Koplanare Einbettung mehrerer 3D-Zellmodelle in Hydrogel in Richtung Hoch

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 9991 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Für die Herstellung und experimentelle Handhabung einiger 3D-In-vitro-Modelle wurden standardisierte Hochdurchsatzmethoden entwickelt. Es fehlen jedoch noch angepasste Analysewerkzeuge für Wissenschaftler und Forscher, um das Potenzial komplexer Zellmodelle in der präklinischen Arzneimittelprüfung und Präzisionsmedizin voll auszuschöpfen. Die Histologie ist die etablierte, kostengünstige und Goldstandardmethode zur strukturellen und funktionellen Gewebeanalyse. Die Anwendung histologischer Standardverfahren auf 3D-Zellmodelle ist jedoch schwierig und kostspielig, da ihre geringe Größe häufig zu einer schlechten Ausrichtung der Proben führt, was den Analysedurchsatz verringert. Diese Arbeit schlägt einen neuen Ansatz vor: HistoBrick erleichtert die histologische Verarbeitung von Sphäroiden und Organoiden, indem es die Geleinbettung von 3D-Zellmodellen mit präziser koplanarer Ausrichtung parallel zur Schnittebene ermöglicht und so den Verlust von Probenmaterial minimiert. Die Funktionen von HistoBrick sind mit Automatisierungsstandards kompatibel und ermöglichen möglicherweise einen automatisierten Probentransfer von einer Multi-Well-Platte zum Gelgerät. Darüber hinaus wurde die Technologie von HistoBrick validiert, indem die Ausrichtung von HepG2-kultivierten Sphäroiden mit einem Durchmesser von 150–200 µm und einer Höhengenauigkeit von ± 80 µm demonstriert wurde. HistoBrick ermöglicht die Untersuchung von bis zu 96 Proben in minimalen Schnitten und ebnet so den Weg zur Hochdurchsatz-Mikrohistologie.

Dreidimensionale (3D) In-vitro-Zellmodelle erfreuen sich zunehmender Beliebtheit, da sie im Vergleich zu zweidimensionalen (2D) Kulturen bessere physiologisch relevante Gewebefunktionen, Architektur und Schnittstellen ermöglichen. Vom Patienten abgeleitete komplexe In-vitro-Modelle spiegeln die einzigartige genetische Ausstattung wider. Darüber hinaus sind Omics- und Drug-Screening-Analysen im Vergleich zu Tierversuchen deutlich einfacher1. In diesem Zusammenhang werden komplexe In-vitro-Modelle wie Sphäroide, Organoide oder Tumoroide (gemeinsam als Mikrogewebe bezeichnet) in großem Umfang für die Modellierung von Krankheiten, die präklinische Arzneimittelentwicklung und das Tissue Engineering eingesetzt2. Mikrogewebe unterstützen somit die Umsetzung der personalisierten Medizin3. Komplexe 3D-Zellmodelle4 wurden in erster Linie zur Aufklärung zellbiologischer Aspekte5 verwendet, gefolgt von der Entwicklung von Werkzeugen und standardisierten Methoden für Produktion, Sortierung, Platzierung, Reifung und Analyse. Daher bleibt die Hochdurchsatzanalyse und Qualitätskontrolle komplexer zellulärer Systeme eine ständige Herausforderung. Die Histologie ist die Goldstandardmethode für die Analyse der Mikroanatomie von Geweben. Daher ist die histologische Analyse von 3D-Zellmodellen eine logische Konsequenz. In Kombination mit der Immunhistochemie liefert es Informationen über die Morphologie und Zusammensetzung des Gewebes durch die Visualisierung spezifischer Proteine oder Antigene. Die Mikrohistologie ist eine leistungsstarke Technik zur Qualitätskontrolle in allen Verfahrensschritten der Entwicklung der Mikrogewebetechnologie mit einem zunehmenden Bedarf an Endpunktanalysen (Abb. 1).

Mikrogewebe-Verarbeitungskette zeigt den zunehmenden Bedarf an Mikrohistologie. Zusätzlich zur Endpunktanalyse und durch den Zugang zur Mikroanatomie und Biologie von Mikrogeweben hilft die Mikrohistologie dabei, die Auswirkungen von Verarbeitungsschritten auf die Proben zu bestimmen (z. B. Stress oder Schäden, die sich auf die Morphologie und biologische Funktionen auswirken, wenn sie kombiniert werden). mit Immunhistochemie). Damit ist es die Methode der Wahl zur Qualitätskontrolle bei der Implementierung neuer Methoden, die den gesamten Mikrogewebe-Prozessablauf von der Produktion bis zur Gewebemodellentwicklung abdeckt. Erstellt mit BioRender.com.

Aktuelle histologische Verfahren sind jedoch nicht für den Umgang mit Mikrogewebe geeignet, da diese kleiner als Biopsieproben und nahezu transparent sind. Darüber hinaus können technische Handhabungsprobleme auch zu einer langsamen und umständlichen Verarbeitung führen, was zu Ergebnissen mit begrenzter Ausbeute führt, die durch Automatisierung nicht reproduziert werden können6.

Zunächst erfordert die histologische Verarbeitung, dass Mikrogewebe in ein Hydrogel, z. B. Agarose, eingebettet werden, um ihre Manipulation für die anschließende Einbettung in Paraffin zu erleichtern7,8. Bei der zufälligen Einbettung sind Dutzende Mikrogewebereplikate erforderlich, um sicherzustellen, dass genügend geeignetes Material für eine relevante histologische Analyse verfügbar ist. Diese Anzahl an Replikaten scheint unnötig groß zu sein, und ein Großteil des Materials könnte verschwendet werden, wenn man bedenkt, dass es effizienter sein könnte, weniger Probenabschnitte zu analysieren, insbesondere da die genaue Ausrichtung von 5–10 Mikrogeweben in derselben Fokusebene ausreichend sein könnte Informationen für eine fundierte Analyse. Es besteht die Möglichkeit, mehrere Proben effizienter in einer Ebene auszurichten, z. B. durch Zentrifugation von Mikrogeweben in 0,5 % Agarose in einem Kryoröhrchen, worauf in einer aktuellen Studie9 hingewiesen wurde. Der in dieser Studie verwendete Pooling-Ansatz bleibt jedoch kostspielig und verschwendet immer noch wertvolles biologisches Material.

