Neue Methoden der Expansionsmikroskopie verstärken die Wirkung der Forschung

Dank Innovationen in der Expansionsmikroskopie sind jetzt beispiellose Einblicke in das Innere von Zellen und anderen nanoskaligen Strukturen möglich. Die Fortschritte könnten dazu beitragen, zukünftige Einblicke in die Neurowissenschaften, Pathologie und viele andere biologische und medizinische Bereiche zu gewinnen.

In der Zeitung„Magnify ist eine universelle molekulare Verankerungsstrategie für die Expansionsmikroskopie“, veröffentlicht in der Zeitschrift Nature Biotechnology. Mitarbeiter der Carnegie Mellon University, der University of Pittsburgh und der Brown University beschreiben neue Protokolle für Magnify.

„Magnify kann ein wirksames und zugängliches Werkzeug für die Biotechnologie-Community sein“, sagte Yongxin (Leon) Zhao, außerordentlicher Professor für Biowissenschaften bei Eberly Family Career Development.

Das Biophotonics Lab von Zhao ist führend auf dem Gebiet der Ermöglichung hochauflösender Bildgebung biologischer Proben durch physikalische Expansion von Proben in einem Prozess, der als Expansionsmikroskopie bekannt ist. Bei diesem Verfahren werden die Proben in ein quellbares Hydrogel eingebettet, das sich homogen ausdehnt, um den Abstand zwischen den Molekülen zu vergrößern und so eine genauere Beobachtung zu ermöglichen. Dadurch können nanoskalige biologische Strukturen, die bisher nur mit teuren hochauflösenden Bildgebungstechniken sichtbar waren, mit Standardmikroskopiegeräten sichtbar gemacht werden.

Magnify ist eine Variante der Expansionsmikroskopie, die es Forschern ermöglicht, eine neue Hydrogelformel zu verwenden, die von Zhaos Team erfunden wurde, die ein Spektrum an Biomolekülen beibehält, eine breitere Anwendung auf eine Vielzahl von Geweben bietet und die Expansionsrate bis zu 11-fach linear erhöht ~1.300-fache des Originalvolumens.

„Wir haben einige der langjährigen Herausforderungen der Expansionsmikroskopie gemeistert“, sagte Zhao. „Eines der Hauptverkaufsargumente für Magnify ist die universelle Strategie, die Biomoleküle des Gewebes, einschließlich Proteine, Nukleinsäuren und Kohlenhydrate, in der erweiterten Probe zu halten.“

Zhao sagte, dass es wichtig sei, verschiedene biologische Komponenten intakt zu halten, da frühere Protokolle die Eliminierung vieler verschiedener Biomoleküle erforderten, die das Gewebe zusammenhielten. Doch diese Moleküle könnten wertvolle Informationen für Forscher enthalten.

„Um Zellen wirklich expandierbar zu machen, musste man in der Vergangenheit Enzyme verwenden, um Proteine ​​zu verdauen. Am Ende hatte man also ein leeres Gel mit Etiketten, die den Ort des interessierenden Proteins anzeigten“, sagte er. Mit der neuen Methode bleiben die Moleküle intakt und mehrere Arten von Biomolekülen können in einer einzigen Probe markiert werden.

„Früher war es so, als hätte man Single-Choice-Fragen. Wenn man Proteine ​​markieren wollte, wäre das das Protokoll der ersten Version. Wenn man Kerne markieren wollte, dann wäre das eine andere Version“, sagte Zhao. „Wenn man eine gleichzeitige Bildgebung durchführen wollte, war das schwierig. Mit Magnify kann man jetzt mehrere Elemente zum Markieren auswählen, etwa Proteine, Lipide und Kohlenhydrate, und sie zusammen abbilden.“

Die Laborforscher Aleksandra Klimas, eine Postdoktorandin, und Brendan Gallagher, ein Doktorand, waren die ersten Co-Autoren des Artikels.

„Dies ist eine zugängliche Möglichkeit, Proben in hoher Auflösung abzubilden“, sagte Klimas. „Traditionell benötigt man teure Ausrüstung und spezielle Reagenzien sowie Schulung. Diese Methode ist jedoch auf viele Arten der Probenvorbereitung breit anwendbar und kann mit Standardmikroskopen betrachtet werden, die man in einem Biologielabor hat.“

Gallagher, der über einen Hintergrund in den Neurowissenschaften verfügt, sagte, ihr Ziel sei es, die Protokolle so kompatibel wie möglich für Forscher zu machen, die von der Einführung von Magnify als Teil ihrer Toolkits profitieren könnten.

