3a). Aufgrund der ausreichenden Überlappung der Emissions- und Absorptionsbanden kann die NIR-Emission auf der Grundlage eines Dual-Resonanz-Energietransfer-Relay-Prozesses erreicht werden, der BRET zwischen Luciferase und Cy5 und FRET zwischen Cy5 und ICG kombiniert (Abb. 3b). Wie aus Abb. 3c weiter hervorgeht, kann die höchste Energieübertragungseffizienz erreicht werden, wenn das Verhältnis von Cy5 zu ICG 1:6 beträgt. Typischerweise wurde die optimale FRET-Effizienz zwischen Cy5 und ICG mit 32 % bestimmt und der entsprechende Förster-Abstand (R0) mit 1,03 nm berechnet, was die effiziente Emission im NIR-Bereich gewährleistet. Wie in Abb. 3d gezeigt, nahm die Biolumineszenzintensität von GP-Si-BPs + GP-Si-Luc linear mit der Erhöhung der ATP-Konzentration zu, was auf eine vom ATP-Gehalt abhängige Art und Weise von GP-Si-BPs hindeutet. Nach Zugabe von D-Luciferin (150 µM) und ATP (10 µM) wurde die Photostabilität von GP-Si-BPs (0,06 mM) weiter getestet. Wie in Abb. 3e gezeigt, zeigte das BLI-System eine relativ gute Biolumineszenzstabilität und behielt nach 120 Minuten 84 % des normalisierten Signals bei, da die enzymatische Reaktion zwischen Luciferin und Luciferase stabil aufrechterhalten wurde, da sie nicht durch externe Energie (z. B. Lichtbestrahlung) beeinflusst wurde ). Im Gegensatz dazu nahm das normalisierte Signal von ICG in GP-Si-BPs bei kontinuierlicher 808-nm-Bestrahlung über 120 Minuten stark um 26 % ab, da eine kontinuierliche 808-nm-Bestrahlung von ICG für den potenziellen Bleich- und Löscheffekt für eine verringerte Emission verantwortlich war. Anschließend untersuchten wir die Gewebepenetrationstiefe von GP-Si-BPs. Experimentell wurden GP-Si-BPs (0,06 mM), gemischt mit D-Luciferin (150 µM) und ATP (10 µM), in einer schwarzen 96-Well-Platte mit Hähnchenbrustgewebe unterschiedlicher Dicke bedeckt, gefolgt von der Aufzeichnung von Biolumineszenzsignalen und Fluoreszenzsignale unter 808-nm-Bestrahlung. Wie aus Abb. 3f hervorgeht, nahm das normalisierte Biolumineszenzsignal zusammen mit der Zunahme der Dicke des Hühnerbrustgewebes im Bereich von 0 bis 35 mm ab. Typischerweise war die normalisierte Biolumineszenzintensität von GP-Si-BPs bei einer Dicke von bis zu 30 mm immer noch deutlich höher als die der ICG-basierten NIR-Emissionsbildgebungsgruppe (p < 0,0001). Analog war die Gewebeeindringtiefe von GP-Si-BPs deutlich größer als die von GP-Ce6-SiNPs, wie in der ergänzenden Abbildung 9 angegeben. Typischerweise war das Fluoreszenzsignal von GP-Ce6-SiNPs bei einer Dicke von 5 mm zu sehen war nicht nachweisbar. Die guten Eindringtiefen von GP-Si-BPs bilden die Grundlage für spätere In-vivo-Bildgebungsanwendungen in tiefen Geweben. Schließlich haben wir die photothermische Fähigkeit von GP-Si-BPs in vitro mithilfe einer IR-Wärmebildkamera getestet. Wie in Abb. 3g, h gezeigt, könnte die Temperatur der GP-Si-BPs-Lösung (0, 06 mM) unter 808-nm-Laserbestrahlung für 5 Minuten schnell auf 61 ° C ansteigen, was auf eine mögliche photothermische Therapie (PTT) von GP-Si schließen lässt -BPs gegen Bakterien.

a UV-Vis-Absorptions- und Emissionsspektren von Cy5, ICG und Biolumineszenz von Luciferase. Gestrichelte und durchgezogene Linien beziehen sich auf Absorptions- bzw. Emissionsspektren. b Ein Schema, das den Mechanismus eines Energieübertragungsrelais veranschaulicht, das BRET und FRET in die entwickelte Strategie integriert. c Fluoreszenzspektren von GP-Si-BPs mit unterschiedlichen Verhältnissen von Cy5 zu ICG. d Biolumineszenzsignale von GP-Si-BPs + GP-Si-Luc als Funktion der ATP-Konzentration (Mittelwert ± SD, n = 3). e, f Zeitaufgelöste (e) und von der Dicke des Hühnerbrustgewebes abhängige (f) Biolumineszenz- und Fluoreszenzbilder (Anregung: 780 nm) und entsprechendes normalisiertes Signal für den quantitativen Vergleich der Biolumineszenz- und Fluoreszenzsignaländerung. Das normalisierte Signal in (e) ist definiert als das Verhältnis der zu einem beliebigen Zeitpunkt erfassten Emissionsintensität zur nach 5 Minuten erfassten Emissionsintensität. Das normalisierte Signal in (f) ist definiert als das Verhältnis der bei jeder Gewebedicke erfassten Emissionsintensität zur bei 0 mm erfassten Emissionsintensität. Die Biolumineszenz wird durch die Mischung aus GP-Si-BPs (0,06 mM), D-Luciferin (150 µM) und ATP (10 µM) erzeugt. Die Daten werden als Mittelwerte +/− SD (n = 3) dargestellt. g Die fotothermischen Erwärmungsbilder von PBS, GP-Si-BPs unter der Bestrahlung mit einem 808-nm-Laser. h Die photothermischen Erwärmungskurven von PBS, GP-Si-BPs unter der Bestrahlung mit einem 808-nm-Laser. Alle Bildgebungsexperimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA-Analyse durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Menge an verknüpftem GP und die Inkubationszeit zu optimieren, wurde die Aufnahmeeffizienz von GP-Si-BPs durch Bakterien systematisch mithilfe einer Durchflusszytometrieanalyse untersucht. Wie aus der ergänzenden Abbildung 10 hervorgeht, erreichte die Aufnahmerate von ~1,0 × 107 KBE von MDR E. coli ihren Maximalwert (z. B. 48,5 % von MRSA und 48,8 % von MDR E. coli), als die Bakterien mit inkubiert wurden GP-Si-BPs mit einer GP-Konzentration von 0,56 mM für 2,5 Stunden. Die Aufnahmerate erhöhte sich nicht wesentlich, wenn die GP-Konzentration und die Inkubationszeit weiter erhöht wurden, was darauf hindeutet, dass unter diesen Umständen ein Sättigungszustand erreicht wurde. Ähnliche Trends wurden auch bei GP-Si-Luc beobachtet. Dementsprechend wurden in den folgenden Experimenten 0,56 mM GP und eine Inkubation von 2,5 Stunden eingesetzt.