Alternativ ist die manuelle Übertragung und Positionierung von Mikrogeweben zu zeitaufwändig und führt zu Engpässen bei der Automatisierung. Stattdessen basiert eine elegante Alternative zur manuellen und zufälligen Agarose-Einbettung auf der parallelisierten Hydrogel-Einbettung mithilfe von Gewebe-Mikroarrays (TMA)7,8. TMA eignet sich gut zur Positionierung von Proben in 2D-Anordnungen und ermöglicht die Implementierung von Standardformatmethoden, die in der Zellkultur verwendet werden, z. B. Multiwellplatten. Mit TMA kann auch die Rückverfolgbarkeit jeder Versuchsbedingung gewährleistet und anschließend auf 3D-Zellmodelle10,11 und auf die Histologie von Kleinorganismusmodellen wie Zebrafischlarven12 angewendet werden. Aufgrund der zufälligen vertikalen Positionierung der Proben innerhalb eines erhaltenen Gelblocks ist es jedoch unwahrscheinlich, dass sich alle Mikrogewebe im selben Abschnitt befinden. Obwohl sich die Anzahl der Mikrogewebe pro Versuchsbedingung im Vergleich zum Pooling verringert, erfordert die TMA immer noch die Verarbeitung vieler Schnitte (z. B. Färbung und Bildgebung), um alle relevanten Daten über die Proben zu erhalten, was zu hohen Materialkosten und einer langen Bearbeitungszeit führt -Ergebnisse.

Mehrere andere Studien haben unterschiedliche Ansätze untersucht mit dem Ziel, eine hohe Parallelisierung der Einbettung von Mikrogewebe für histologische Zwecke (bestehend aus Schneiden, Färben und Bildgeben) zu erreichen. Eine Methode bestand darin, bis zu 96 Sphäroide parallel zu untersuchen und dabei einen Agaroseblock zu verwenden, der mit einer Reihe manuell gefüllter zylindrischer Vertiefungen ausgestattet war, um die Auswirkungen einer Fehlausrichtung innerhalb der Schnittebene zu analysieren8. Eine andere Studie nutzte die Zentrifugation durch einen Trichterverteiler, um Mikrogewebe in einen Agaroseblock mit einer Reihe zylindrischer Vertiefungen zu laden13. Dennoch war zur Vorbereitung der Übertragung eine manuelle Manipulation der Platte erforderlich. Andere Veröffentlichungen14,15,16 haben die Bildung und Kultivierung der 3D-Zellmodelle und deren Einbettung in dasselbe Gerät vorgeschlagen. Solche Laborgeräte sind jedoch sehr spezifisch und mit bestehenden Standardplattformen für die Mikrogewebeproduktion nicht kompatibel. Nach Kenntnis dieser Autoren wurde die Koplanarität der Proben innerhalb des Gelblocks nicht untersucht. Darüber hinaus kann die histologische Verarbeitung die Geometrie des Agaroseblocks und die relative Position der eingebetteten Proben beeinflussen.

In diesem Artikel wird eine kostengünstige und effiziente Methode für die histologische Hochdurchsatzverarbeitung von Mikrogeweben vorgeschlagen. Es wird eine benutzerfreundliche und robuste Methode für die Vorbereitung mehrerer Proben in einem Standard-Array-Format unter Verwendung eines Agarose-basierten Substrats beschrieben: HistoBrick (Abb. 2). HistoBrick wurde entwickelt, um die Probenpositionierung, Geleinbettung, Dehydrierung, Paraffineinbettung, Schnitte und optische Bildgebung zu erleichtern und gleichzeitig die Anzahl der erforderlichen Schnitte zu reduzieren, die einer Analyse bedürfen, indem die Proben auf einer einzigen Ebene ausgerichtet werden. Die relative Ausrichtung der Proben innerhalb von HistoBrick und die Positionierung des Blocks auf einem Mikrotom können beurteilt werden. Darüber hinaus ist der Ansatz von HistoBrick mit dem Standardformat für Automatisierungsprozesse kompatibel und ebnet den Weg für die Standardisierung und Hochdurchsatzautomatisierung der Mikrohistologie.

Schematische Darstellung der Pipeline der histologischen Analyse von Mikrogeweben. HistoBrick bietet die koplanare Ausrichtung und Array-Anordnung, die erforderlich ist, um die Produktion von 3D-Zellmodellen und die histologische Verarbeitung mit der Hochdurchsatzanalyse von formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Schnitten zu verbinden. Erstellt mit BioRender.com.

Zwei Silikonformen mit 96 vertikalen Säulen wurden mit SolidWorks (Dassault Systèmes) entworfen, basierend auf der Konfiguration des Array-Abstands kommerzieller 1536-Well-Platten. Die Säulen haben einen Durchmesser von 1,5 mm und eine Höhe von 15 mm. Wie in Abb. 3 dargestellt, wurden die Säulen bewusst in der Mitte der Form positioniert, wobei auf beiden Seiten zwei offene Räume frei blieben, die nach dem Füllen dazu beitragen, die Handhabung des Hydrogels beim Formen und Entformen zu erleichtern. Der Abstand zwischen den Säulen und dem Boden der Form beträgt in der Höhe 2 mm und bietet so ausreichend Platz zum Einspritzen des für die Herstellung eines HistoBricks benötigten Hydrogels. Die Formdesigns wurden bei Spectroplast AG, Schweiz, mit Silikon A 50 3D-gedruckt.

Histobrick-Design und Hydrogelblock. (a) CAD der Form für die Herstellung eines 96-Well-HistoBricks, (b) durch 3D-Druck hergestellte Silikonform, (c) Hydrogel-basierter HistoBrick mit 96 Wells.

