Das Leben ohne Etiketten unter optischen Mikroskopen betrachten

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 559 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Heutige optische Mikroskope haben die Grenzen von Geschwindigkeit, Qualität und beobachtbarem Raum in biologischen Proben erweitert und unsere heutige Sicht auf das Leben revolutioniert. Darüber hinaus hat die spezifische Kennzeichnung von Proben für die Bildgebung Einblicke in die Funktionsweise des Lebens gegeben. Dadurch konnte die markierungsbasierte Mikroskopie Einzug halten und in die Mainstream-Life-Science-Forschung integriert werden. Der Einsatz der markierungsfreien Mikroskopie war jedoch größtenteils begrenzt, was dazu führte, dass Tests auf Bioanwendung, nicht aber auf Biointegration durchgeführt wurden. Um die Biointegration zu ermöglichen, müssen solche Mikroskope auf ihre Aktualität hin untersucht werden, um biologische Fragen eindeutig zu beantworten und eine langfristige Wachstumsperspektive zu schaffen. Der Artikel stellt wichtige markierungsfreie optische Mikroskope vor und diskutiert deren integratives Potenzial in der Life-Science-Forschung für die ungestörte Analyse biologischer Proben.

Historisch gesehen hat sich die optische Mikroskopie parallel zu den Biowissenschaften weiterentwickelt. Heutzutage ist jede Standardeinrichtung für biologische Forschung mit einem Mikroskop ausgestattet, um Morphologien im Hellfeldmodus und molekulare Verteilungen im Epifluoreszenzmodus abzubilden und markierte Strukturen von Interesse zu beobachten. Dieser Aufbau ist für Biologen ideal, da die meisten Studien mit einem solchen System durchgeführt werden können oder für die Unterbringung in einem solchen System konzipiert sind. Der Bedarf an molekularer Quantifizierung und präzisem optischen Schneiden machte die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie zu einem Favoriten unter Biologen. Das wachsende Interesse an der schnellen und Live-Bildgebung dicker Proben in 3D hat als rechtzeitiges Feedback für die Entwicklung von Bildgebungswerkzeugen wie Multiphotonen-1,2,3,4,5,6 und Lichtblattmikroskopen7,8,9 gedient. Die Notwendigkeit, zelluläre dynamische Veränderungen zu beobachten, förderte fluoreszenzbasierte Methoden wie den Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)10, 11, die Fluoreszenzlebensdauer-Bildmikroskopie (FLIM)12,13 und die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung (FRAP)14,15. Die Bedeutung der Beobachtung winziger Details motivierte zu hochauflösenden Methoden wie der strukturierten Beleuchtung (SIM)16,17, der stimulierten Emissionsdepletion (STED)18,19 und der Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie (SMLM)20,21,22. Unterstützende Systeme wie schnellere Kameras, adaptive Automatisierung mit hohem Durchsatz und innovative Farbstoffe haben die Bioanwendungen erheblich erweitert. Dennoch gibt es eine Lücke, bei der markierungsbasierte Methoden begrenzt sind, nämlich bei der chemisch ungestörten Auswertung biologischer Proben, ohne dass Markierungen und zugehörige Chemikalien eingreifen.

Viele bekannte markierungsfreie Bildgebungsmethoden sind trotz ihrer Vorteile begrenzt, wenn das Ziel mechanistische Studien oder die Entdeckung neuer Erkenntnisse sind. Beispielsweise sind Hellfeld-, Phasenkontrast- und Differential-Interferenzkontrast-Mikroskopie (DIC) die gängige Wahl von Biologen. Die Hellfeldmikroskopie eignet sich am besten, wenn die Proben mit einem Farbstoff angefärbt werden, der den Kontrast verleiht. Für Live-Studien ist es jedoch eine Herausforderung, kontrastreiche Bilder von nahezu transparenten lebenden Zellen zu erhalten. Phasenkontrast und DIC-Bildgebung verstärken optisch den Unterschied zwischen der Probe und dem Hintergrund, um ein kontrastreiches Bild zu erzeugen und werden routinemäßig in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Sowohl Phasenkontrast- als auch DIC-Bildgebung sind sehr nützliche Werkzeuge für einen Biologen. Sie können Phasenänderungen jedoch nicht quantifizieren, da die Intensitätswerte nichtlinear mit der Phaseninformation zusammenhängen und daher nicht auf die tatsächlichen Änderungen in der Probe zurückgeführt werden können.

Fortschritte in der markierungsfreien Bildgebung ermöglichen heute eine hochauflösende und schnelle Bildgebung von Morphologie, Dynamik, Funktionalität, Materialaustausch, Pathogeninteraktion, Biochemie und Biomechanik (Abb. 1). In diesem Artikel werden die große Auswahl verschiedener markierungsfreier optischer Mikroskope, ihre biologischen Anwendungen und ihr Potenzial erörtert, sich zu einem leistungsstarken Werkzeug der biomedizinischen Mainstream-Forschung zu entwickeln. Ziel dieses Artikels ist es daher, Grundlagen für die Auswahl geeigneter Werkzeuge für die markierungsfreie optische Mikroskopie zu schaffen, um etablierte Methoden zu ergänzen und schließlich eine integrativere Rolle bei der Wissensgewinnung zu spielen.

Die Abbildung veranschaulicht die Anwendbarkeit verfügbarer markierungsfreier optischer Mikroskope zur Bewertung struktureller, biomechanischer und biochemischer Eigenschaften von Zellen und Geweben als Maß für ihre Funktionen. QPM quantitative Phasenbildgebung, AF-Autofluoreszenzmikroskopie, SHG-Mikroskopie der zweiten Harmonischen, FTIR-FTIR-Mikrospektroskopie, Raman-Raman-Mikrospektroskopie, BM-Brillouin-Mikroskopie, optische Kohärenz-Elastographie OCE, optische Kohärenztomographie OCT, D-OCT-Doppler-OCT, photoakustische PAM-Mikroskopie.

Die Notwendigkeit, markierungsfreie Phasenbilder zu quantifizieren, motivierte quantitative Phasenbildgebungsmethoden, die in der biowissenschaftlichen Forschung weitgehend unerschlossen geblieben sind. Mit der quantitativen Phasenmikroskopie (QPM) sollen durch die Probe verursachte optische Pfadverzögerungen (oder Phasenänderungen) gemessen werden. QPM ist markierungsfrei und ermöglicht Live-Bildgebung ohne chemische Toxizität oder Signalverlust aufgrund externer Faktoren wie Photobleichung in der Fluoreszenzmikroskopie. Heutzutage basieren mehrere QPM-Methoden auf der ursprünglichen Theorie der Bilderzeugung von Ernst Abbe aus dem Jahr 187323, die ein Bild als kompliziertes Interferogramm etablierte, das durch Überlagerung von durch die Probe einfallenden Lichtwellen entsteht.