Als nächstes haben wir gezeigt, ob GP-Si-BPs und GP-Si-Luc auf verschiedene natürliche Bakterien abzielen können. Zu diesem Zweck haben wir zwei gramnegative Bakterien ausgewählt, nämlich klinisch gewonnene MDR-E. coli, Salmonella typhimurium (STm) und zwei grampositive Bakterien, nämlich klinisch gewonnene MRSA und Staphylococcus aureus (S. aureus). Wie aus den Bildern der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) in Abb. 4a und der ergänzenden Abb. 11a hervorgeht, konnten wir die deutlichen roten Fluoreszenzsignale (zugeordnet zu ICG, λex = 780 nm, λem = 800–840 nm) in MRSA, MDR beobachten E. coli, S. aureus und STm nach 2,5-stündiger Inkubation mit GP-Si-BPs (0,06 mM). Quantitativ ergab die entsprechende Durchflusszytometrie, dass die Aufnahmeeffizienz von GP-Si-BPs bei MRSA 52,7 %, bei MDR E. coli 49,6 %, bei S. aureus 53,5 % und bei STm 47,1 % betrug. Analog konnten wir in MRSA, MDR E. coli, S. aureus und STm nach 2,5-stündiger Inkubation starke grüne Fluoreszenzsignale (zugeordnet zu D-Luciferin, erste Spalte, λex = 328 nm, λem = 530–560 nm) nachweisen GP-Si-Luc (0,06 mM) (Abb. 4b und ergänzende Abb. 11b). Außerdem wurde die relativ hohe Aufnahmeeffizienz von GP-Si-Luc in MRSA (48,1 %), MDR E. coli (45,7 %), S. aureus (47,2 %) bzw. STm (48,9 %) bestimmt. Wie erwartet können sowohl grüne als auch rote Signale in MRSA, MDR E. coli, S. aureus und STm beobachtet werden, die mit GP-Si-BPs (0,06 mM) und GP-Si-Luc (0,06 mM) behandelt wurden (GP-Si). -BPs + GP-Si-Luc) für 2,5 Stunden (Abb. 4c und ergänzende Abb. 11c). Im Gegenteil, wir können in den mit den Nanoagenzien behandelten Bakterien keine nachweisbaren Fluoreszenzsignale beobachten, ohne dass GP-Moleküle (d. h. Si-Luc, Si-BPs oder Si-Luc + Si-BPs) modifiziert wurden (Ergänzende Abbildungen 12 und 13). Diese Ergebnisse bestätigten in erster Linie die Bakterien-Targeting-Fähigkeit von GP-Liganden.

a Konfokale Fluoreszenzbilder von MRSA- oder MDR-E. coli nach Inkubation mit 0,06 mM GP-Si-BPs und entsprechender durchflusszytometrischer Analyse der Aufnahmeraten. b Konfokale Fluoreszenzbilder von MRSA- oder MDR-E. coli nach Inkubation mit 0,06 mM GP-Si-Luc und entsprechender durchflusszytometrischer Analyse der Aufnahmeraten. c Konfokale Fluoreszenzbilder von MRSA oder MDR E. coli nach Inkubation mit 0,06 mM GP-Si-Luc + GP-Si-BPs. d, e Konfokale Fluoreszenzbilder von Bakterienmutanten von ΔlamB und ΔmalE nach Inkubation mit 0,06 mM GP-Si-BPs (d) oder GP-Si-Luc (e). Die Bakterienzellkonzentration beträgt ~107 KBE. Maßstabsbalken, 25 μm. f Biolumineszenzbilder von PBS-Puffer mit MRSA oder MDR E. coli in unterschiedlichen Konzentrationen nach Inkubation mit 0,06 mM GP-Si-Luc + GP-Si-BPs. g Ex-vivo-Biolumineszenzbildgebung von menschlichem Glaskörper mit Enterococcus faecalis (1), Klebsiella pneumoniae (2), Streptococcus pneumoniae (3), Neisseria meningitidis (4), Haemophilus influenzae (5), Streptococcus pyogenes (6), Vancomycin (Van)- resistenter Enterococcus (7), multiresistenter Staphylococcus aureus (MRSA) (8), Moraxella catarrhalis (9) oder Salmonella para-typhi A (10), gesammelt von Patienten mit bakterieller Endophthalmitis. Als Kontrolle wurde der Glaskörper ohne Bakterien (0) eines gesunden Probanden herangezogen. Alle Bildgebungsexperimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Um weiter zu zeigen, ob GP-Si-BPs und GP-Si-Luc über den ABC-Zuckertransporter auf Bakterien abzielen, haben wir zwei Arten von Bakterienmutanten konstruiert, nämlich eine Deletionsmutante für Delta-LamB (ΔlamB) und eine Deletionsmutante für Delta-MalE (ΔmalE), gefolgt von Inkubation mit GP-Si-BPs oder GP-Si-Luc. Die Sanger-Sequenzierungsdaten (Ergänzende Anmerkungen) bestätigten zusammen mit den PCR-Daten (Ergänzende Abbildung 14) die erfolgreiche Konstruktion von ΔlamB und ΔmalE. Wie erwartet konnten wir keine Fluoreszenzsignale in ΔlamB oder ΔmalE beobachten, die mit GP-Si-BPs (Abb. 4d) oder GP-Si-Luc (Abb. 4e) behandelt wurden. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie stimmten mit CLSM-Bildern überein (ergänzende Abbildung 15). Darüber hinaus untersuchten wir weiter, ob verschiedene Zucker (z. B. GP, Glucose und Maltotriose) die Aufnahme von GP-Si-BPs durch ABC-Zuckertransporter beeinflussen würden. Wie aus der ergänzenden Abbildung 16 hervorgeht, wurde die Aufnahme von GP-Si-BPs durch einen Überschuss an GP oder Maltotriose anstelle von Glucose gehemmt. Wie bereits berichtet, ermöglichten die ABC-Zuckertransporter nicht nur den Transport von Maltose, sondern auch linear (1-4)-glukosidisch verknüpften Glucosepolymeren wie Maltodextrinen, Amylose und Stärke sowie (1-4)-glukosidisch verknüpften Cyclodextrinen57. 58. Zusammengenommen bewiesen diese Ergebnisse, dass der Aufnahmemechanismus der Trojaner-BLI-Sonden in Bakterien tatsächlich über den ABC-Zuckertransportweg erfolgte.

Schließlich haben wir die gute Spezifität von GP-Si-BPs und GP-Si-Luc für Bakterien gegenüber Säugetierzellen nachgewiesen. Typischerweise wurden mit MDR E. coli oder MRSA versetzte menschliche Blutproben mit GP-Si-BPs (0,06 mM), GP-Si-Luc (0,06 mM) oder GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (0,06 mM) inkubiert ) für 2,5 Stunden gewaschen und dann mit PBS-Puffer gewaschen. Wie in der ergänzenden Abbildung 17 angegeben, wurden grüne und rote Fluoreszenzsignale nur in Bakterienzellen und nicht in menschlichen Blutzellen beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, dass GP-Si-BPs oder GP-Si-Luc aufgrund des Fehlens von ABC-Zuckertransportern in Säugetierzellen kaum von Säugetierzellen internalisiert wurden.

Um die Nachweisgrenze zu bestimmen, haben wir eine Konzentrationsreihe von MRSA und MDR E. coli in PBS-Puffer abgebildet, die mit Trojan BLI-Sonden inkubiert wurde (Abb. 4f). Typischerweise erzeugten Bakterien bei Konzentrationen von nur ~106 KBE ein nachweisbares Signal. Auf dieser Grundlage haben wir weiter gezeigt, dass die vorgestellte Trojaner-BLI-Strategie eine Ex-vivo-Biolumineszenzbildgebung von zehn Arten von Krankheitserregern im Glaskörper ermöglicht, die von Patienten mit bakterieller Endophthalmitis gesammelt wurden. Die abgebildeten Krankheitserreger waren Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae und Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Vancomycin (Van)-resistenter Enterococcus, multiresistenter Staphylococcus aureus (MRSA), Moraxella catarrhalis und Salmonella para-typhi A, wie in Abb. 4g dargestellt. Diese Krankheitserreger wurden durch Bakterienkulturen bestätigt, die ebenfalls vom Shanghai Eye, Ear, Nose and Throat Hospital der Fudan-Universität bereitgestellt wurden. Diese Ergebnisse deuten auf das Potenzial der Trojaner-BLI-Strategie in der klinischen Bakteriendiagnostik hin.