Die Hauptschritte bei der Herstellung von HistoBrick sind in Abb. 4a–d dargestellt. Agarose (Sigma-Aldrich, A7174) wurde zu vorgewärmtem HistoGel (Epredia, HG-4000-012) in einem Verhältnis von 1,5–2 % (Gew./Vol.) zugegeben und die Lösung in einem 80 °C warmen Wasserbad gerührt, bis sich die Agarose gebildet hatte völlig aufgelöst. Die Silikonform wurde mit den Säulen nach unten auf eine Petrischale gelegt; Die Baugruppe wurde in einem Ofen bei 80 °C vorgewärmt. Dann wurden 10 ml der Agarose-HistoGel-Mischung vorsichtig in die erhitzte Silikonform gegossen. Anschließend ließ man diese Elemente 10 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen. Anschließend wurde der Block 2 Stunden lang bei 4 °C gelieren gelassen, um eine ausreichende mechanische Stabilität für das Entformen zu erreichen. Der erstarrte HistoBrick wurde über einer Petrischale aus der Form gelöst, indem im mittleren Bereich sanfter manueller Druck ausgeübt und gleichzeitig beide Seiten festgehalten wurden. Der erhaltene HistoBrick wurde bei 4 °C in entionisiertem Wasser gelagert und innerhalb von 14 Tagen verwendet. Um eine bessere Visualisierung der Vertiefungen vor und nach der histologischen Verarbeitung zu ermöglichen, wurden zusätzliche HistoBrick-Proben durch Zugabe von blauem Farbstoff (Davidson Tissue Dye) zur Agarose-HistoGel-Mischung vorbereitet.

Vorbereitung und Verwendung von HistoBrick. (a) Legen Sie die Silikonform mit den Säulen nach unten in eine Petrischale aus Glas und füllen Sie die Form durch die seitlichen Öffnungen mit der Agarose-HistoGel-Mischung. (b) Die gefüllte Form sollte dann 2 Tage lang auf 4–5 °C abgekühlt werden h, (c) Entformen Sie den HistoBrick, indem Sie auf die Seiten drücken, (d) Entformen Sie den HistoBrick, (e) Laden Sie fixierte Mikrogewebe, (f) Geben Sie HistoGel in die Vertiefungen und kühlen Sie es auf 4–5 °C ab, (g) Schneiden Sie das Blockieren mit dem Schneidwerkzeug, (h) Nach dem Teilen des HistoBrick in drei Segmente können die beiden Seitensegmente verworfen werden und das mittlere Segment mit den Vertiefungen sollte für die histologische Bearbeitung reserviert werden, (i) Platzieren Sie das mittlere Segment des HistoBrick in einer Histologie Kassette.

In dieser Arbeit wurden Untersuchungen mit Proben von Sphäroiden des menschlichen hepatozellulären Karzinoms (HepG2) (HB-8065, ATCC) (durchschnittlicher Durchmesser 150–200 µm) durchgeführt, die mit Sphericalplate 5D (SP5D, Kugelmeiers Ltd.) erzeugt wurden. Ein detailliertes Protokoll für ihre Vorbereitung finden Sie in den ergänzenden Methoden S1. Die fixierten HepG2-Mikrogewebe wurden manuell aus einem Eppendorf-Röhrchen in den HistoBrick übertragen, indem mit einer Ein- oder Mehrkanalpipette ein Mikrogewebe in jede Vertiefung pipettiert wurde (Abb. 4e). Pipettenspitzen (20 µl) wurden mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) (A3059, Sigma-Aldrich) vorbeschichtet, um ein Anhaften der Mikrogewebe zu verhindern. Jedes Mikrogewebe wurde zusammen mit etwa 5 µl seines wässrigen Puffers abgesaugt. Die geladene Spitze wurde nahe am Boden der HistoBrick-Vertiefung platziert, ohne das Gel zu berühren, und die Probe wurde langsam abgegeben, um das Einschließen von Luftblasen zu verhindern. Man ließ die Mikrogewebe 5 Minuten lang in der Vertiefung absetzen und sedimentieren. Nach der Übertragung der Mikrogewebe wurde die Form etwa 1 Stunde lang belassen, um das zusätzliche wässrige Medium zu absorbieren. Mit einer neuen Spitze wurden 10–20 µl auf 80 °C vorgewärmtes HistoGel in jede Vertiefung gegeben (Abb. 4f). Abschließend ließ man den HistoBrick eine Stunde lang bei 4 °C abkühlen, damit der Gelierungsprozess stattfinden konnte. Anschließend wurde es bei 4 °C in entionisiertem Wasser gelagert und innerhalb von 3 Tagen verbraucht.

Es wurden mehrere Methoden entwickelt und getestet, um den Transfer von HepG2-Mikrogeweben von einer ersten Wellplatte auf einen HistoBrick zu untersuchen, wobei ein Microlab STAR Liquid Handling System (Hamilton) mit acht Pipettierköpfen und Venus Software Version 2.1 verwendet wurde. Fixierte HepG2-Mikrogewebe wurden (eines pro Vertiefung) in eine Corning Costar Ultra-Low Attachment (ULA)-Mehrfachvertiefungsplatte mit 96 Vertiefungen (CLS7007, Merck) mit 1 Mikrogewebe in 200 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS Gibco 2062235) gegeben ) in jedem Brunnen. Zur Unterstützung des HistoBrick wurden digitale Zwillings-Laborgeräte entwickelt, die mithilfe eines speziellen Halters auf dem Deck positioniert wurden. Zu den Übertragungsmethoden gehörte die Vorbeschichtung der Spitzen mit BSA.