QPM muss hinsichtlich der Informationstreue und des biologischen Wissenswerts bewertet werden, um den Test der Zeit zu bestehen. Der wichtigste Aspekt eines QPM ist der Umgang mit Rauschen, um dessen Quantifizierbarkeit festzustellen. Dies wird durch die räumliche und zeitliche Phasenempfindlichkeit des Systems bestimmt. Die Rauschminderung wird auf viele Arten erreicht, einschließlich der Verwendung von Diffusoren, Weißlichtbeleuchtung und Lichtquellen mit geringer zeitlicher Kohärenz, wodurch die Bildqualität verbessert wird. Um das durch Scanvorgänge verursachte Rauschen zu reduzieren, wurden Vollfeld-QPMs entwickelt, bei denen es sich um nicht scannende Techniken handelt. Vollfeld-QPMs nutzen die Interferenz des Lichts aus den beiden Ebenen (Probe und Referenz), um Informationen über die durch die Probe verursachten optischen Pfadverzögerungen bereitzustellen. Die interferometrischen Geometrien bestimmen, ob das System eine hohe räumliche Auflösung wie beim phasenverschiebenden QPM oder eine hohe zeitliche Auflösung wie bei einem außeraxialen QPM24 aufweist. Darüber hinaus erhalten nicht-interferometrische QPMs wie die Intensitätstransportmethode Phaseninformationen ohne spezielle interferometrische Geometrie, sondern nur zwei Intensitätsbilder, eines im Fokus und eines leicht außerhalb des Fokus25. Obwohl die Methode einfach zu implementieren ist, ohne dass sehr spezielle Systeme erforderlich sind, ist sie für die Bildgebung mit niedriger Auflösung gedacht. Technologien wie Fourier-Phasenmikroskopie (FPM)26, digitale holographische Mikroskopie (DHM)27, Beugungsphasenmikroskopie (DPM)28, optische Beugungstomographie (ODT)29, räumliche Lichtinterferenzmikroskopie (SLIM)30, digitale Weitfeldinterferometrie ( WFDI)31 sind einige der herausragenden QPM-Technologien, die im Laufe der Jahre entstanden sind. Der Schwerpunkt von QPM verlagert sich heute von der Technologieentwicklung hin zu praktischen Anwendungen. Heute haben QPM-Technologien ihre Anwendung in der Entwicklungsbiologie32, den Neurowissenschaften33,34,35, der Mikrobiologie36, der Pathologie37, Krebs38, genetischen Erkrankungen31, Immunologie39, Pharmakologie39, Wundheilung36 und Stoffwechselstörungen40 gezeigt. Allerdings muss die Anwendbarkeit einer Methode auf jedes biologische Gebiet parametrisiert werden, um die universelle Attraktivität der Methode sicherzustellen.

Im Großen und Ganzen misst QPM Morphologie, Dynamik und Volumeninformationen in Zellen. Morphologische Merkmale können gemessen werden, um Wachstum, Lebensfähigkeit, Reaktion auf äußere Reize oder Pathologie mithilfe von Phasenverschiebungswerten zu bestimmen. Der quantifizierte Phasenwert wird jedoch mit Höhe und Brechungsindex kombiniert. Wenn es also entscheidend ist, eines der beiden zu bestimmen, müssen sie korrekt entkoppelt werden. Die Entkopplung ist in der Tat relevant, da sie die Messung zusätzlicher Parameter wie Volumen und Zellmasse ermöglichen kann. Eine Entkopplungsmethode umfasst die sequentielle Verwendung von zwei Medien mit unterschiedlichem Brechungsindex und die Messung von Phasenverzögerungen41. Andere Möglichkeiten umfassen die Verwendung mehrerer Beleuchtungswinkel, was zu einer tomografischen Bildgebung führt, und die Verwendung zweier Wellenlängen in hochdispersiven Medien. Durch die Kombination von QPM mit einem kanalisierten Chip (Milli-/Mikrofluidikkanäle) können intrazelluläre Osmolarität, Zellvolumenänderungen, makromolekulare Konzentration, Reaktion auf Schockreize und der zeitliche Fluss des molekularen Transports in Zellen gemessen werden41. Darüber hinaus wurden zeitaufgelöste QPM-Daten verwendet, um die Partikeldiffusion mittels Dispersionsphasenspektroskopie (DPS) zu messen42. Die Technik beruht auf Intensitätsschwankungen aufgrund von Streusignalen der Probe in einem festen Winkel, um die Partikelflussrate zu bestimmen und Transporteigenschaften (aktiv/passiv) vorherzusagen.

Phase wird auch auf innovative Weise zur Abbildung der Zelladhäsion auf Glasoberflächen verwendet und dient als markierungsfreies Analogon zur Totalreflexionsmikroskopie (TIRF) durch eine Methode namens Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM)43, 44. Die Methode erzeugt einen Bildkontrast basierend auf der Phasendifferenz zwischen dem vom Glas reflektierten Licht und dem Zellbereich sehr nahe am Glas. Daher erscheint die dem Glas am nächsten liegende Zelloberfläche aufgrund der destruktiven Interferenz zwischen der Probenoberfläche und dem vom Glas reflektierten Licht am dunkelsten. Obwohl die Methode für die Bildgebung von Zelloberflächen und Mikrotubuli mit hohem Kontrast45 verwendet wird, ist sie weitgehend auf einen sehr dünnen Bereich beschränkt. Auch die Kombination von IRM mit Fluoreszenzmikroskopie hat sich in dynamischen Studien mit Immunzellen als funktionell relevant erwiesen46. Dies wird durch die Verfolgung von Kontaktpunkten von T-Zellen auf immunologisch aktivem Deckglas erreicht, was zur Visualisierung zellulärer Kontaktpunkte in Korrelation mit fluoreszierend sichtbaren Kalziumspiegeln führt.

Phasenmessungen mit den bisher besprochenen bildgebenden Verfahren sind für dünne Proben oder Bereiche in der Nähe von Deckglas gedacht. Dies liegt entweder daran, dass sie nur über eine begrenzte Reichweite des Abbildungsfelds verfügen oder dass sie von starken Streusignalen überwältigt werden, die von den unscharfen Stellen der Probe ausgehen.