Als nächstes haben wir die Machbarkeit der vorgeschlagenen Strategie zur Biolumineszenz-Bildgebung natürlicher Bakterien in tiefen Geweben bestätigt. Zu diesem Zweck haben wir zunächst ein Proof-of-Concept-Modell der S. aureus-induzierten Nephritis bei Mäusen erstellt (ergänzende Abbildung 18a). Die tatsächliche S. aureus-Konzentration an der Infektionsstelle während der Bildgebung betrug ~1,0 × 108 KBE. Wir fanden heraus, dass die stärksten Biolumineszenzsignale an den infizierten Stellen nur in GP-Si-BPs + GP-Si-Luc-Gruppen auftraten (Abb. 5a). Quantitativ war die Signalintensität in GP-Si-BPs + GP-Si-Luc-Gruppen etwa dreifach stärker als die in GP-Si-BPs + Si-Luc-Gruppen. Ähnliche Ergebnisse konnten wir auch bei der Ex-vivo-Bildgebung des entnommenen Nierengewebes beobachten (ergänzende Abbildung 19). Darüber hinaus konnten mit der entwickelten Trojaner-Strategie (Abb. 5b) nur ~1,0 × 106 KBE S. aureus in der Niere unterschieden werden, und diese Empfindlichkeit sollte für viele In-vivo-Szenarien ausreichend sein. Um die selektive Bildgebung der entwickelten Trojan-BLI-Strategie gegen bakterielle Nephritis gegenüber anderer Nephritis zu demonstrieren, konstruierten wir als nächstes eine durch Glycerin verursachte Kolitis bei Mäusen (ergänzende Abbildung 18b). Wie erwartet stellten wir fest, dass die Biolumineszenzsignale bei S. aureus-Nephritis-tragenden Mäusen, die mit GP-Si-BPs + GP-Si-Luc behandelt wurden, deutlich heller waren als bei den Kontroll- und Glycerin-Nephritis-tragenden Mäusen, die mit GP-Si-BPs + behandelt wurden GP-Si-Luc (p < 0,001) (Abb. 5c). Zum weiteren Vergleich verwendeten wir auch ein anderes selbstlumineszierendes Reagens von Luminol, um S. aureus-Nephritis-tragende Mäuse (ergänzende Abbildung 18c) oder Glycerin-Nephritis-tragende Mäuse (ergänzende Abbildung 18d) abzubilden. Wie bereits berichtet, könnte Luminol durch Myeloperoxidase (MPO) katalysiert werden, um Lumineszenz zu erzeugen59,60. Im Unterschied zur entwickelten Trojan-BLI-Strategie im selektiven Bild von S. aureus-Nephritis könnte Luminol sowohl bei S. aureus-Nephritis-tragenden Mäusen als auch bei Glycerin-Nephritis-tragenden Mäusen starke Lumineszenzsignale erzeugen (Abb. 5d). Diese Ergebnisse zeigten zusammen, dass die entwickelte Trojaner-BLI-Strategie zwischen bakterieller Nephritis und anderer Nephritis unterscheiden konnte. Die hohe Selektivität sowie die einstellbare Empfindlichkeit der entwickelten Strategie wurden auf die selektive Internalisierung von Trojan BLI-Sonden in die Bakterienzellen zurückgeführt. Darüber hinaus verglichen wir systematisch das zuvor beschriebene GP- und Ce6-modifizierte SiNP-System (GP-Ce6-SiNPs) (einfache Anregung von Ce6)39, das Trojan BLI-System und die ICG-basierte NIR-Emissionsbildgebung bei der Bildgebung von S. aureus-Nephritis ( Ergänzende Abbildung 20). Obwohl das GP-Ce6-SiNPs-System und die ICG-basierte NIR-Emissionsbildgebung aufgrund der spezifischen bakteriellen Homing-Fähigkeit der GP-Liganden den Nachweis der bakteriellen Aufnahme von Nanowirkstoffen in der Niere ermöglichten, wies die Trojan BLI-Strategie 3,75-mal höhere Signal-Rausch-Verhältnisse auf als das mit dem GP-Ce6-SiNPs-System erhaltene und 3,46-mal höhere Signal-Rausch-Verhältnisse als das mit ICG-basierter NIR-Emissionsbildgebung erhaltene. Insgesamt verwendeten wir bei der Erkennung von S. aureus-Nephritis aufgrund der kontrastreichen Bildgebung des Trojan BLI-Systems Trojan BLI anstelle von Ce6- oder ICG-basierter Emissionsbildgebung.

a Biolumineszenzbildgebung von S. aureus (~1,0 × 108 KBE)-induzierter Nephritis bei Mäusen mit verschiedenen Behandlungen wie angegeben. Den infizierten Mäusen wurden GP-Si-BPs + PBS, GP-Si-BPs + Si-Luc, GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, Si-BPs, GP-Si-Luc und Si-BPs + injiziert Si-Luc jeweils in der gleichen Dosis (Mittelwert ± SD, n = 3). b Biolumineszenzbildgebung von S. aureus (~1,0 × 106 KBE)-induzierter Nephritis bei Mäusen mit unterschiedlichen Behandlungen wie angegeben. Den infizierten Mäusen wurden GP-Si-BPs + PBS, GP-Si-BPs + Si-Luc, GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, Si-BPs, GP-Si-Luc und Si-BPs + injiziert Si-Luc jeweils in der gleichen Dosis (Mittelwert ± SD, n = 3). c Biolumineszenzbildgebung von gesunden Mäusen (Kontrolle), Glycerin-Nephritis-tragenden Mäusen und S. aureus-Nephritis-tragenden Mäusen unter Verwendung der Trojan BLI-Sonden (Mittelwert ± SD, n = 3). d Lumineszenzbildgebung von gesunden Mäusen (Kontrolle), Glycerin-Nephritis-tragenden Mäusen und S. aureus-Nephritis-tragenden Mäusen durch intraperitoneale Verabreichung von Luminol (282 mM, 200 μl) (Mittelwert ± SD, n = 3). Alle Bildgebungsexperimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA-Analyse durchgeführt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar, die aus drei unabhängigen Messungen ermittelt wurde. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Allgemeingültigkeit der entwickelten Strategie bei der Bildgebung natürlicher Bakterien in tiefen Geweben zu bestätigen, haben wir ein weiteres Proof-of-Concept-Modell für STm-induzierte Kolitis bei Mäusen erstellt (ergänzende Abbildung 21a). Die tatsächliche STm-Menge an der Infektionsstelle während der Bildgebung wurde mit ~1,0 × 109 KBE bestimmt. Wie in Abb. 6a gezeigt, beobachteten wir in GP-Si-BPs + GP-Si-Luc-Gruppen viel stärkere Biolumineszenzsignale als in anderen Gruppen (p <0,0001). Bei der Ex-vivo-Bildgebung der isolierten Darmgewebe wurden konsistente Ergebnisse beobachtet (Abb. 6b). Um die Selektivität der entwickelten Trojan-BLI-Strategie gegen bakterielle Kolitis gegenüber anderen Kolitis zu belegen, konstruierten wir eine durch Dextransulfat-Natrium (DSS) induzierte Kolitis bei Mäusen (weiblich, 6–8 Wochen alt, n = 3) (ergänzende Abbildung 21b). Die DSS-Colitis-tragenden Mäuse wurden unter identischen Bedingungen mit GP-Si-BPs + GP-Si-Luc behandelt. Tatsächlich waren die Biolumineszenzsignale in STm-Gruppen, die mit GP-Si-BPs + GP-Si-Luc behandelt wurden, deutlich stärker als in den Kontroll- und DSS-Gruppen, die mit GP-Si-BPs + GP-Si-Luc behandelt wurden (p < 0,001) (Abb . 6c). Zum weiteren Vergleich verwendeten wir Luminol auch zur Abbildung von STm-Kolitis-tragenden Mäusen (ergänzende Abbildung 21c) oder DSS-Kolitis-tragenden Mäusen (ergänzende Abbildung 21d). Wie erwartet beobachteten wir im Vergleich zu vernachlässigbaren Signalen in Kontrollgruppen starke Lumineszenzsignale sowohl bei Mäusen mit STm-Kolitis, die mit Luminol behandelt wurden (p < 0,0001), als auch bei Mäusen mit DSS-Kolitis, die mit Luminol behandelt wurden (p < 0,01) (Abb. 6d). . Diese Ergebnisse zeigten zusammen, dass die entwickelte Trojaner-BLI-Strategie zwischen bakterieller Kolitis und anderer Kolitis unterscheiden konnte. Wir haben auch gezeigt, dass die entwickelte Trojaner-BLI-Strategie eine Langzeit- und Echtzeitdarstellung der STm-Kolitis bei Mäusen ermöglicht (Abb. 6e). Typischerweise konnten wir eine Stunde nach der Verabreichung von GP-Si-Luc noch deutliche Signale beobachten. Diese beobachtete anhaltende Lumineszenz zusammen mit der guten Spezifität wurde auf die selektive Anreicherung von Trojan BLI-Sonden in den Bakterienzellen im infizierten Darmgewebe zurückgeführt. Außerdem verglichen wir systematisch das GP-Ce6-SiNPs-System (einfache Anregung von Ce6)42, die Trojan-BLI-Strategie und die ICG-basierte NIR-Emissionsbildgebung bei der Bildgebung von STm-Kolitis (ergänzende Abbildung 22). Wie erwartet wies die Trojan BLI-Strategie ein 4,05-mal höheres Signal-Rausch-Verhältnis auf als das GP-Ce6-SiNPs-System und ein 3,45-mal höheres Signal-Rausch-Verhältnis als das ICG-basierte NIR-Emissionsbild. Aufgrund der kontrastreichen Bildgebung des Trojan BLI-Systems verwendeten wir bei der Erkennung von STm-Kolitis Trojan BLI anstelle von Ce6 oder ICG-basierter Emissionsbildgebung.