HistoBricks, die wie zuvor beschrieben mit fixierten HepG2-Mikrogeweben beladen waren, wurden so zugeschnitten, dass sie in eine Histologiekassette passen (Abb. 4g – i). Zu diesem Zweck wurde ein maßgeschneidertes Schneidewerkzeug entwickelt, wie in den ergänzenden Methoden S2 beschrieben. Der histologische Prozess umfasste einen Dehydrierungsschritt, gefolgt von einer Reinigung und Paraffineinbettung, die nach Standardlaborverfahren durchgeführt wurden. Der in Paraffin eingebettete Block wurde zum Schneiden auf ein Leica RM2265-Mikrotom gelegt. Insgesamt wurden 75 Schnitte von einem HistoBrick erhalten. Die Dicke jeder Scheibe betrug 4 µm. Jede der drei Scheiben wurde nach der Montage auf einem Glasobjektträger nach Standardprotokollen mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt.

Bilder der gefärbten Abschnitte wurden mit einem Olympus VS120-Ganzdiascanner aufgenommen. Zunächst wurde ein Übersichtsbild des gesamten Objektträgers mit 4-facher Vergrößerung aufgenommen, um die Bereiche mit Mikrogewebe zu identifizieren. Anschließend wurden mehrere über die gesamte Probenscheibe verteilte Mikrogewebe ausgewählt und fokussiert, um die korrekte Neigung des Objektträgers während des Scanvorgangs zu unterstützen. Schließlich wurde durch Scannen ein Bild des gesamten Abschnitts mit höherer Vergrößerung (10-fach oder 20-fach) aufgenommen.

Zur besseren Visualisierung wurden blau gefärbte HistoBrick-Proben vorbereitet und ihre Vertiefungen mit ungefärbtem HistoGel gefüllt, um ihren Durchmesser in verschiedenen Stadien zu beurteilen (insbesondere auf dem frisch zubereiteten HistoBrick und auf Objektträgern, die nach der histologischen Verarbeitung erhalten wurden). Anschließend wurde mit einem Umkehrmikroskop (Carl Zeiss Microscopy GmbH) ein Hellfeldbild der Proben aufgenommen und die Durchmesser der Vertiefungen anhand einer manuellen kreisförmigen Anpassung mithilfe der Open-Source-Plattform FIJI gemessen17.

Die Bilder wurden in der FIJI-Plattform17 verarbeitet und das TrackEM-Modul18 wurde verwendet, um die Bohrlochanordnungen der verschiedenen Abschnitte auszurichten. Die Bilder wurden zwei Prozessen unterzogen: Zunächst wurden auf jedem Bild manuell Orientierungspunkte ausgewählt, um die Zuverlässigkeit der Ausrichtungsleistung zu gewährleisten. Zweitens wurde eine automatisierte starre Transformation der Bilder auf den gesamten Stapel angewendet, um die Ausrichtung zu verbessern. Anschließend wurde die Lage der Äquatorebene jedes Mikrogewebes visuell als die Ebene identifiziert, die den größten Abschnitt des entsprechenden Mikrogewebes über den gesamten Bildstapel enthielt. Wenn zwei aufeinanderfolgende Abschnitte eines Mikrogewebes als bemerkenswert ähnlich identifiziert wurden, wurde als Äquatorebene die Ebene gewählt, die zwischen den beiden Abschnitten zentriert war. Wenn mehrere Mikrogewebe in die gleiche Vertiefung eingebettet waren, wurden sie gemittelt, da ihre Äquatorebenen sehr nahe beieinander lagen (Unterschied < 15 µm). Durch dieses Verfahren wurde der Beitrag jedes Bohrlochs bei der Anpassung an die räumlichen 3D-Positionen ausgeglichen und sichergestellt, dass die am besten geeignete Ebene nicht durch die Bohrlöcher beeinflusst wurde, die zusätzliches Mikrogewebe enthielten. Die 3D-Standorte wurden dann in MATLAB (2012, MathWorks) verarbeitet, um die am besten passende Ebene durch Minimierung des mittleren quadratischen Fehlers für jede der verarbeiteten HistoBrick-Proben zu identifizieren.

Mit der speziellen Silikonform lassen sich HistoBrick-Blöcke aus Agarose einfach herstellen. Die 96 Vertiefungen im HistoBrick haben nach der Stabilisierung in entionisiertem Wasser einen Durchmesser von 1,7 ± 0,1 mm, was zu einer Abweichung von 6 % vom Durchmesser der Formsäule führt. Der Pitch eines Standard-1.536-Arrays bleibt jedoch erhalten, was das Laden der Probe mit einem automatisierten Liquid-Handler erleichtern würde.

HistoBrick eignet sich für histologische Verarbeitungsschritte wie Dehydrierung, Paraffineinbettung, Schnitte mit einem Mikrotom und Färbung. Der Vergleich von Abb. 5c und d zeigt, wie wichtig es ist, blauen Farbstoff zu verwenden, um die Visualisierung der Vertiefungen zu erleichtern. Um die Auswirkung der Verarbeitung auf den zusammengesetzten Hydrogelblock zu bestimmen, wurden die Well-Durchmesser (D) und der Array-Abstand in zwei Achsen (P1 und P2) an den Scheiben von zwei blau gefärbten HistoBrick-Proben mit eingebetteten HepG2-Mikrogeweben gemessen (Abb. 5c–f). Die Ergebnisse zeigen eine Schrumpfung des Bohrlochdurchmessers um 34 %. Der gemessene Abstand nach histologischer Bearbeitung betrug 1,7 mm, was einer Reduzierung um 28 % entspricht. Nach der Geleinbettung oder in den histologischen Schnitten wurden keine Luftblasen beobachtet (Abb. 5a). Die HepG2-Mikrogewebe blieben nach der H&E-Färbung intakt (Abb. 5b).