Die Abbildung tiefer in Gewebe, Organe und Tiere ist eine allgemeine Herausforderung der optischen Mikroskopie. Da die 3D-Umgebung für biologische Funktionen von entscheidender Bedeutung ist, ist es wichtig, das Leben in 3D abzubilden. Frühe Embryonalstadien und kleine Tiere wie C. elegans, Drosophila und Zebrafischlarven sind mittlerweile gut für die Mikroskopie geeignet, da sie optisch nicht zu dicht sind. Der aufkommende Bedarf, menschliche oder Säugetierprozesse auf kleineren Längenskalen abzubilden, führte zu einem massiven Interesse an 3D-Kulturen, Sphäroiden, künstlichen Geweben und Organoiden, die verfügbare optische Methoden leicht in Frage stellen können. Wenn die Auflösung beeinträchtigt werden kann, können tiefere Bereiche der Probe durch die Verwendung längerer Lichtwellenlängen erreicht werden. Eine auf Interferometrie basierende tomografische Technik, die QPMs vorangeht, ist die optische Kohärenztomographie (OCT), die eine räumliche Auflösung von 5–15 μm für Bilder bis zu Tiefen von 3–5 mm aufweist. Dies hat zur klinischen Integration47 von OCT in die Augenheilkunde, Dermatologie, Krebsforschung, Zahnmedizin, Gastroenterologie und Kardiologie beigetragen. Modifikationen der OCT wie polarisationsempfindliches OCT48, OCT-Angiographie49, Doppler-OCT50 und OCT-Elastographie51 haben eine funktionelle Bildgebung der extrazellulären Matrix, des Blutflusses und der Gewebesteifheit ermöglicht. Allerdings weist die OCT wie andere markierungsfreie Methoden Rauschen und Artefakte auf. Durch die Verwendung stabilisierender optischer Komponenten zum Herausfiltern stark gestreuten Lichts und einer schnelleren Bildgebung mit der Fourier-Domäne wurde die Empfindlichkeit des OCT erhöht. Allerdings wird die Quantifizierung insbesondere tiefer Geweberegionen durch die Lichtschwächung beeinträchtigt. Um dieses Problem zu lösen, sind Schwächungskorrekturmethoden von entscheidender Bedeutung, um die Quantifizierbarkeit von OCT-Bildern bei der Bestimmung des Krebsfortschritts52 und der Wundheilung53 zu erhöhen. Obwohl die OCT tief in die Proben vordringt, kann sie keine Submikron-Maßstäbe realisieren, in denen eine Schatzkammer biologischer Fragen lauert.

Das Ausbalancieren von Tiefe und Auflösung ist ein Schlüsselaspekt jeder beschriftungsfreien 3D-Bildgebung dicker Proben. Lange Zeit konnte sich QPM bei der Abbildung dicker Proben nicht durchsetzen, da mehrfaches Streulicht schlecht verarbeitet wurde, wodurch Details ausgewaschen wurden und die Bildqualität schlechter wurde. Mit der Gradientenlichtinterferenzmikroskopie (GLIM)32,54 ist jedoch eine Phasenquantifizierung über mehrere Hundert Mikrometer in die Probe hinein möglich, mit der Möglichkeit, Tomogramme zu erstellen, die eine Querschnittsvisualisierung ermöglichen. GLIM übertrifft alle seine Vorgänger bei der Messung der Lebensfähigkeit von Embryonen, physiologischen Studien von 3D-Kulturen, manipulierten Geweben, Organoiden und lebenden Organismen (wie C. elegans und Zebrafisch). GLIM ist das markierungsfreie Analogon der konfokalen Mikroskopie im Hinblick auf seine Fähigkeit, die Probe durch Unterdrückung der außerhalb des Fokus gestreuten Signale optisch zu schneiden. Somit ist die GLIM-Auflösung nur durch die optische Beugungsgrenze begrenzt.

Biologische Proben können nicht nur die Lichtphase, sondern auch die Polarisation verändern. Daher hat sich die Polarisationslichtmikroskopie (PLM) als gute Ergänzung zur Phasenmikroskopie herausgestellt. PLM wird verwendet, um optisch anisotrope Strukturen wie faserige Proteine ​​wie Kollagen55, Aktin56, Mikrotubuli57 und mitotische Spindeln58 abzubilden, die ansonsten in der Phasenmikroskopie nur schwer klar zu erkennen sind. PLM funktioniert mit Licht, das vor und nach der biologischen Probe zwei Polarisationsfilter passiert. Idealerweise kann das Licht des ersten Filters den zweiten nicht passieren. Die Anisotropie in der Probe richtet das Licht jedoch so aus, dass etwas Licht durch den zweiten Filter gelangen kann, wodurch diese in der Probe vorhandenen anisotropen Strukturen sichtbar gemacht werden können. Darüber hinaus motivierte die Notwendigkeit der Quantifizierung die Entstehung von quantitativem PLM (qPLM) zur Messung von Merkmalen wie Verzögerung und Orientierung59,60. Die Komplementarität der Phasen- und Polarisationsmikroskopie zur Messung von Dichte und Verzögerung führte zur Kombination der beiden markierungsfreien Methoden61,62,63. Eine Hochdurchsatzvariante der kombinatorischen Bildgebung von Phase und Polarisation wird durch die Integration rechnerischer Lernmethoden zur Entwicklung einer quantitativen markierungsfreien Bildgebung mit Phase und Polarisation (QLIPP)64 erreicht.

Die quantitative Phasenbildgebung auf zellulärer bis subzellulärer Ebene erfordert eine höhere Auflösung, als die Beugungsgrenze zulässt. Dies kann durch innovatives Extrahieren von Informationen über das komplexe Streufeld erreicht werden, das feinere Details der abzubildenden Struktur vor der Rekonstruktion einschließt. Eine Methode besteht darin, die Beleuchtung oder die Probe relativ zur anderen zu drehen und im Wesentlichen mehrere Perspektiven der Probe zu erfassen. Die mehreren 2D-Bilder werden dann mithilfe von Algorithmen rekonstruiert, um ein 3D-Tomogramm zu erhalten. Dies verbessert die laterale Auflösung des QPM um den Faktor zwei oder mehr34,65. 2π-DHM – eine spezielle Methode, die auf DHM basiert – nutzt 360°-Beleuchtungen, einen 405 nm blauen Laser-UV und zwei Ölobjektive mit hoher numerischer Apertur (NA), um das Ziel zu erreichen34. Das Sammelobjektiv erfasst Licht, das in verschiedenen Winkeln von 0 bis 360° durch die Proben dringt, und erfasst mehr Winkelperspektiven, was zu einem Bild mit einer räumlichen Auflösung von bis zu 70 nm führt.

Eine weitere kontrastreiche, markierungsfreie, superauflösende Bildgebungsmethode ist das rotierende kohärente Streumikroskop (ROCS)66. ROCS kann kleine (150 nm) und schnelle Strukturen wie Zellpodien, Biofilamente und virusähnliche Nanopartikel abbilden. Ein schnell rotierender blauer Laser erzeugt eine 360°-Beleuchtung der Probe. Das Streulicht wird innerhalb weniger Millisekunden erfasst, was zu einer schnellen Erfassung führt. Die Fähigkeit, 100-nm-Partikel schnell und markierungsfrei abzubilden, hat ein Verständnis dynamischer viraler Interaktionen mit lebenden Zellen ermöglicht.