a Biolumineszenzbildgebung von STm (~1,0 × 109 KBE)-induzierter Kolitis bei Mäusen mit unterschiedlichen Behandlungen wie angegeben. Den infizierten Mäusen wurden GP-Si-BPs + PBS, GP-Si-BPs + Si-Luc, GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, Si-BPs, GP-Si-Luc und Si-BPs + injiziert Si-Luc jeweils in der gleichen Dosis (Mittelwert ± SD, n = 3). b Entsprechende Ex-vivo-Lumineszenzbilder von Darmgeweben, die aus STm-Colitis-tragenden Mäusen mit unterschiedlichen Behandlungen wie angegeben isoliert wurden. c Biolumineszenzbildgebung von gesunden Mäusen (Kontrolle), DSS-Kolitis-tragenden Mäusen und STm-Kolitis-tragenden Mäusen basierend auf den Trojan BLI-Sonden (Mittelwert ± SD, n = 3). d Lumineszenzbildgebung von gesunden Mäusen (Kontrolle), Mäusen mit DSS-Kolitis und Mäusen mit STm-Kolitis durch intraperitoneale Verabreichung von Luminol (282 mM, 200 μl) (Mittelwert ± SD, n = 3). e Zeitraffer-Biolumineszenzbildgebung von STm (~1,0 × 109 KBE)-induzierter Kolitis bei Mäusen basierend auf den Trojan BLI-Sonden. Alle Bildgebungsexperimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA-Analyse durchgeführt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar, die aus drei unabhängigen Messungen ermittelt wurde. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Neben der Biolumineszenzbildgebung von Bakterien besaßen die konstruierten GP-Si-BPs aufgrund der photothermischen Effekte, die durch ICG in GP-Si-BPs verursacht wurden, auch das Potenzial, Bakterien zu inaktivieren. Wie aus REM-Bildern von Bakterien (z. B. E. coli, S. aureus) hervorgeht (ergänzende Abbildung 23a), beobachteten wir faltige oder lysierte Bakterienzellen nur in den Gruppen, in denen die Bakterien mit GP-Si-BPs (0,06) inkubiert wurden mM) für 2,5 Stunden und dann mit einem 808-nm-Laser (1,0 W cm-2) für 5 Minuten bestrahlt. Wir haben solide Beweise vorgelegt, die die Überlegenheit von GP-Si-BPs im direkten Vergleich zu den klinisch verwendeten Antibiotika (z. B. Vancomycin (Van), Ampicillin (Ampi)) hervorheben (ergänzende Abbildung 23b). Insgesamt hat die vorgestellte Strategie zwei deutliche Vorteile gegenüber Antibiotika bei der Abtötung von Bakterien: (1) GP-Si-BPs können sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien abtöten, während Vancomycin nur bei grampositiven Bakterien anwendbar ist (z. B. S. aureus, M. luteus und MRSA); (2) Die entwickelte Strategie zeigt während einer Kurzzeitbehandlung (z. B. 2 Stunden und 30 Minuten) dominante antibakterielle Raten (z. B. > 90 %), während Vancomycin oder Ampicillin selbst bei 15 µg mL-1 selbst bei dieser Behandlung geringere antibakterielle Raten zeigen Die Behandlungszeit beträgt bis zu 7 Stunden (z. B. <65 %) (Ergänzende Abbildungen 23c und 23d). Diese Ergebnisse belegen überzeugend den Nutzen solcher Behandlungen zur Abtötung von Bakterien im Vergleich zu Antibiotika.

Um die antibakterielle Fähigkeit der entwickelten Strategie in vivo zu bewerten, untersuchten wir ihre photothermische Wirksamkeit im Proof-of-Concept-Modell der bakteriellen Nephritis bei Mäusen (ergänzende Abbildung 24). Nach der Behandlung haben wir auch das infizierte Nierengewebe herausgeschnitten, es anschließend homogenisiert und die Homogenisate auf Platten kultiviert. Wie in Abb. 7a, b dargestellt, stellten wir fest, dass die sporadischen Kolonien nach 7-tägiger Behandlung in der GP-Si-BPs + 808-nm-Lasergruppe vorhanden waren. Quantitativ wurde die antibakterielle In-vivo-Rate von GP-Si-BPs unter Laserbestrahlung gegen S. aureus mit 96,0 % berechnet. In Übereinstimmung mit den Agarplattenexperimenten zeigten die Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbungsdaten (Abb. 7c), dass die klare Gewebetextur und keine Zellnekrose nur in der GP-Si-BPs + 808-nm-Lasergruppe gefunden wurde. Die PPT-Effekte trugen zu den hohen antibakteriellen Raten bei. Wir haben eine IR-Wärmebildkamera verwendet, um die fotothermischen In-vivo-Bilder aufzuzeichnen. Wie in Abb. 7d dargestellt, trat der schnelle Temperaturanstieg nur in der GP-Si-BPs + 808-nm-Lasergruppe auf. Insbesondere konnte in dieser Gruppe die Nierentemperatur nach 5-minütiger Bestrahlung auf 52 °C ansteigen. Mittlerweile ermöglichte die entwickelte Trojaner-BLI-Strategie auch die dynamische Visualisierung der antibakteriellen Wirkung bei Mäusen. Experimentell wurde Mäusen nach jeder Bestrahlung die gleiche Dosis GP-Si-Luc intraperitoneal injiziert, gefolgt von einer Biolumineszenz-Bildgebung, um die heilende Wirkung zu bewerten. Wie in Abb. 7e dargestellt, nahmen die Biolumineszenzsignale mit fortschreitender Behandlung allmählich ab. Wie erwartet stimmte der Änderungstrend der Biolumineszenzsignale mit dem Änderungstrend der Bakterienzahl nach der Behandlung überein. Durch die quantitative Analyse haben wir herausgefunden, dass bakterienkonzentrationsabhängige BLI-Signale ein wichtiger Indikator für die Erkennung und Behandlung sind. Diese therapeutischen Daten bewiesen zusammen die anpassungsfähige antibakterielle Fähigkeit der entwickelten Strategie in vivo.