Bilder von HepG2-Mikrogeweben in einem HistoBrick, die verschiedene Verarbeitungsschritte durchlaufen. (a) Ein HepG2-Mikrogewebe (durch den Pfeil angezeigt), nachdem es in den HistoBrick eingebettet und mit HistoGel bedeckt wurde. Beachten Sie, dass in der Mikrovertiefung keine Luftblasen eingeschlossen sind, (b) H&E-Färbung eines Abschnitts eines einzelnen Mikrogewebes, (c) Mikroskopiebild einer Scheibe ohne Farbstoff. Die Brunnenkonturen sind schwer zu bestimmen. (d) Mikroskopisches Bild einer Scheibe unter Verwendung einer blauen Färbung. Beachten Sie, dass die Brunnenkonturen deutlich sichtbar sind. (e) Messen des Durchmessers und Abstands der Vertiefungen im HistoBrick vor dem Einbetten des Paraffins, (f) Messen des Durchmessers und Abstands der Vertiefungen im HistoBrick nach dem Schneiden. Der Parameter D ist der Durchmesser, während P1 und P2 zum Vergleich der Teilung auf den beiden Achsen des Mikrowell-Arrays verwendet werden.

Da der Durchsatz der histologischen Analyse stark davon abhängt, wie die Mikrogewebe während des Schnittverfahrens innerhalb des Blocks positioniert werden, haben die Autoren dieser Arbeit die Ausrichtung der HepG2-Mikrogewebe mithilfe des speziellen HistoBrick-Ansatzes charakterisiert. Bei diesem Ansatz setzen sich die Mikrogewebeproben ab und sedimentieren am Boden der Vertiefungen, was zu einer Ausrichtung auf einer horizontalen Ebene führt. Abbildung 6a zeigt drei Beispiele von Hellfeldbildern der Schnitte, die für eine 96-Well-HistoBrick-Probe nach H&E-Färbung erhalten wurden. Die HepG2-Mikrogewebe sind leicht als dunkle Flecken innerhalb der Vertiefungen zu erkennen. Aufgrund der ungenauen manuellen Beladung von HistoBrick aus einer Probensuspension sind die Vertiefungen manchmal leer oder enthalten bis zu drei Mikrogewebe. Abbildung 6b zeigt die Positionierung der Mikrogewebe innerhalb eines HistoBrick entlang der Z-Achse, relativ zum ersten Histologieabschnitt und der am besten passenden Ebene. Abbildung 6c zeigt die Position mehrerer Mikrogewebe aus dem ersten Histologieschnitt in fünf HistoBrick-Blöcken (in Blau) und zwei weiteren Blöcken, die mit dem Positionierungswerkzeug vorbereitet wurden (in Grün). Unter der Annahme, dass der histologische Prozess zu parallelen Oberflächen des Paraffins und der ursprünglichen HistoBrick-Probe führte, bildet die Ausrichtungsebene einen Winkel von 0,22 ± 0,06° mit der Schnittebene. Dieser Winkel könnte erhebliche Auswirkungen auf die Analyse haben, da er eine relative Fehlausrichtung von etwa 70 µm zwischen zwei Mikrogeweben im ersten und zwölften Bohrloch entlang einer Linie des HistoBrick-Arrays darstellt. Da der Neigungswinkel für jede HistoBrick-Probe unterschiedlich ist, wurde die am besten passende Ebene eingeführt, um einen direkten Vergleich der Mikrogewebe in den sieben Proben zu ermöglichen (Abb. 6d). Bei allen HistoBrick-Proben liegt das Zentrum von 75 % der Mikrogewebe unabhängig von der Verwendung des Ausrichtungswerkzeugs im Durchschnitt ± 40 µm von der am besten passenden Ebene entfernt. Mit anderen Worten: 75 % der Mikrogewebe haben ihre Zentren in einem 80 µm dicken Band im Block.

Koplanarität eingebetteter HepG2-Mikrogewebe. (a) Hellfeldbilder von drei H&E-gefärbten Objektträgern aus demselben verarbeiteten Block. Helle Scheiben entsprechen Vertiefungen und dunkle Punkte entsprechen Mikrogeweben, wie im Beispiel mit gestrichelter Linie dargestellt, (b) Schematische Darstellung der Position der Sphäroide im HistoBrick. Die am besten passende Ebene (gelbe Linie) ist eine imaginäre Ebene zum Ausgleich des Kippwinkels (in Rot der Winkel, der von der am besten passenden Ebene mit der Ebene der Mikrotomklinge gebildet wird), der das Ergebnis der manuellen Positionierung des Blocks auf dem Mikrotom ist. (c) Abstand des Zentrums des Mikrogewebes vom ersten histologischen Abschnitt für sieben verschiedene HistoBrick-Proben [5 HistoBricks wurden ohne Ausrichtungswerkzeug geschnitten (blaue Kästchen) und zwei HistoBricks wurden mit Ausrichtungswerkzeug geschnitten (grüne Kästchen)]. (d) Absoluter Abstand des Zentrums des Mikrogewebes von der am besten passenden Ebene für dieselben sieben HistoBrick-Proben.

Um die Integration von HistoBrick in einen automatisierten Arbeitsablauf zu bewerten, wurden verschiedene Methoden unter Verwendung eines automatisierten Liquid Handlers und einer 96-Well-ULA-Platte getestet. Jede Vertiefung enthielt ein HepG2-Mikrogewebe mit 200 µl PBS. Jede Vertiefung auf dem HistoBrick ermöglicht theoretisch die Sammlung von 2–10 µl Volumen. Der entwickelte Ansatz bestand aus drei Hauptschritten, wie in Abb. 7 dargestellt. Erstens war die Entnahme eines HepG2-Mikrogewebes von der ULA-Platte nur dann erfolgreich, wenn das Wellvolumen (200 µl) mit 300 µl-Kohlenstoffspitzen vollständig abgesaugt wurde angewandt. Bei keiner getesteten Teilvolumenaspiration konnten die Mikrogewebe nicht erfolgreich erfasst werden. Zweitens wurde eine Pause eingeführt, damit sich das Mikrogewebe am unteren Ende der Spitze absetzen konnte. Abschließend wurde die Dosierung in zwei Phasen untersucht. In der ersten Testphase wurde der Inhalt der Spitze vollständig in eine Standard-96-Well-Platte dispensiert. Mit diesem Ansatz konnten 87,5 % der HepG2-Sphäroide erfolgreich aufgenommen, übertragen und abgegeben werden. Diese Leistung hing von der Beschichtung der Dosierspitze (mit BSA), der Sphäroidgröße und der Haftung des Mikrogewebes am Boden der Platte ab. In der zweiten Testphase wurde die Teilvolumenabgabe getestet, um den Volumenbereich einer HistoBrick-Vertiefung (2–10 µl) zu erreichen. Allerdings konnte eine Teilstrahlabgabe der Mikrogewebe innerhalb eines Volumens von weniger als 20 µl aus den aufgenommenen 200 µl nicht auf reproduzierbare Weise erreicht werden. Die technischen Einschränkungen der Hardware sowie die komplexe Methodenoptimierung schienen limitierende Faktoren zu sein, und ein automatisierter Eins-zu-Eins-Transfer von 150–200 µm großen HepG2-Mikrogeweben war mit dieser Roboterplattform nicht möglich.