In der Mikroskopie ist neben einer hohen räumlichen Auflösung auch die gleichzeitige schnelle Bildgebung bei bestimmten biologischen Studien von entscheidender Bedeutung. Die Erfassung der Interaktion zwischen lebendem Virus und Wirt, die eine räumliche Auflösung in Nanometern und eine zeitliche Auflösung in Mikrosekunden erfordert, ist daher eine gute Lösung. Dies wird durch markierungsfreie Methoden wie die kohärente Hellfeldmikroskopie (COBRI)67 und die interferometrische Streumikroskopie (iSCAT)68,69,70 erreicht. COBRI ist eine Modifikation des Standard-Hellfeldmikroskops unter Verwendung einer räumlich und zeitlich kohärenten Laserlichtbeleuchtung. Dies entspricht einer räumlichen Auflösung von wenigen Nanometern und einer zeitlichen Auflösung von 10 μs. iSCAT hingegen nutzt das von Nanopartikeln wie Viren gestreute Licht mit erhöhter Empfindlichkeit mittels Interferometrie70. Während die Fluoreszenzausbeute durch das Fluorophormolekül und die Photobleichung begrenzt wird, kann in der markierungsfreien Domäne die Photonenausbeute durch Lichtstreuung einfach durch Erhöhen des einfallenden Lichts erhöht werden (da ein fester Prozentsatz des einfallenden Lichts gestreut wird). Bei einer höheren Leistung wird weniger Zeit benötigt, um die gleichen Informationen zu sammeln, was eine schnelle Bildgebung ermöglicht. Allerdings führt eine einfache Erhöhung der Photonenintensität neben der Phototoxizität zu einer erheblichen Hintergrundstreuung, wodurch der Zweck der ultraempfindlichen Detektion zunichte gemacht wird. Hier kommt die Erkennung interferometrischer Streuung ins Spiel. Bei iSCAT wird sowohl das Streulicht der Nanopartikel als auch das reflektierte Licht der Glas-Wasser-Grenzfläche nach enger Fokussierung durch ein Objektiv mit hoher NA gesammelt. Die Methode ist ideal für kleinere Partikel (<50 nm), da der Unterschied zwischen gestreutem und reflektiertem Licht deutlich groß ist, um den erforderlichen Kontrast zu erzeugen. Zusätzlich zu diesen Methoden werden heute zunehmend alternative markierungsfreie Methoden zur Virenverfolgung eingesetzt70,71.

Während die Phasenmikroskopie darauf beruht, dass einfallendes Licht durch die Probe verändert wird, sind biologische Materialien voller Moleküle, die von optischen Sensoren erfasst werden können. Die photoakustische Mikroskopie (PAM) erkennt beispielsweise Pigmente wie Hämoglobin. PAM regt das Ziel mit Laserimpulsen an und die daraus resultierende thermische Ausdehnung der Pigmente sendet mechanische Wellen aus, die vom Ultraschalldetektor erfasst werden. Die Ultraschallerkennung ermöglicht es PAM, Bilder bis zu einer Tiefe von 1–3 mm zu erstellen. Die laterale Auflösung wird dadurch bestimmt, wie gut das Licht auf die Probe fokussiert wird, und klassifiziert PAM in optisch aufgelöste (Auflösung 0,2–1 μm bis 1 mm) oder akustisch aufgelöste (Auflösung 2–15 μm bis 2–3 mm) Variationen. Die laterale Auflösung von PAM wurde dank innovativer Superauflösungsmethoden auf 90 nm erhöht72,73. PAM wird bei der Untersuchung der Blutmikrogefäße mit klinischen Anwendungen bei der Wundbeurteilung74,75, der Bildung neuer Blutgefäße76, diabetischen Fußgeschwüren77 und der Angiogenese78 eingesetzt.

Neben Chromophoren sind in unserem Körper auch autofluoreszierende Moleküle vorhanden. Autofluoreszenz ist bei der Bildgebung oft ein Ärgernis, da sie die fluoreszierend markierten Moleküle stört. Autofluoreszenz wird jedoch verwendet, um wichtige pathophysiologische Prozesse wie den epithelial-mesenchymalen Übergang79 und die Krebsstammerkrankung80 aufzuklären. In der zellulären Autofluoreszenzbildgebung spiegeln Stoffwechselmoleküle wie NADH und FADH die zelluläre Energiebesteuerung wider und variieren wahrscheinlich in Proliferation, Wachstum und Differenzierung. Andererseits enthält die extrazelluläre Matrix (ECM) in Geweben Kollagen und Elastin, die auf die mechanische Integrität des Gewebes hinweisen und bei Umbau, Fibrose und Krebs beeinträchtigt werden. Darüber hinaus kann Autofluoreszenz auch für die hochauflösende Mikroskopie genutzt werden, um Nanostrukturen sichtbar zu machen, um Chromatinzustände in Zellen81 und den histopathologischen Nachweis in Krebsgeweben82 abzubilden. Der Nachteil der molekularen Spezifität hat sie auf Zwecke der Krankheitsklassifizierung beschränkt. Strategien einschließlich der Verwendung strenger Anregungs- und Emissionsfilter, zusätzlicher Tests, struktureller Benchmarks und Probenwissen können einbezogen werden, um den Nutzen, die Genauigkeit und die Quantifizierbarkeit der Methode zu ermöglichen.

ECM-Fibrillen wie Kollagen und Elastin sind autofluoreszierend, aber dicht und schwer zu validieren. Second Harmonic Generation Imaging (SHG) ist eine weitere markierungsfreie Methode, die Fibrillenstrukturen in biologischen Proben erkennt und die ECM-Autofluoreszenz ergänzen kann. Neben der ECM kann SHG intrazellulär Actomyosinkomplexe und Mikrotubuli abbilden. Daher ist es für die Bewertung des Krankheitspotenzials von Wert83. SHG ist ein Beispiel für die Verwendung von Lichtmodulation, um spezifische Nano-/Mikrostrukturinformationen in der Probe hervorzuheben, wie z. B. die Fibrillenform. Der Hauptvorteil von SHG ist die Nutzung der Lichtpolarisation anstelle der Absorption und damit die Reduzierung von Phototoxizität und Photobleichung. Da es außerdem Licht im nahen Infrarotbereich verwendet, können damit dickere Proben bis zu Hunderten von Mikrometern abgebildet werden. Darüber hinaus ist die SHG-Bildgebung spezifisch für fibrilläre Strukturen und bietet eine hohe strukturelle Empfindlichkeit. Aufgrund der strukturellen Sensitivität und Spezifität ist SHG auf verschiedene klinische Anwendungen übertragbar, etwa bei Bindegewebserkrankungen, Fibrose, Herz- und Muskel-Skelett-Erkrankungen sowie Krebs83,84,85. Darüber hinaus wurde bei SHG mit mehreren hochauflösenden Methoden eine mindestens zweifache Verbesserung erzielt5,86,87 was eine präzise Quantifizierung der Fibrillendichte und Strukturbeschreibungen ermöglicht. Aus technischer Sicht hat die Zwei-Photonen-Mikroskopie viele der jüngsten Entwicklungen in der Autofluoreszenz3,88,89,90 und der SHG-Bildgebung83,84,85,86,91,92,93,94 unter Verwendung nichtlinearer Mikroskopie vorangetrieben.