a, b Homogenate infizierter Nieren von Mäusen mit Nephritis, die 7 Tage nach der Injektion mit PBS oder GP-Si-BPs mit oder ohne Bestrahlung (mit Bestrahlung eines 808-nm-Lasers, 1,0 W cm−2, 5 min) behandelt wurden Kultivierung auf dem festen LB-Agar (a) und entsprechende Quantifizierung der Bakterienbesiedlung (Mittelwert ± SD, n = 3 biologisch unabhängige Proben) (b). c Entsprechende histologische Bilder von S. aureus-infizierten Nierengeweben von Mäusen mit unterschiedlichen Behandlungen wie angegeben. Maßstabsbalken, 25 μm. d, Repräsentative photothermische Bilder von S. aureus-Nephritis-tragenden Mäusen, die mit PBS oder GP-Si-BPs mit oder ohne Bestrahlung (mit Bestrahlung eines 808-nm-Lasers, 1,0 W cm-2, 5 min) behandelt wurden, 7 Tage nach der Behandlung. Injektion. e Biolumineszenz-Bildgebung von S. aureus-Nephritis-tragenden Mäusen zu verschiedenen Behandlungszeitpunkten unter Verwendung von Trojan BLI-Sonden und die entsprechende Beziehung zwischen der Änderung der Biolumineszenzintensität über die Zeit und der Änderung der Bakterienzahl über die Zeit durch quantitativen Vergleich. Nach jeder Bestrahlung wurde den Mäusen zur Bildgebung die gleiche Dosis GP-Si-Luc intraperitoneal injiziert, um die heilende Wirkung zu bewerten (Mittelwert ± SD). Alle Bildgebungsexperimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA-Analyse durchgeführt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar, die aus drei unabhängigen Messungen ermittelt wurde. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Letztendlich untersuchten wir systematisch die Toxizität von GP-Si-BPs und GP-Si-Luc. Wie aus der ergänzenden Abbildung 25 hervorgeht, veränderten sich die Morphologien von HEK-293T-, mREC-, HeLa- oder MCF-7-Zellen kaum, wenn sie mit GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (0, 06 mM) inkubiert wurden. Auch die Zelllebensfähigkeit dieser Zellen blieb mithilfe der Methylthiazolyltetrazolium (MTT)-Tests über 80 %. Diese Ergebnisse legen die schwache Zytotoxizität von GP-Si-BPs und GP-Si-Luc nahe. Wir verwendeten Blutbiochemie und routinemäßige Blutanalysen, um die systematische Toxizität von GP-Si-BPs und GP-Si-Luc in der getesteten Dosis zu testen. Wie in den Ergänzungstabellen 2 und 3 gezeigt, lagen im Vergleich zur PBS-Gruppe alle biochemischen Indikatoren in der GP-Si-BPs-Gruppe oder der GP-Si-Luc-Gruppe im normalen Bereich. Darüber hinaus führten wir auch H&E- (ergänzende Abbildung 26a) und Massons Trichrom-Färbung (ergänzende Abbildung 26b) der wichtigsten Organe durch, die den Mäusen nach einem Tag intravenöser Injektion von GP-Si-BPs (0,06 mM) oder GP-Si- entnommen wurden. Luc (0,06 mM). Insgesamt fanden wir keine offensichtlichen histopathologischen Anomalien in den Abschnitten der resezierten Organe, was auf die vernachlässigbare In-vivo-Toxizität von GP-Si-BPs oder GP-Si-Luc hinweist. Wie sich in der Ex-vivo-Fluoreszenzbildgebung wichtiger Organe, die gesunden Mäusen nach intravenöser Injektion von GP-Si-BPs entnommen wurden, weiter zeigte (ergänzende Abbildung 27a), wurden helle Fluoreszenzsignale hauptsächlich in Leber und Niere und nicht in anderen Organen 2 Stunden nach der Operation beobachtet. Injektion und würde 48 Stunden nach der Injektion vollständig verschwunden sein. Darüber hinaus wurden starke Fluoreszenzsignale in den Urinproben gesunder Mäuse 24 Stunden nach der Injektion von GP-Si-BPs beobachtet (ergänzende Abbildung 27b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die konstruierten Sonden aus dem Körper ausgeschieden werden könnten.

Hierin haben wir eine Trojaner-Strategie entwickelt, um Luciferase und Luciferin selektiv und robust in verschiedene natürliche Bakterien einzuschleusen und die Bakterienverteilung in vivo mit Biolumineszenz zu visualisieren. Biolumineszenz als vielversprechende nicht-invasive Selbstlumineszenz-Bildgebungsmethode bezieht sich auf die Photonenemission der exothermen Oxidation des entsprechenden Luciferins, die durch Luciferase katalysiert wird18,19,20,21,22,23,24,25. Trotz der großen Aussichten der Biolumineszenz ist die Abbildung kommensaler und pathogener Bakterien aufgrund der folgenden Einschränkungen bisher kaum möglich: (1) Die endogene Biolumineszenz wurde nur von einigen bestimmten gentechnisch veränderten Bakterien erzeugt und war auf die meisten natürlichen Bakterien nicht anwendbar. (2) Die Erzeugung exogener Biolumineszenz erforderte die Beteiligung von bakteriellem ATP, das durch bakterielle Lyse gewonnen wurde29,30,31,32,33,34. Eine einfachere Möglichkeit, verschiedene natürliche Bakterien in vivo mit Biolumineszenz sichtbar zu machen, könnte darin bestehen, biolumineszierende Reporter selektiv in Bakterienzellen einzuschleusen und dabei das ATP im Inneren der Bakterien direkt zu verbrauchen, stellt jedoch aufgrund der elektrostatischen Ladung oder Größenbarrieren, die durch die einzigartige bakterielle Plasmamembran auferlegt werden, technische Herausforderungen dar und Zellwand. Interessanterweise konnten in den 1980er Jahren entwickelte Trojaner-Antibiotika-Strategien mit Siderophoren konjugierte Antibiotika über die Eisenimporteure der Bakterien in das bakterielle Zytoplasma transportieren35,36,37,38,39,40,41. Davon inspiriert haben wir eine BLI-Strategie für Trojaner vorgeschlagen.

Im Gegensatz zu den Trojaner-Antibiotika-Strategien wurden in unserem Design die Biolumineszenzindikatoren auf GP-modifizierte SiNPs geladen und über ABC-Zuckertransporter in Bakterien transportiert. Bemerkenswert ist, dass SiNPs als Vektoren aufgrund ihrer geringen/keinen Toxizität in großem Umfang in verschiedenen Bioanwendungen eingesetzt werden58,59,60,61,62,63,64. Wie bereits berichtet, konnten SiNPs biologisch abgebaut und in vivo ohne ausgeprägte Toxizität renal ausgeschieden werden65,66. Beispielsweise haben Toxizitätsbewertungen bei Caenorhabditis elegans, Seidenraupen und sogar bei nichtmenschlichen Primaten-Tier-Modellen (z. B. Javaneraffen) gezeigt, dass die internalisierten SiNPs die Morphologie, Physiologie oder angeborenen Immunfunktionen von Tieren nicht beeinflussen würden, was auf eine gutartige Biokompatibilität von Tieren schließen lässt SiNPs in lebenden Organismen67,68,69. Auf dieser Grundlage haben kleine SiNPs im Januar 2011 die von der Food and Drug Administration (FDA) genehmigte Zulassung für neue Prüfpräparate für die erste klinische Studie am Menschen erhalten (dh NCT01266096, NCT02106598)70,71. Aus diesem Grund haben wir die SiNPs als Vehikel für die Bereitstellung von Biolumineszenzindikatoren ausgewählt. Zu den Biolumineszenzindikatoren gehörten Luciferase und zwei organische Farbstoffe, Cy5 und ICG. Dadurch kann eine NIR-Emission mithilfe eines Dual-Resonanz-Energietransfer-Relay-Prozesses erreicht werden, der BRET zwischen Luciferase und Cy5 und FRET zwischen Cy5 und ICG kombiniert. Dadurch hat die entwickelte Strategie das Potenzial, Bakterien in tiefen Geweben in bestimmten klinischen Umgebungen abzubilden. Ungeachtet dessen erfordert die Kombination von Luciferase, Cy5 und ICG relativ komplizierte Arbeiten zur Probenvorbereitung und quantitativen Analyse, was die Auswirkungen dieser Arbeit erheblich verringert. In der folgenden Studie würden wir ein einfacheres System testen.