Methodenentwicklung für den Transfer von 150–200 µm großen HepG2-Mikrogeweben mithilfe eines automatisierten Labor-Liquid-Handlers. Erstellt mit BioRender.com.

Die Anwendung von 3D-Zellmodellen in den Bereichen Forschung und personalisierte Medizin nimmt sukzessive zu, da sie detaillierte Untersuchungen von Krankheitsmechanismen, In-vitro-Therapieansätzen und Therapieplanung ermöglichen. Die Verwendung von vom Patienten stammenden Zellen ist ein großer Vorteil, die Zellquelle ist jedoch begrenzt. Dabei muss mikrogewebebasierte Forschung über die gesamte Verarbeitungskette hinweg verlässlich sein. Dies umfasst unter anderem die Produktion, Reifung, Prüfung und Endpunktanalyse von Mikrogewebe. In diesem Zusammenhang besteht Bedarf an einer Standardisierung (die häufig eine Automatisierung erfordert) der Analysemethoden, die die Entwicklung und Validierung experimenteller Prozesse unterstützen.

Ziel dieser Arbeit war es, die histologische Analyse von Mikrogeweben durch die Implementierung eines TMA-Ansatzes mit Schwerpunkt auf Kosteneffizienz, Rückverfolgbarkeit und Einhaltung von Hochdurchsatz-Laborverfahren zu erleichtern. Frühere Studien haben den Vorteil der Verwendung eines TMA-Ansatzes gezeigt, diese Überprüfungen wurden jedoch an größeren Proben (im Bereich von 500 µm Durchmesser) durchgeführt7,8,10,11. Der in diesem Artikel vorgestellte neuartige Ansatz, HistoBrick, verwendet nicht nur kleine HepG2-Mikrogewebe (150–200 µm Durchmesser), er ermöglicht auch die präzise Ausrichtung der Proben und ist mit unterschiedlicher Standardhardware kompatibel.

HistoBrick würde die Hochdurchsatz-Mikrohistologie durch die Implementierung benutzerfreundlicher Hydrogel-Laborgeräte für die koplanare Einbettung von 3D-Zellmodellen erleichtern, deren Design mit Automatisierungsstandards kompatibel gemacht wurde. Mit HistoBrick gesammelte Daten zeigen, dass es möglich ist, histologische Ergebnisse für bis zu 96 Proben mit einer kleineren Auswahl von 13 Schnitten durchzuführen und zu sammeln. Die entworfene Silikonform erleichtert die Replikation der mesoskaligen Vertiefungen in das Agarose-basierte Hydrogel, was zu einem Gerät mit mehreren Vertiefungen führt, das vor dem Laden der Probe mindestens 14 Tage lang unter feuchten Bedingungen gelagert werden kann. Die Flexibilität der Form und ihr Design mit den zwei Öffnungen auf beiden Seiten der Anordnung ermöglichen eine ausreichende Biegung beim Entformen und helfen, Gelbruch zu verhindern. Darüber hinaus basiert die Methode von HistoBrick ausschließlich auf dem passiven Absetzen und Sedimentieren der Proben, wenn sie in die Vertiefungen geladen werden, und es sind keine zusätzlichen Handhabungsschritte nach dem Transfer des Mikrogewebes erforderlich. Hinsichtlich der Leistung zeigt HistoBrick eine zufriedenstellende Kompatibilität mit dem gesamten histologischen Prozess. Obwohl die Abmessungen der Wells, Arrays und Proben durch die Dehydrierungs- und Paraffin-Einbettungsverfahren beeinflusst werden, ist es möglich, die Proben eindeutig zu verfolgen, da ihre 2D-Anordnung erhalten bleibt. Darüber hinaus werden sie nach der histologischen Bearbeitung auf einer Ebene mit einer Genauigkeit von ~ 80 µm ausgerichtet. Dies ist besonders relevant, da die Ergebnisse mit kleinen HepG2-Mikrogeweben (150–200 µm Durchmesser) erzielt wurden, sodass die erhaltene Ausrichtungsgenauigkeit nahe an der Streuung der Probengröße liegt. Die neuesten standardisierten Mikrogewebe-Produktionsplattformen gewährleisten eine einheitliche Größe innerhalb eines Arrays19,20,21. Da die Ausrichtungsmethode auf Sedimentation basiert, geht HistoBrick insbesondere auf die analytischen Anforderungen solcher Plattformen ein.