Die Erkennung funktioneller Veränderungen ist für das Verständnis biologischer Mechanismen von entscheidender Bedeutung. Biochemische Assays, molekulare Blots und spektroskopische Methoden sind somit Werkzeuge zur globalen Funktionscharakterisierung in der Probe. Angesichts der großen räumlichen Heterogenität in den biologischen Proben werden entscheidende Entwicklungen häufig gemittelt, was das Verständnis eines fehlenden Teils biologischer Pfade erschwert. Daher hat die Notwendigkeit einer funktionellen Abbildung des Probenfelds chemische Färbemethoden vorangetrieben, und anschließende mikroskopische Auswertungen haben Biologen und Pathologen sehr geholfen95,96,97. Obwohl diese Methoden bei der Inszenierung funktioneller Zustände wie Tod, Schädigung, Organisation oder Vermehrung Verwendung finden, sind sie aufgrund der Subjektivität des Färbeverfahrens oft schwer zu quantifizieren. Darüber hinaus sind die Details auf die räumliche Auflösung des optischen Mikroskops beschränkt, sodass Veränderungen erkannt werden können, die sich bereits manifestiert haben oder sich in einem relativ fortgeschrittenen Stadium des Fortschreitens befinden. Einige Fluoreszenzmarkierungen können durch bedingungsgebundene Fluoreszenzaktivierung auch chemische Informationen liefern98,99, sind jedoch nur auf einige wenige biologische Funktionen beschränkt.

Um den frühen Ausbruch von Krankheiten zu verstehen, müssen frühe chemische Funktionsgruppenveränderungen (Längenskalen von 100–200 pm) identifiziert werden, die weit über die Möglichkeiten herkömmlicher optischer Mikroskope einschließlich Superauflösung hinausgehen (Abb. 2). Fortschritte bei optischen Spektroskopiemethoden wie der Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)100 und der Raman-Spektroskopie101 füllen diese Lücke, indem sie Informationen über Änderungen in chemischen Bindungen und funktionellen Gruppen liefern. Ein typisches Spektrum enthält mehrere Peaks, die jeweils einer bestimmten chemischen Spezies entsprechen. Höhe, Breite und Lage/Verschiebungen liefern wichtige Informationen über die Konzentration, Diversität und Bindungslängen/Bindungsenergien der chemischen Spezies. Der begrenzende Faktor der spektralen Auflösung wird auch mit spektralen Entfaltungsalgorithmen behandelt, die breite Peaks wie Amidbanden auflösen, um Unterpeaks von Proteinsekundärstrukturen aufzudecken102. Auf diese Weise sind Spektroskopiemethoden eine perfekte Ergänzung zur Bildgebung und können zusammen nützlich sein, um die Geheimnisse des Lebens in Gesundheit und Krankheit zu verstehen102. Ein weiterer limitierender Faktor ist die Identifizierung räumlich passender chemischer Informationen in der heterogenen Probe. Dieser Bedarf wurde größtenteils durch spektralmikroskopische oder mikrospektroskopische Versionen von FTIR103 und Raman104,105,106 gedeckt. Die Methoden der Mikrospektroskopie nutzen das gleiche Prinzip wie ihre Gegenstücke zur Spektroskopie, verfügen jedoch zusätzlich über die Fähigkeit einer Objektivlinse, die Probe räumlich abzutasten. Somit haben wir einen Bildstapel mit einem Bild für jede Wellenlänge im gesamten Spektralbereich des Bildgebungssystems. Die Mikrospektroskopie unterliegt ebenso wie das Spektroskopie-Gegenstück den gleichen Einschränkungen wie die Spektroskopie-Äquivalente, z. B. Rauschmanagement, die Notwendigkeit von Basislinienanpassungen, die Abschwächung der Autofluoreszenz (für Raman) und Störsignale, die vom Substrat- oder Wassergehalt herrühren. Dennoch lassen sich mit einem verbesserten Lärmmanagement und einer erhöhten spektralen und räumlichen Auflösung detailliertere biochemische Informationen extrahieren.

Optische Mikroskopie und Spektroskopie erfassen unterschiedliche Organisationsebenen und ergänzen sich daher zur Visualisierung verschiedener Entwicklungs- und Krankheitsphasen. Die optische Mikroskopie kann selbst mit der Superauflösung nicht über 1 nm hinausgehen. Die Mikrospektroskopie erfasst chemische Veränderungen, die auf Ebenen funktioneller Gruppen mit räumlicher Verteilung auftreten. Da jedoch Tausende von chemischen Veränderungen auftreten, ist es schwierig, Spektroskopie allein zu verwenden, insbesondere zu Beginn, bis sie mit manifesten strukturellen Veränderungen im Mikrometer- bis Nanomaßstab korreliert wird. Dies kann helfen, den frühen Krankheitsausbruch zu charakterisieren und die Grundlage verschiedener physiologischer und pathologischer Ereignisse zu verstehen.

Mikroskopie und Mikrospektroskopie können sinnvoll zusammen eingesetzt werden, um sehr frühe Veränderungen in biologischen Systemen vorherzusagen (Abb. 2). Lange Zeit war die Auflösung der Mikrospektroskopie mit modernen Mikroskopen nicht zu erreichen. Dies liegt daran, dass erstere immer noch spektrale Informationen aus einem Bereich sammelte, der sich über mehrere Pixel erstreckte. Dies hat sich im Laufe der Jahre geändert, als die Nanoskopie sowohl auf die FTIR107,108,109 als auch auf die Raman110,111,112,113 Mikrospektroskopie übertragen wurde und eine hochauflösende spektrale und räumliche Auflösung für den Punkt-zu-Punkt-Vergleich mit anderen hochauflösenden Bildgebungsverfahren ermöglichte. Darüber hinaus hat die Entwicklung der Hochgeschwindigkeits-Spektralbildgebung114 und des Einfangens einzelner Moleküle115, 116 zu einer verbesserten Präzision bei der Lebendzell- und In-vivo-Bildgebung geführt117.

Die nichtlineare optische Bildgebung durch Zwei-Photonen-Mikroskope hat nicht nur die Autofluoreszenz- und SHG-Bildgebung, sondern auch spektrale Bildgebungsmethoden wie kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und stimulierte Raman-Streuungsmikroskopie (SRS) zur Abbildung von Proteinen, Lipidtröpfchen und Nukleinsäuren ermöglicht Säuren118,119. CARS und SRS sind beide nichtlineare optische Bildgebungssysteme und nutzen mehrere Anregungsstufen, um chemische Informationen aus einem für eine chemische Spezies spezifischen Spektralbereich zu sammeln. Die C-H-Streckregionen und Protein-Fingerprint-Regionen werden am häufigsten verwendet. Da diese Regionen spektral überfüllt sind, kommt es zur Überlappung mehrerer chemischer Spezies, wodurch die Identifizierung von Beiträgen einer bestimmten funktionellen Gruppe beeinträchtigt wird. In bestimmten Fällen kann jedoch die spektrale Entfaltung verwendet werden, um in vielen Fällen reine Informationen wiederherzustellen120,121.