Andererseits hat die bahnbrechende Forschung der letzten drei Jahrzehnte die Mechanismen aufgeklärt, durch die die einzigartige Kohlenstoffquelle von Bakterienzellen wie Maltodextrine, Amylose und Stärke sowie (1-4)-glucosidisch verknüpfte Cyclodextrine selektiv internalisiert werden konnten in Bakterienzellen über den bakterienspezifischen ABC-Zuckertransporter46,47,48,49,50,51,52,53. Diese Erkenntnisse haben jedoch nicht zu Strategien geführt, die auf ABC-Transportern basieren und erfolgreich biolumineszierende Fracht in Bakterienzellen transportieren. Um diese Lücke zu schließen, nutzten wir bakterienspezifische ABC-Zuckertransporter, um Luciferase und Luciferin selektiv zu internalisieren, indem wir sie per Anhalter auf GP-Molekülen mit einem Dextroseäquivalent von 4,0–7,0 transportierten. Die synthetisierten Trojaner-BLI-Sonden wurden selektiv sowohl in grampositive Bakterien (z. B. S. aureus, klinisch abgeleitetes MRSA) als auch in gramnegative Bakterien (z. B. STm, klinisch abgeleitetes MDR E. coli) mit hoher Aufnahmerate internalisiert auf 50 %. Wir haben seine Fähigkeit in der Ex-vivo-Bildgebung bakterieller Endophthalmitis beim Menschen gezeigt. Wir haben seine selektive Wirkung gegen bakterielle Nephritis und bakterielle Kolitis bei Mäusen im Vergleich zu anderen Arten von Nephritis und Kolitis bei Mäusen gezeigt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die entwickelte Strategie die photothermische Abtötung von fast 95 % der antibiotikaresistenten Bakterien in vitro und in vivo ermöglicht. Wir gehen davon aus, dass die vorgeschlagene Trojaner-BLI-Strategie die Abgabe verschiedener Substanzen in Bakterienzellen katalysieren könnte, was die Entwicklung verschiedener bildgebender oder therapeutischer Ansätze ermöglichen könnte, wobei die in dieser Arbeit beschriebene Biolumineszenz-Bildgebung von Bakterien als erster Grundsatzbeweis dienen könnte.

Das Forschungsprotokoll mit menschlichen Blutproben wurde von der Ethikkommission der Universität Soochow genehmigt. Die Proben wurden nach schriftlicher Einverständniserklärung bereitgestellt. Die Autoren erklären, dass alle menschlichen Blutexperimente in strikter Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und institutionellen Richtlinien durchgeführt wurden. Klinische Proben wurden von der Augenbank des Augen-, Ohren-, Nasen- und Rachenkrankenhauses der Fudan-Universität mit Genehmigung der Ethikkommission des Krankenhauses bereitgestellt (EENTIRB-2017-06-07-01). Alle Experimente wurden im Einklang mit der Deklaration von Helsinki und in Übereinstimmung mit chinesischem Recht durchgeführt.

Durch 7-tägige Bestrahlung der Mischung aus C6H17NO3Si und 1,8-Naphthalimid bei 365 nm bei Raumtemperatur wurden die kleinen fluoreszierenden SiNPs hergestellt. Anschließend wurde die resultierende Lösung durch 15-minütige Zentrifugation bei 3381 x g und Dialyse (MWCO, 1000, Spectra/Pro) gereinigt, um nicht umgesetzte Reagenzien zu entfernen. Die Endprodukte der SiNPs wurden durch Eindampfen gesammelt und für die folgenden Experimente bei 4 °C gelagert. Um GP-modifizierte SiNPs (GP-SiNPs) zu erhalten, wurde die Mischung aus SiNPs-Lösung (200 μL, 0,08 mM) und GP-Lösung (100 μL, 0,56 mM) 6 Stunden lang kontinuierlich bei 70 °C gerührt, gefolgt von der Zugabe von 0,01 mg NaBH4 für weitere 12 h bei Raumtemperatur reagieren lassen. Die resultierende Lösung wurde mit Nanosep-Zentrifugengeräten (MW-Grenzwert 3 kDa; Millipore) durch 15-minütige Zentrifugation bei 5283 x g gereinigt, um die nicht umgesetzten GP-Moleküle zu entfernen. Um Cy5- und ICG-Moleküle weiter zu laden, wurden Cy5-Lösung (2 μl, 0,56 mM) und ICG-Lösung (12 μl, 0,56 mM) in die oben hergestellte GP-SiNPs-Lösung gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. In ähnlicher Weise wurde die resultierende Lösung mit Nanosep-Zentrifugengeräten (MW-Grenzwert 3 kDa; Millipore) durch 10-minütige Zentrifugation bei 6010 x g gereinigt, um die unbeladenen Cy5- und ICG-Moleküle zu entfernen. Anschließend wurden aminhaltige Luciferase-Lösung (0,1 ml, 0,06 mM), EDC-Lösung (2 μL, 10 mM) und NHS-Lösung (10 μL, 17 mM) zu der oben hergestellten Lösung gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur umgesetzt GP-Si-BPs erhalten. Außerdem wurde die resultierende Lösung mit Nanosep-Zentrifugalgeräten (MW-Grenzwert 100 kDa; Millipore) durch 15-minütige Zentrifugation bei 5283 x g gereinigt. Analog wurde GP-Si-Luc auch durch Zugabe von D-Luciferin (0,1 ml, 0,30 mM), EDC-Lösung (2 μL, 10 mM) und NHS-Lösung (10 μL, 17 mM) zur GP-SiNPs-Lösung synthetisiert Nacht bei Raumtemperatur, gefolgt von dem identischen gereinigten Protokoll.

Die Morphologie und Größe der Trojaner-BLI-Sonden wurden mithilfe eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM, Philips CM 200) mit 200 kV charakterisiert. Die UV-Vis-Absorptionsspektren von Trojan BLI-Sonden wurden mit einem 750 UV-Vis-Nahinfrarot-Spektrophotometer (Perkin-Elmer Lambda) aufgezeichnet. Die Photolumineszenzspektren der Trojan BLI-Sonden wurden mit einem Spektrofluorimeter (HORIBA JOBIN YVON FLUORMAX-4) aufgezeichnet. Die Biolumineszenzspektren der Trojan BLI-Sonden wurden mit einem HITACHI Fluoreszenzspektrometer F-4700 aufgezeichnet. Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zeta-Potenziale von Trojan BLI-Sonden wurden mit einem Delsa™ Nano-Submikron-Partikelgrößen- und Zeta-Potenzial-Partikelanalysator (Beckman Coulter, Inc.) gemessen. Die Fluoreszenzbildgebung von Bakterien in vitro wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM, Leica, TCS-SP5 II) durchgeführt. Ex-vivo- und In-vivo-Fluoreszenz- und Biolumineszenzbilder wurden mit einem optischen In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS Lumina III) aufgenommen. Lumineszenzsignale von GP-Si-BPs in verschiedenen Lösungen wurden mit einem IVIS Lumina III-Bildgebungssystem untersucht. Zu diesem Zweck wurde GP-Si-BPs in einer Konzentration von 0,06 mM mit ATP in unterschiedlichen Konzentrationen in einer schwarzen 96-Well-Platte gemischt. Nach gründlichem Mischen wurde die Platte sofort in das Bildgebungssystem gegeben, um Lumineszenzsignale zu erfassen. In ähnlicher Weise wurde die abgeschwächte Lumineszenz von GP-Si-BPs nach Inkubation mit einem ATP-Inhibitor, DCC, in Gegenwart von GP-Si-Luc quantifiziert.