Eine frühere Studie hat gezeigt, wie wichtig die Positionierung von Agaroseblöcken auf einem Mikrotom für die Beurteilung der Ausrichtungsleistung ist8. In dieser Studie wurde ein TMA auf Agarosebasis zusammen mit Agarose in Kontakt mit einer Histologiekassette gebracht, um das Schneiden des Gelblocks zu unterstützen, während sich die Mikrogewebeproben oben auf den der Klinge zugewandten Säulen befanden. Die HistoBrick-Blöcke wurden zunächst entwässert und ohne jegliche Unterstützung in Paraffin eingebettet, und die erhaltene Probenausrichtungsebene bildete mit der Mikrotomklinge nur einen Winkel von 0,2°–0,3°. Für einen ergänzenden Paraffin-Einbettungsschritt wurde ein maßgeschneidertes Werkzeug entwickelt, um die Ausrichtung des Blocks mit der Klinge zu erleichtern, was in Zukunft für weniger erfahrene Benutzer der Technologie nützlich sein würde. Es wurde jedoch beschlossen, die Wirksamkeit des Tools in diesem Fall nicht zu untersuchen, da die Ausrichtung von einem hochqualifizierten Benutzer für diese Arbeit hervorragend arrangiert wurde. Da die Ausrichtung des Blocks mit der Klinge stark vom Bediener abhängt, wurde die Entwicklung eines Spezialwerkzeugs zur Standardisierung dieses Prozesses dennoch als wichtiger Schritt in der Entwicklung von HistoBrick angesehen, damit es in Zukunft problemlos eingesetzt werden kann.

Die Wells von HistoBrick wurden als 96-Well-Array auf einem 1536-Raster konzipiert, um den Automatisierungsstandards für Liquid-Handling-Plattformen zu entsprechen. Wenn das Format und die Positionierung von HistoBrick auf dem Decklayout erfolgreich waren, traten Einschränkungen beim automatisierten Eins-zu-eins-Mikrogewebetransferverfahren auf. Im Idealfall wäre jedes Mikrogewebe aus der 96-Well-Platte mit 2–10 µl PBS aufgenommen und direkt auf HistoBrick übertragen und dann mit HistoGel eingebettet worden. Die erfolgreiche Entnahme einzelner Mikrogewebe aus einer ULA-Platte mit rundem Boden war jedoch nur mit der Aspiration des gesamten 200-µl-Volumens möglich, da die Mikrogewebe zufällig in der Vertiefung angeordnet waren. Nachdem die Sedimentation der Probe in der Spitze aktiviert wurde, konnte eine teilweise Abgabe von 2–10 µl in die HistoBrick-Vertiefung nicht erreicht werden. Die in dieser Arbeit getesteten Bedingungen zielten darauf ab, den Eins-zu-Eins-Transfer mithilfe einer Standard-Liquid-Handling-Plattform zu testen, wobei in einzelnen Wells isolierte Mikrogewebe als Input dienten. Diese Ausgangsbedingungen wurden geschickt als Schulfall betrachtet, da groß angelegte standardisierte Mikrogewebe-Produktionsplattformen entweder auf einem Pool von Mikrogeweben in einem größeren Volumen (< 1 ml) oder isolierten Mikrogeweben in kleinen Volumina (< 100) basieren µl)22. Während Prozesse wie das Pipettieren von Reagenzien und der Medienaustausch zu den Standardvorgängen von Laborautomatisierungssystemen gehören, bleibt die Übertragung von 3D-Zellmodellen eine Herausforderung. Dies ist vor allem auf die präzise Positionierung der Pipettenspitze über dem 3D-Zellmodell beim Ansaugen zurückzuführen, die eine optische Rückmeldung erfordert. Ohne sie ist eine erfolgreiche Aufnahme des Mikrogewebes nur mit einem größeren Flüssigkeitsvolumen möglich. Dann ist die erforderliche Teildosierung kleiner Flüssigkeitsmengen (< 20 µl) mit klassischen Geräten schwierig bis unmöglich. Während der Biodruck von 3D-Zellmodellen ein aufstrebendes Gebiet23 ist und Pick-and-Place-Vorgänge für größere Konstrukte demonstriert wurden24, gibt es kaum Erkenntnisse zu Pick-and-Place-Vorgängen für die eindeutige Übertragung von 3D-Zellmodellen von einem Ort zum anderen.

In dieser Studie bietet HistoBrick eine benutzerfreundliche, kostengünstige und robuste Methode zur Einbettung von Proben mit der koplanaren Ausrichtung von bis zu 96 Mikrogeweben. Die Technologie gewährleistet eine starke Reduzierung der Anzahl der bei der histologischen Bearbeitung verlorenen Proben und spart so wertvolles biologisches Material. Der HistoBrick-Ansatz ermöglicht eine standardisierte Probenanalyse mittels Mikrohistologie. Die effiziente Nutzung patienteneigener Zellen ist der Schlüssel zur Förderung der weit verbreiteten Implementierung von 3D-Zellmodellen in der Forschung und stratifizierten Medizin. Der vollständige Einsatz der Methode hängt nun von der Entwicklung von Liquid-Handling-Plattformen ab, die den effizienten Transfer mehrerer 3D-Zellmodelle von einem Laborgerät zum anderen ermöglichen.

Alle in diesem Manuskript beschriebenen Daten und alle Einzelheiten der beschriebenen Methoden werden auf Anfrage beim jeweiligen Autor leicht zugänglich gemacht.

Kim, J., Koo, B.-K. & Knoblich, JA Menschliche Organoide: Modellsysteme für die Humanbiologie und Medizin. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 21, 571–584 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Schneeberger, K. et al. Konvergierende Biofabrikations- und Organoidtechnologien: die nächste Grenze im Leber- und Darmgewebe-Engineering? Biofabrikation 9, 013001 (2017).

Artikel ADS Google Scholar

Driehuis, E., Kretzschmar, K. & Clevers, H. Etablierung patienteneigener Krebsorganoide für Anwendungen im Arzneimittelscreening. Nat. Protokoll. 15, 3380–3409 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Lancaster, MA & Knoblich, JA Organogenese in einer Schale: Modellierung von Entwicklung und Krankheit mithilfe von Organoid-Technologien. Wissenschaft 345, 1247125 (2014).

Artikel Google Scholar

Bock, C. et al. Der organoide Zellatlas. Nat. Biotechnologie. 39, 13–17 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Olsen, TR et al. Verarbeitung zellulärer Sphäroide zur histologischen Untersuchung. J. Histotechnol. 37, 138–142 (2014).