Wie chemische Rezeptoren auf der Zelloberfläche gibt es auch Mechanorezeptoren, die biophysikalische Kräfte umsetzen können, um die Genexpression zu ermöglichen und biologische Funktionen zu modulieren. Mechanobiologie wurde in Stammzellen122, Tumorprogression123, neurodegenerativen Erkrankungen106, Entwicklungsbiologie124, regenerativer Biologie125, Zelladhäsion und Migration126 nachgewiesen. Viele biomechanische Studien an Zellen und Geweben werden heute indirekt durchgeführt, indem mechanosensitive Moleküle markiert und ihre Expression und Lokalisierung in der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden. Die direkte Abbildung der dynamischen mechanischen Veränderungen lebender Zellen und Gewebe ohne Markierung würde jedoch helfen, dynamische Veränderungen im Gesundheitszustand und im Krankheitsverlauf zu verstehen.

Die beiden beliebtesten mechanischen Bildgebungsmodalitäten sind die Rasterkraftmikroskopie (AFM) und die Ultraschallelastographie (USE). AFM ist für extrem kleine Skalen (1 nm – wenige Mikrometer) physikalischer Kräfte gedacht, die oberflächenmechanische Informationen liefern. VERWENDEN Sie Bilder im Organmaßstab mit Transkörperdurchdringung und sind daher für klinische Umgebungen geeignet. Es gibt jedoch eine Lücke in der Längenskala zwischen einigen Mikrometern und einigen Millimetern (Zellen und Gewebe), die ein enormes Potenzial für die biomechanische Erforschung birgt.

Das optische Analogon von USE ist die optische Kohärenzelastographie (OCE), eine funktionelle Weiterentwicklung der OCT. OCE nutzt eine externe Quelle der Gewebeverformung, die entweder kontaktbasiert oder kontaktlos sein kann, um Gewebeverschiebungen zu messen51,127. OCE kann die mechanische Steifigkeit in Tiefen von mehreren Millimetern in inhomogenen Proben bestimmen, was ideal für biologische Gewebe, 3D-In-vitro-Modelle und Kleintiermodelle ist. Die Einschränkung liegt jedoch immer noch in der Auflösung, die im Bereich von mehreren zehn Mikrometern liegt. Dies schränkt seine Anwendungen dort ein, wo zelluläre oder subzelluläre Auflösungen gerechtfertigt sind.

Die Brillouin-Mikroskopie ist eine markierungsfreie mechanische Bildgebung mit beugungsbegrenzter Auflösung, die auf den Prinzipien der Brillouin-Lichtstreuung128 zur Messung des Längsmoduls129 oder des Schermoduls130 basiert. Brillouin-Streuung ist ein inelastisches Streuereignis, das durch die Wechselwirkung von Photonen aus der Lichtquelle und Phononen (mechanischen Schwingungen) aus der Probe entsteht. Die Phononen interagieren mit dem einfallenden Licht, tauschen Energie aus und führen zu einer Population inelastisch gestreuten Lichts (Brillouin-Streuung). Diese Brillouin-Streuungen liefern somit ein Maß für die mechanischen Eigenschaften der Probe. Die Brillouin-Mikroskopie wird heute mit hoher Geschwindigkeit und geringer Phototoxizität auf Zellen und Gewebe angewendet129. In Zellen entstehen mechanische Veränderungen durch Modifikationen des Zytoskeletts, Verbindungen von Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Wechselwirkungen und den Fest-Flüssigkeits-Volumenanteil des Zytoplasmas und der Membranen. In der extrazellulären Matrix von Geweben sind die Anordnung, Vernetzung und Dichte der Proteine ​​für die mechanischen Eigenschaften verantwortlich. Die Brillouin-Mikroskopie wurde in mehreren biologischen Modellen und Krankheiten nachgewiesen. Es wurde in der Zellbiologie131, der Entwicklungsbiologie132, zur Abschätzung des Metastasierungspotenzials von Tumoren133, zur Plaqueablagerung bei der Alzheimer-Krankheit104 und zur ECM-Versteifung bei Arteriosklerose134 eingesetzt, um nur einige zu nennen. Eine Einschränkung bei der Verwendung der Brillouin-Mikroskopie zur Messung elastischer Eigenschaften ergibt sich aus der Notwendigkeit, Vorkenntnisse über die Dichte und den Brechungsindex des Gewebes zu haben. Darüber hinaus ist die Zuverlässigkeit der Methode bei heterogenen biologischen Proben, insbesondere in dynamischen Zuständen, nicht ganz eindeutig. Dies liegt an einer möglichen Diskrepanz zwischen den mechanischen Beziehungszeiten und der Zeit, in der die tatsächlichen biologischen Ereignisse stattfinden. Obwohl es Spielräume gibt, die zeitliche Auflösung des Mikroskops zu verbessern, ist es vorerst wichtig, die Einschränkungen zu berücksichtigen und Bildstrukturen zu berücksichtigen, die im Geschwindigkeitsbereich langsamer als die akustische Entspannung untergebracht werden können. Da sich die mechanischen Veränderungen außerdem auf das chemische Verhalten auswirken und umgekehrt, kann die korrelative mechanische und chemische Bildgebung der Schlüssel zur Aufdeckung von Ursache-Wirkungs-Beziehungen in Lebensprozessen sein104. Darüber hinaus wird die Erkenntnis, dass mechanische Aktivitäten vielfältig und nichtlinear sind und kein einfaches Maß für die Steifigkeit darstellen, einen großen Beitrag zur korrekten Beantwortung biologischer Fragen leisten.

Obwohl markierungsfreie Mikroskope in vielen Aspekten biologischer Proben ein enormes Potenzial haben, eignen sich einige biologische Ziele besser für die markierungsfreie optische Mikroskopie und sind von hoher Relevanz für die biomedizinische Forschung. Wir bezeichnen sie als Super-Biotargets (Tabelle 1). Angesichts der großen Verbesserungen bei markierungsfreien optischen Mikroskopen in den letzten Jahrzehnten besteht ein enormer Spielraum für Verbesserungen in Bezug auf Geschwindigkeit, Auflösung, quantitative Genauigkeit, Selektivität und die Möglichkeit einer automatisierten Analyse.

Auflösung: Das Interesse an Superauflösungsmikroskopie für Bioanwendungen zur Beobachtung kleinerer Einheiten in Aktion ist schnell gewachsen. Fluoreszenzbasierte Superauflösungsmethoden wie STORM, STED, PALM und SR-SIM135 erfüllen diesen Bedarf. Das enorme Interesse an Superauflösung und die mit der Markierung verbundenen Einschränkungen motivierten die markierungsfreie optische Nanoskopie. Heutzutage gibt es den Bereich der markierungsfreien Nanoskopie mit nachgewiesenen Bioanwendungen in der Phasenbildgebung34, der photoakustischen Bildgebung73, der Autofluoreszenz81 und SHG6. Das Versprechen, dass diese durch die Klärung der Spezifität und Artefaktcharakterisierung weiter verbessert würden, würde weiter profitieren.