Klinisch gewonnener multiresistenter Staphylococcus aureus (MRSA) und multiresistenter Escherichia coli (MDR E. coli) wurden aus Patienten mit Keratitis isoliert und von der Eye Bank of the Eye, Ear, Nose and Throat Hospital der Fudan University bereitgestellt. unter Genehmigung der Ethikkommission des Krankenhauses (EENTIRB-2017-06-07-01). Escherichia coli (ATCC 11303) und Staphylococcus aureus wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) gekauft. Micrococcus luteus (BNCC 102589), Pseudomonas aeruginosa (BNCC 125486) und Salmonella typhimurium (BNCC 108207) wurden von der BeNa Culture Collection (BNCC, Shanghai, China) erworben. Das LB-Medium wurde von Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. gekauft. Um die Bakterien zu kultivieren, lösten wir zunächst das lyophilisierte Pulver der Stämme im LB-Flüssigmedium auf, schichteten dann die Bakterienflüssigkeit auf das LB-Plattenmedium und kultivierten sie darin Inkubator bei 37 °C für 12 Stunden. Danach haben wir eine einzelne Kolonie von der Platte ausgewählt und sie im LB-Flüssigmedium im Inkubator bei 250 U/min und 37 °C kultiviert. Wir haben die Bakterienzellen in der exponentiellen Wachstumsphase gesammelt. Die Bakterienkonzentration wurde durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm ermittelt. Die Anzahl der Bakterienkolonien wurde mit einem Koloniezählgerät (Czone 8) gezählt. Die Experimente wurden gemäß der Deklaration von Helsinki und in Übereinstimmung mit chinesischem Recht durchgeführt.

Die 20 µL der gereinigten und resuspendierten Bakteriensuspension (1,0 × 107 KBE) wurden mit GP-Si-BPs (0,06 mM, 200 µL), GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) und GP-Si-BPs (0,06 mM, 200 µL) inkubiert. BPs (0,06 mM, 200 µL) + GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 µL), Si-BPs (0,06 mM, 200 µL), Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) und Si-BPs (0,06 mM). , 200 µL) + Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) für 2,5 Stunden in einem Schüttelinkubator (250 U/min) bei 37 °C. Die Bakterien wurden durch 5-minütiges Zentrifugieren der Mischung bei 3381 x g in Eppendorf-Röhrchen (EP) geerntet. Die resultierenden Bakterien wurden erneut suspendiert und dreimal mit PBS gewaschen. Dann wurden 10 µL der gewaschenen Bakterienlösung auf einen mit einem Deckglas bedeckten Objektträger übertragen und dann mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM, Leica, TCSSP5 II) mit 30 % Diodenlaserleistung abgebildet. Alle Fluoreszenzbilder wurden von CLSM mit einem × 64-Ölimmersionsobjektiv und unter den gleichen optischen Bedingungen aufgenommen, und das Mikroskop wendete automatisch die gleiche Helligkeit und den gleichen Kontrast auf die Bilder an. Die Verarbeitung und Analyse des ROI wurde mit der kommerziellen Bildanalysesoftware (Leica Application Suite Advanced Fluoreszenz Lite) durchgeführt. Darüber hinaus wurde das Auftreten von GP-Si-BPs in den Bakterienzellen durch TEM (Philips CM 200) bestätigt.

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden gemäß dem vom Tierpflegeausschuss der Universität Soochow genehmigten Protokoll durchgeführt. Die Haltungsbedingungen für die Mäuse betrugen 25 °C und 65 % Luftfeuchtigkeit, eingestellt durch die Belüftungsausrüstung und das Luftfiltersystem. Um eine STm-induzierte Kolitis bei Mäusen zu konstruieren, wurden weibliche Nacktmäuse (SPF-Qualität, 6–8 Wochen alt) vor der oralen Verabreichung von STm mit 100 μl Streptomycinlösung (200 mg mL-1) behandelt. Am zweiten Tag nach der Infektion wurden den Mäusen GP-Si-BPs oder Si-BPs (0,06 mM, 200 µL) intravenös injiziert. 6 Stunden nach der Sondeninjektion wurde den behandelten Mäusen intraperitoneal GP-Si-Luc oder Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) injiziert, gefolgt von BLI unter Verwendung eines optischen In-vivo-Bildgebungssystems (IVIS Lumina III, Exposition). Zeit = 5 min, f/stop = 1, Binning = 8, FOV = 21,8 cm) 15 min nach der Substratinjektion. Zum Vergleich wurde den infizierten Mäusen intraperitoneal Luminol (282 mM, 200 μl) injiziert, gefolgt von BLI unter Verwendung eines optischen In-vivo-Bildgebungssystems (IVIS Lumina III, Belichtungszeit = 5 Minuten, Blende = 1, Binning =). 8, FOV = 21,8 cm) 10 Minuten nach der Injektion. Wir nutzten die Entnahme, Homogenisierung und Kultivierung von Darmgewebe mit KBE-Zählung, um während der Bildgebung die tatsächliche Anzahl der Bakterien an den Infektionsstellen zu bestimmen. Die tatsächliche STm-Konzentration an der Infektionsstelle während der Bildgebung betrug ~1,0 × 109 KBE. Um die Selektivität der vorgeschlagenen Strategie zu testen, konstruierten wir eine DSS-induzierte Kolitis bei Mäusen (weiblich, 6–8 Wochen alt, n = 3). Die DSS-Colitis-tragenden Mäuse wurden mit GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) oder Luminol (282 mM, 200 µL) für die Lumineszenzbildgebung (IVIS Lumina III, Belichtungszeit = 5 Min.) behandelt. f/stop = 1, Binning = 8, FOV = 21,8 cm) auf die gleiche Weise wie oben erwähnte STm-Colitis-tragende Mäuse. Um eine durch S. aureus induzierte Nephritis bei Mäusen zu konstruieren, wurden 25 μl S. aureus in situ in die Niere der Nacktmäuse injiziert (weiblich, 6–8 Wochen alt, n = 3). 12 Stunden nach der Injektion wurden den infizierten Mäusen 200 μl 0,06 mM GP-Si-BPs oder Si-BPs intravenös injiziert. Sechs Stunden später wurde diesen Mäusen GP-Si-Luc oder Si-Luc (0,06 mM, 200 μl) intraperitoneal injiziert, gefolgt von einer In-vivo-Bildgebung mit einem optischen Bildgebungssystem (IVIS Lumina III, Belichtungszeit = 5 Minuten, f /stop = 1, Binning = 8, FOV = 21,8 cm) 15 Minuten nach der Injektion. Die tatsächliche S. aureus-Konzentration an der Infektionsstelle während der Bildgebung betrug ~1,0 × 108 KBE, was durch Entnahme, Homogenisierung und Kultivierung von Nierengewebe mit der oben genannten KBE-Zählung bestimmt wurde. Um die Selektivität der vorgeschlagenen Strategie gegen bakterielle Nephritis gegenüber anderen Nephritis zu testen, konstruierten wir außerdem eine durch Glycerin verursachte Nephritis bei Mäusen (weiblich, 6–8 Wochen alt, n = 3). Die Glycerin-Nephritis-tragenden Mäuse wurden mit GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) oder Luminol (282 mM, 200 µL) für die Lumineszenzbildgebung (IVIS Lumina III, Belichtungszeit = 5 Min.) behandelt. f/stop = 1, Binning = 8, FOV = 21,8 cm) auf die gleiche Weise wie oben erwähnte DSS-Nephritis-tragende Mäuse.

S. aureus oder E. coli wurden jeweils mit PBS oder GP-Si-BPs inkubiert, gefolgt von der Bestrahlung mit einem 808-nm-Laser (808-nm-Laser: 1,0 W cm−2, 5 min). Die Morphologie der Bakterien nach der Behandlung wurde mithilfe von SEM (FEI Quanta 200 F) charakterisiert. S. aureus, E. coli, M. luteus, P. aeruginosa, MRSA und MDR E. coli wurden jeweils mit PBS, SiNPs, Si-BPs und GP-Si-BPs behandelt, gefolgt von der Bestrahlung mit einem 808-nm-Laser (808). -nm-Laser, 1,0 W cm−2, 5 min). Die antibakterielle Rate in vitro wurde anhand der Bakterienkolonien auf den Agarplatten ermittelt. Die antibakterielle Rate wurde gemäß Gl. berechnet. (1):

wobei „Ncontrol“ und „Nexperiment“ die Bakterienzahl (CFU mL−1) in den Kontrollgruppen von „PBS“ bzw. anderen Versuchsgruppen (Experiment) darstellen.