Artikel Google Scholar

Yan, P., Seelentag, W., Bachmann, A. & Bosman, FT Eine Agarosematrix erleichtert das Schneiden von Gewebe-Microarray-Blöcken. J. Histochem. Zytochem. 55, 21–24 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, JH & Beachley, V. Microarray-Einbettung/Schnittierung für die parallele Analyse von 3D-Zellsphäroiden. Wissenschaft. Rep. 9, 16287 (2019).

Artikel ADS Google Scholar

Zhang, S.-W. et al. Eine effiziente und benutzerfreundliche Methode zur zytohistologischen Analyse von Organoiden. J. Tissue Eng. Regen. Med. 15, 1012–1022 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Decembrini, S., Hoehnel, S., Brandenberg, N., Arsenijevic, Y. & Lutolf, MP Milliwell-Arrays auf Hydrogelbasis für standardisierte und skalierbare retinale Organoidkulturen. Wissenschaft. Rep. 10, 10275 (2020).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Kabadi, PK et al. In die Tiefe: Techniken zur dreidimensionalen Mikrogewebevisualisierung in vitro. Biotechniques 59, 279–286 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Sabaliauskas, NA et al. Hochdurchsatz-Zebrafischhistologie. Methoden 39, 246–254 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Weisler, W., Miller, S., Jernigan, S., Buckner, G. & Bryant, M. Design und Test eines zentrifugalen Fluidgeräts zur Besiedlung von Mikroarrays aus sphäroiden Krebszellkulturen. J. Biol. Ing. 14, 7 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Thomsen, AR et al. Ein tiefes konisches Agarose-Mikrowell-Array für die adhäsionsunabhängige dreidimensionale Zellkultur und dynamische Volumenmessung. Labor. Chip 18, 179–189 (2017).

Artikel Google Scholar

Simeone, K. et al. Paraffin-Einbettungslithographie und mikrodissezierte Gewebe-Mikroarrays: Werkzeuge für die biologische und pharmakologische Analyse von soliden Ex-vivo-Tumoren. Labor. Chip 19, 693–705 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Kuriu, S., Kadonosono, T., Kizaka-Kondoh, S. & Ishida, T. Schneiden von Sphäroiden in Mikrofluidikgeräten für die morphologische und immunhistochemische Analyse. Mikromaschinen 11, 480 (2020).

Artikel Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidschi: Eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder. Nat. Methoden 9, 676–682 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Cardona, A. et al. TrakEM2-Software zur Rekonstruktion neuronaler Schaltkreise. PLoS ONE 7, e38011 (2012).

Artikel ADS MathSciNet CAS Google Scholar

Wassmer, C.-H. et al. Entwicklung primärer Pankreas-Inselzellsphäroide für die dreidimensionale Kultur oder Transplantation: Eine methodische Vergleichsstudie. Zelltransplantation. 29, 0963689720937292 (2020).

Artikel Google Scholar

Brandenberg, N. et al. Automatisierte Organoidkultur mit hohem Durchsatz durch Stammzellaggregation in Mikrokavitätsarrays. Nat. Biomed. Ing. 4, 863–874 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Wardwell-Swanson, J. et al. Ein Framework zur Optimierung der High-Content-Bildgebung von 3D-Modellen für die Arzneimittelforschung. SLAS Discov. Adv. Wissenschaft. Arzneimittelentdeckung. 25, 709–722 (2020).

Artikel Google Scholar

Velasco, V., Shariati, SA & Esfandyarpour, R. Mikrotechnologiebasierte Methoden für Organoidmodelle. Mikrosystem. Nanoeng. 6, 76 (2020).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Jakab, K. et al. Tissue Engineering durch Selbstorganisation und Bioprinting lebender Zellen. Biofabrikation 2, 022001 (2010).

Artikel ADS Google Scholar

Blakely, AM, Manning, KL, Tripathi, A. & Morgan, JR Bio-Pick, Place und Perfuse: Ein neues Instrument für die dreidimensionale Gewebezüchtung. Gewebe-Ing. Teil C Methoden 21, 737–746 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

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Die Autoren danken Jessica Sordet-Dessimoz und ihrem Team an der Histology Core Facility der EPFL für die Verarbeitung von Proben für die Histologie. Diese Forschung wurde von der Schweizerischen Agentur für Innovation im Rahmen des Innosuisse-Projekts 39848.1 IP-LS unterstützt.

CSEM SA, Jaquet-Droz 1, 2002, Neuchâtel, Schweiz

Sarah Heub, Fatemeh Navaee, Daniel Migliozzi, Diane Ledroit, Stéphanie Boder-Pasche, Jonas Goldowsky, Emilie Vuille-Dit-Bille, Vincent Revol und Gilles Weder

School of Life Sciences, Fachhochschule Nordwestschweiz, 4132, Muttenz, Schweiz

Joëlle Hofer, Carine Gaiser & Laura Suter-Dick

Schweizerisches Zentrum für Angewandte Humantoxikologie (SCAHT), 4001, Basel, Schweiz

Laura Suter-Dick

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SH hatte die Idee zu HistoBrick. DM hat die Form entworfen. FN hat die Schneid- und Ausrichtungswerkzeuge entwickelt. DM und FN führten die Hydrogel-Gel- und Methodenoptimierungsexperimente durch. FN produzierte die HepG2-Mikrogewebe und führte die Ausrichtungsexperimente durch. JH und CG haben HistoBrick getestet und zur Optimierung des Protokolls beigetragen. DM entwickelte die Bildverarbeitungsmethode und EV-D.-B. führte die statistische Analyse der Mikrogewebepositionierung durch. DL und JG untersuchten die automatisierten Übertragungsmethoden. SH koordinierte die Erstellung des Manuskripts. CG, LS-D., VR, SB-P. und GW werteten die Daten aus und überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Sarah Heub.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Heub, S., Navaee, F., Migliozzi, D. et al. Koplanare Einbettung mehrerer 3D-Zellmodelle in Hydrogel für die Hochdurchsatz-Mikrohistologie. Sci Rep 12, 9991 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13987-4

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Eingegangen: 12. Januar 2022

Angenommen: 31. Mai 2022

Veröffentlicht: 15. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13987-4

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