Geschwindigkeit: Die Realisierung ultraschneller Bildgebung ist nicht neu. Durch den Einsatz innovativer optischer Hardware, einschließlich strukturierter Beleuchtung, ultraschneller Fokussierung und effizienter Erkennung, lässt sich die Bildgebungszeit verkürzen, ohne die Bildqualität zu beeinträchtigen136,137. Das Hauptziel besteht darin, schnelle Bewegungen im Körper auf verschiedenen Skalen zu erfassen, die vom schlagenden Herzen bis zum subzellulären Frachttransport reichen. Die Geschwindigkeit der Bildgebung geht zu Lasten einer effizienten Informationserfassung. Dazu gehört die zuverlässige Einbeziehung der von der Probe kommenden Signale und der effiziente Umgang mit dem Rauschen ohne Beeinträchtigung der Bildqualität.

Genauigkeit: Unter Bildgenauigkeit versteht man die Genauigkeit der Bildgebungssysteme bei der zuverlässigen Übermittlung der Informationen aus der Probe. Beleuchtungstechnik, Probenhandhabung und Detektionssysteme können das Signal-Rausch-Verhältnis verbessern und so die Artefakte verringern. Allerdings ist das Rauschen oft ein fester Bestandteil des Signals und kann sogar wichtige Informationen enthalten, die bei Ausnutzung verborgene Informationen offenbaren können. Daher kann die Charakterisierung dessen, was als Lärm wahrgenommen wird, hilfreich sein. Computersimulationen können die Licht-Proben-Interaktion und insbesondere die Signale modellieren, die voraussichtlich vom mikroskopischen System erkannt werden. Die Herausforderung der aktuellen rechnerischen Modellierung besteht heute darin, solche Faltungen zu entschlüsseln, um das sogenannte Rauschen auszunutzen, das zu einem besser nutzbaren Signal pro Erfassung führt, was zu einer schnelleren und genaueren Bildgebung in allen drei Raumachsen führt.

Selektivität: Räumliche Selektivität impliziert die Abbildung des präzisen 3D-Raums der Probe. Eine verbesserte Genauigkeit liefert selektivere Informationen und unterdrückt gleichzeitig Signale von anderswo. Dies ist natürlich der Schlüssel zur Integration der markierungsfreien optischen Bildgebung in die allgemeine biologische Forschung. Dies ist in der medizinischen Diagnose von entscheidender Bedeutung, wenn das Auftreten einer bestimmten Komponente ein Krankheitsmarker ist. Selektivität kann auf viele Arten angegangen werden. Am häufigsten werden bekannte Benchmarks mit Standards verglichen. Obwohl häufig festgestellt wird, dass die genauen Anforderungen an Standards nicht zu einer neuen Methode passen, sondern an bestehende Standards angepasst werden. Die andere Möglichkeit besteht darin, inhärente identifizierende Faktoren wie Form oder Textur zu finden. Beispielsweise sind in der Phasenkarte der Zellen sowohl Mitochondrien als auch Aktinfilamente zu sehen, und QPM kann verwendet werden, um sie durch virtuelles Multiplexen unter Verwendung eines Maßes wie dem Brechungsindex zu unterscheiden. Bei der Autofluoreszenzbildgebung können die inhärenten Maßnahmen einfach die Anregungs- und Emissionsfilter sein, um die Abbildung spezifischer Moleküle zu ermöglichen.

Automatisierung: Computerwerkzeuge können eingesetzt werden, um Strukturen zu bewerten, zu identifizieren, zu lernen und die Endbenutzer darüber zu informieren, die ansonsten nicht unterscheidbar wären. Dies kann während der Entwicklung eine aufwändige Aufgabe sein, aber diese virtuelle Kennzeichnung der spezifischen Strukturen kann sich auf lange Sicht für Hochdurchsatzdienste wie klinisches Screening und Unterstützung bei der Diagnose lohnen. Deep Learning ist ein leistungsstarkes Werkzeug, um Aufgaben wie die Klassifizierung zwischen Testgruppen zu erledigen. Es ist jedoch wichtig, die Grundlagen rechnerischer Entscheidungen zu erkennen. Derzeit von Interesse für Computerwissenschaftler, die an interpretierbaren neuronalen Netzen mit Potenzial für Knowledge Mining und grundlegende Entdeckungen arbeiten.

Somit hat die markierungsfreie optische Mikroskopie einen langen Weg zurückgelegt, indem sie die Grenzen für eine vielschichtige, ungestörte Live-Bildgebung biologischer Prozesse erweitert. Ein anhaltender Schmerzpunkt ist jedoch das Problem der Phototoxizität, die heutzutage bei optischen Mikroskopietechniken durch das Beleuchtungslicht verursacht wird. Dies ist ein großes Problem bei der Fluoreszenzbildgebung138. Im markierungsfreien Bereich ist die Phototoxizität bei Breitbandbeleuchtung wie QPM relativ gering24, ist aber bei laserbasierten Modalitäten wie SHG, CARS und Spektralbildgebung immer noch signifikant (bis zu GW/cm2 mit Femtosekunden-Laserpulsen)139. Phototoxizität führt zu winzigen molekularen bis genetischen Veränderungen, die eine wirklich ungestörte Bildgebung des Lebens einschränken. Da die Phototoxizität von mehreren Faktoren abhängt, einschließlich der Art der Mikroskopie, der Wahl der Wellenlänge, der Probenvorbereitung und der Probenart. Daher müssen Protokolle und Systeme weiterentwickelt werden, um Best Practices bei der Live-Bildgebung sicherzustellen.