Wir verwendeten die S. aureus-induzierte Nephritis bei Mäusen, um die antibakterielle Fähigkeit der entwickelten Strategie in vivo zu bewerten. Um das Modell zu konstruieren, wurden S. aureus (25 μl, ~1,1 × 106 KBE) vor Ort in die linke Niere der Mäuse injiziert (weiblich, 6–8 Wochen alt, n = 3). 6 Stunden nach der Injektion wurden diesen Mäusen am Tag 1, Tag 3, Tag 5 und Tag 7 jeweils 200 μl 0,06 mM GP-Si-BPs oder PBS-Puffer intravenös injiziert. Sechs Stunden nach jeder Medikamenteninjektion wurden die infizierten Stellen mit oder ohne 808-nm-Laser (1,0 W cm-2, 5 Min.) bestrahlt. Nach der photothermischen Therapie wurden die infizierten Nierenprodukte extrahiert, anschließend homogenisiert und die Homogenisate auf Platten kultiviert. Die entsprechende antibakterielle Rate wurde basierend auf Gl. berechnet. (1). In der Zwischenzeit wurden die infizierten Nierengewebe nach der Behandlung für die folgende H&E-Färbung in der 4 %igen PFA-Lösung fixiert.

Menschliche embryonale Nieren-293-T-Zellen (HEK-293T-Zellen), menschliche Gebärmutterhalszellen (HeLa-Zellen), menschliche Brustkrebszellen (MCF-7-Zellen) und retinale Endothelzellen der Maus (mREC-Zellen), kultiviert im modifizierten Eagle-Medium von Dulbecco mit hoher Konzentration Glucose (H-DMEM) wurden von Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd (China) gekauft. Alle oben genannten Medien wurden mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % relevanten Antibiotika (100 μg mL-1 Streptomycin und 100 U mL-1 Penicillin) ergänzt. Alle Zelllinien wurden bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 und feuchter Atmosphäre kultiviert.

Menschliche Blutproben wurden von einem gesunden Freiwilligen nach schriftlicher Einverständniserklärung bereitgestellt. Die Studienprotokolle mit menschlichen Blutproben wurden von der Ethikkommission der Soochow-Universität genehmigt. Die Autoren geben an, dass alle menschlichen Blutexperimente in strikter Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und institutionellen Richtlinien durchgeführt wurden. Bei zehn Patienten mit bakterieller Endophthalmitis, die sich einer Glaskörperoperation unterzogen, wurden während der diagnostischen Pars-plana-Vitrektomie (PPV) unkontaminierte, unverdünnte Glaskörperflüssigkeitsproben (0,1 ml) in einer Spritze mit einer 30-G-Nadel gesammelt. Unmittelbar nach der Entnahme wurde die Probe in ein vorsterilisiertes Mikrozentrifugenröhrchen überführt und für die Bildgebung verwendet. Diese klinischen Proben wurden auch von der Eye Bank of the Eye, Ear, Nose and Throat Hospital der Fudan-Universität mit Genehmigung der Ethikkommission des Krankenhauses bereitgestellt (EENTIRB-2017-06-07-01).

Für den statistischen Signifikanztest verwendeten wir eine einfaktorielle ANOVA-Analyse oder den gepaarten zweiseitigen T-Test. Die statistische Analyse wurde mit der Software von Origin oder GraphPad Prism durchgeführt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar, die aus drei unabhängigen Messungen ermittelt wurde. Der interessierende Bereich (ROI) wurde für quantitative Bewertungen der Fluoreszenzintensität verwendet, die mit der kommerziellen Bildanalysesoftware (Leica Application Suite Advanced Fluoreszenz Lite 2. 6. 0, LAS AF Lite 2. 6. 0) berechnet wurde.

Die Gruppengrößen für Experimente wurden auf der Grundlage früherer Erfahrungen und der Vorrangstellung in der Literatur ausgewählt, sodass eine ausreichende Anzahl verwendet wurde, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen und Standardabweichungen zu bestimmen. Die Anzahl der Tiere betrug mindestens 3. Für jede Probe wurden zwei technische Replikate durchgeführt. Bei einer Abweichung von 20 % oder mehr zwischen den technischen Replikaten wurden zusätzlich zwei technische Replikate durchgeführt. Alle Experimente wurden mit mindestens drei Replikatproben für jede Versuchsgruppe durchgeführt und wir bestätigten, dass alle Replikationsversuche erfolgreich waren. Es wurden keine Daten von den Analysen ausgeschlossen. Die Proben wurden nach dem Zufallsprinzip in Versuchsgruppen eingeteilt. Die gesamte Datenerfassung und -analyse erfolgte anhand von verblindeten, randomisierten Stichproben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Prof. Shuit-Tong Lee (Soochow University, China), Prof. Chunhai Fan (Shanghai Jiao Tong University, China) und Dr. Fei Peng (Harvard University, USA) für ihre allgemeine Hilfe und wertvollen Vorschläge. YH gibt bekannt, dass die in dieser Studie beschriebene Forschung von der National Natural Science Foundation of China [Fördernummer 21825402], Program for Jiangsu Specially Appointed Professors to Professor Yao He, unterstützt wird, einem Projekt, das vom Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) finanziert wird ), 111 Projekt- und kollaboratives Innovationszentrum von Suzhou Nano Science and Technology (NANO-CIC). HYW gibt bekannt, dass die in dieser Studie beschriebene Forschung von der National Natural Science Foundation of China [Fördernummer 22074101] und der Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China [Fördernummer BK20191417] unterstützt wird. JXH gibt bekannt, dass die in dieser Studie beschriebene Forschung von der National Natural Science Foundation of China [Fördernummer 81970766, 82171102], dem Shanghai Innovation Development Program [Fördernummer 2020-RGZN-02033] und dem Shanghai Key Clinical Research Program [Fördernummer SHDC2020CR3052B] unterstützt wird ]. BS gibt bekannt, dass die in dieser Studie beschriebene Forschung von der National Natural Science Foundation of China [Fördernummer 22204116] und der Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China [Fördernummer BK20200851] unterstützt wird. Die BBC gibt bekannt, dass sie die in dieser Studie beschriebene Forschung von der National Natural Science Foundation of China [Fördernummer 22204117] und der China Postdoctoral Science Foundation [Fördernummer 2021M692347] unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Qian Zhang, Bin Song, Yanan Xu.

Suzhou Key Laboratory of Nanotechnology and Biomedicine, Institute of Functional Nano & Soft Materials & Collaborative Innovation Center of Suzhou Nano Science and Technology (NANO-CIC), Soochow University, Suzhou, 215123, China

Qian Zhang, Bin Song, Yanan Xu, Yunmin Yang, Jianping Lu, Jiali Ding, Haiting Cao, Binbin Chu, Houyu Wang und Yao He

Abteilung für Augenheilkunde und Sehwissenschaft, Shanghai Eye, Ear, Nose and Throat Hospital, Fudan University, Shanghai, China

Jian Ji, Wenjun Cao und Jiaxu Hong

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QZ, BS, JXH, YNX, YMY, HYW und YH haben die Forschung konzipiert und gestaltet. QZ und BS führten die meisten Experimente durch und analysierten die Daten. YMY, JJ, WJC, JPL, JLD, HTC und BBC führten zusätzliche Experimente und Charakterisierungen durch. QZ, YNX, JXH, HYW und YH haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Jiaxu Hong, Houyu Wang oder Yao He.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, Q., Song, B., Xu, Y. et al. In-vivo-Biolumineszenzbildgebung natürlicher Bakterien in tiefen Geweben mittels ATP-bindendem Kassetten-Zuckertransporter. Nat Commun 14, 2331 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37827-9

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Eingegangen: 27. Oktober 2022

Angenommen: 03. April 2023

Veröffentlicht: 22. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37827-9

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