Beim Bioimaging ist das Ganze wirklich mehr als die Summe seiner Teile. Die fünf Aspekte der Entwicklung eines markierungsfreien Mikroskops (Abb. 3) werden den Gesamtbereich der Erfassung verborgenerer Details erweitern. Allerdings werden weiterhin Mikroskope mit besserer Auflösung, Geschwindigkeit und besserem Sichtfeld auf den Markt kommen, aber dies allein reicht möglicherweise nicht aus, um grundlegende Fragen der Biologie zu beantworten und dadurch in die Bioforschung integriert zu werden. Es müssen Strategien entwickelt werden, die eher auf Integration als auf Anwendung abzielen. Durch die Kombination mehrerer markierungsfreier optischer Mikroskopien kann der Aspekt der Multimodalität genutzt werden, die sich gegenseitig ergänzen können, indem fehlende Teile einer Studie ergänzt werden. Darüber hinaus kann die korrelative Bildgebung markierungsfreier und markierungsbasierter Methoden nicht nur die Bioforschung weiter stärken, sondern auch neue Nischenbereiche für den Einsatz markierungsfreier Mikroskopie schaffen. Markierungs- und Fluoreszenzmikroskopietechniken haben sich bewährt und sind nicht nur Arbeitspferde für hochpräzise Ergebnisse mit hohem Durchsatz, sondern auch die Hauptantriebskräfte dafür, die Mikroskopie den Biowissenschaftlern näher zu bringen, indem sie Meilensteine ​​schaffen, die unser heutiges Verständnis des Lebens geprägt haben. Die Entwicklung von Sonden wie endogenen Proteinen und lebenden zellfreundlichen Farbstoffen ermöglicht auch die Live-Bildgebung. Es besteht jedoch eine Komplementarität zwischen markierungsbasierten Mikroskopen und markierungsfreien Mikroskopen. Wenn man die gegenseitige Komplementarität versteht, versteht man die Geheimnisse des Lebens besser. Markierungen helfen uns bei der Spezifitätssicherheit im Meer von Tausenden von Molekülen. Markierungsfreie Mikroskope liefern die biologischen Merkmale als Ganzes und sind daher reich an Informationen. Daher lassen sich mit solchen Methoden häufig Veränderungen in einem System beobachten und bei der Formulierung von Hypothesen helfen. Die etikettenbasierten Methoden können dabei helfen, wichtige Ergebnisse aus diesem Informationsmeer zu extrahieren, indem sie spezifische Etiketten verwenden, um solche Hypothesen zu validieren oder zu entkräften. Daher müssen Studien mit einem Handschlag zwischen den beiden Mikroskopen funktionieren, um den Output der Life-Science-Forschung zu maximieren.

Die Abbildung verdeutlicht das technologische Wachstumspotenzial markierungsfreier optischer Mikroskope. Der mittlere Kreis zeigt die aktuelle Grenze der markierungsfreien optischen Mikroskopie, und die Blütenblätter stellen die verschiedenen Aspekte dar, in denen es wachsen und schließlich den Anwendungsbereich markierungsfreier Mikroskope für die biologische Bildgebung erweitern kann. Das eigentliche Wachstumspotenzial liegt jedoch stark in der Integration der Techniken in die biomedizinischen Standardroutinen.

Um markierungsfreie Mikroskope für Biologen unverzichtbar zu machen, müssen weitere Adapterwerkzeuge entwickelt werden, die als Brücken zwischen Biologen und Entwicklern von markierungsfreien Mikroskopen fungieren. Ein gutes Beispiel für ein solches Adapterwerkzeug bei der Fluoreszenzmarkierung ist die Entdeckung des Fluoreszenzproteins GFP, das durch Fluoreszenzmikroskope eine revolutionäre Veränderung in der Bioforschung mit sich brachte. In ähnlicher Weise können im markierungsfreien Bereich durch Materialtechnik hergestellte Kalibrierungs- und Quantifizierungsphantome ein potenzielles Adapterwerkzeug sein, um genau definierte Ziele für Brechungsindex, Streuung und Absorptionskoeffizienten zu entwickeln140. Vibrations-Tags141 für die Kalibrierung chemischer Bindungen in der Spektralbildgebung wie Raman, CARS und SRS sind ebenfalls gute Beispiele für die chemische Bildgebung. Gewebeähnliche Phantome142 mit definierten mechanischen Eigenschaften können eine mikroskopische Elastographie ermöglichen. Diese Integration der Bildgebungsforschung mit Forschung in Chemie und Materialwissenschaften zur Entwicklung von Standardisierungs- und Benchmarking-Tools für markierungsfreie Mikroskope kann einen langfristigen Einfluss darauf haben, diese Mikroskope in den Mainstream zu bringen.

Eine weitere Herausforderung bei der Einführung markierungsfreier Bildgebung in die allgemeine biologische Forschung ist die Notwendigkeit aktiver Anstrengungen zur Schaffung von Werten in den Biowissenschaften. Dies bedeutet, Gemeinsamkeiten mit bestehenden, bewährten Technologien zu identifizieren und innovative Wege zu finden, um markierungsfreie Bildgebung zur Beantwortung biologischer Fragen zu nutzen. Viele markierungsfreie Methoden wie IRM und iSCAT können mit ein paar Modifikationen einfach zu bestehenden konfokalen Mikroskop-Setups hinzugefügt werden. Weitere Spin-off-Unternehmen entwickeln kennzeichnungsfreie quantitative Phasenmikroskope und sorgen mit benutzerfreundlichen Schnittstellen für eine kommerzielle Verfügbarkeit, wie z. B. Mikroskope von phi-optics Inc und nanolive143. Zwei-Photonen-basierte nichtlineare Mikroskopiemethoden wie SHG und CARS sind bei etablierten Mikroskopunternehmen wie Zeiss und Leica kommerziell erhältlich. Ein weiterer Ansatz ist eine langfristige Zusammenarbeit zwischen Mikroskopieentwicklern und biologischen Einrichtungen, um funktionierende Systeme am Versuchsort zu etablieren und eng zusammenzuarbeiten, um sowohl die Methode als auch den biologischen Wert zu verbessern.

Der Vorteil markierungsfreier Mikroskope liegt in der Vielfalt der biologischen Aspekte, die sie überwachen können, von Lichtmodulation, Energieaustausch, Chemie und Mechanik. Alle diese Eigenschaften sind den biologischen Materialien inhärent und stellen daher Informationen in ihrem ursprünglichen Zustand ohne äußere Störungen dar, um die brennenden Fragen zu lösen, die heute in der Biologie bestehen. Daher müssen politische Entscheidungsträger, Förderagenturen, Investoren und die Industrie das Potenzial der markierungsfreien Mikroskopie mit Biowissenschaften erschließen und eine große Belegschaft motivieren, die sich künftig für solche Aktivitäten einsetzt.

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Diese Arbeit wurde durch das von H2020 finanzierte FET-Open RIA-Projekt OrganVision (ID 964800) unterstützt. Die Figuren wurden in BioRender.com erstellt. Wir danken den Herausgebern und Gutachtern für ihr wertvolles Feedback.

Open-Access-Finanzierung bereitgestellt von UiT The Arctic University of Norway (einschließlich Universitätsklinikum Nordnorwegen).

UiT – Arktische Universität Norwegens, Tromsø, Norwegen

Biswajoy Ghosh & Krishna Agarwal

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BG und KA haben den Artikel konzipiert und überprüft. BG hat die Arbeit geschrieben und die Figuren entworfen.

Korrespondenz mit Biswajoy Ghosh oder Krishna Agarwal.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Marco Fritzsche und Manuel Breuer. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ghosh, B., Agarwal, K. Das Leben ohne Etiketten unter optischen Mikroskopen betrachten. Commun Biol 6, 559 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04934-8

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Eingegangen: 21. Februar 2023

Angenommen: 12. Mai 2023

Veröffentlicht: 25. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04934-8

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