„Eines der Schlüsselkonzepte, die wir im Auge behalten wollten, bestand darin, die Forscher dort abzuholen, wo sie sind, und sie so wenig Dinge wie möglich an ihren Protokollen ändern zu lassen“, sagte Gallagher. „Es funktioniert mit verschiedenen Gewebetypen, Fixierungsmethoden und sogar mit konserviertem und gelagertem Gewebe. Es ist sehr flexibel, da Sie Experimente mit Magnify nicht unbedingt komplett neu gestalten müssen; es funktioniert mit dem, was Sie bereits haben.“ ."

Für Forscher wie Simon Watkins, den Gründer und Direktor des Center for Biological Imaging an der University of Pittsburgh und des Pittsburgh Cancer Institute, ist die Tatsache, dass das neue Protokoll mit einer breiten Palette von Gewebetypen – einschließlich konservierter Gewebeschnitte – kompatibel ist wichtig. Beispielsweise sind die meisten Methoden der Expansionsmikroskopie für Gehirngewebe optimiert. Im Gegensatz dazu wurde Magnify an Proben verschiedener menschlicher Organe und entsprechender Tumoren getestet, darunter Brust, Gehirn und Dickdarm.

„Nehmen wir an, Sie haben ein Gewebe mit dichten und nicht dichten Komponenten. Dadurch werden Gewebe umgangen, die sich zuvor nicht isometrisch ausdehnen würden“, sagte Watkins. „Leon hat hart daran gearbeitet, damit dieses Protokoll mit archivierten Geweben funktioniert.“

Xi (Charlie) Ren, Assistenzprofessor für Biomedizintechnik an der Carnegie Mellon, untersucht das Lungengewebe und wie man seine Morphogenese und Pathogenese modellieren kann. Ein Teil seiner Forschung umfasst die Erforschung der beweglichen Flimmerhärchen, die den Schleim in den leitenden Atemwegen des Menschen beseitigen. Mit einem Durchmesser von 200 Nanometern und einer Länge von nur wenigen Mikrometern sind die Strukturen zu klein, um ohne zeitintensive Technologie wie Elektronenmikroskopie gesehen zu werden. In Zusammenarbeit mit Zhaos Labor entwickelte und lieferte Rens Team Lungenorganoidmodelle mit spezifischen Defekten in der Ultrastruktur und Funktion der Zilien, um die Fähigkeit von Magnify zur Visualisierung klinisch relevanter Zilienpathologien zu validieren.

„Mit den neuesten Magnify-Techniken können wir dieses Lungengewebe erweitern und beginnen, sogar mit einem normalen Mikroskop eine gewisse Ultrastruktur der beweglichen Flimmerhärchen zu erkennen, und das wird sowohl grundlegende als auch klinische Untersuchungen beschleunigen“, sagte er.

Die Forscher konnten auch Ziliendefekte in patientenspezifischen Lungenzellen erkennen, von denen bekannt ist, dass sie genetische Mutationen aufweisen.

„Die Community des Lungengewebe-Engineerings braucht immer eine bessere Möglichkeit, das Gewebesystem, mit dem wir arbeiten, zu charakterisieren“, sagte Ren. Er fügte hinzu, dass diese Arbeit ein wichtiger erster Schritt sei und er hoffe, dass die Zusammenarbeit mit Zhaos Labor weiter verfeinert und auf pathologische Proben aus Gewebebanken angewendet werde.

Schließlich ist das in Magnify verwendete und im Zhao-Labor entwickelte Hydrogel robuster als sein Vorgänger, der sehr zerbrechlich war und während des Prozesses zu Brüchen führte.

„Wir hoffen, diese Technologie weiterzuentwickeln, um sie der Community zugänglicher zu machen“, sagte er. „Dies kann in verschiedene Richtungen gehen. Es besteht großes Interesse daran, diese Art der Gewebeexpansion-Technologie für die Grundlagenforschung zu nutzen.“

Alison Barth, Maxwell H. und Gloria C. Connan-Professorin für Biowissenschaften an der Carnegie Mellon, untersucht synaptische Konnektivität beim Lernen. Sie sagte, dass die breiten Anwendungsmöglichkeiten der neuen Methoden ein Segen für die Forscher sein würden.

„Das Gehirn ist ein großartiger Ort, um diese hochauflösenden Techniken zu nutzen“, sagte Barth, der bei mehreren Studien mit dem Zhao Lab zusammenarbeitet. „Mikroskopiemethoden werden für die synaptische Phänotypisierung und Analyse verschiedener Gehirnerkrankungen von Nutzen sein. Einer der größten Fortschritte in dieser Arbeit ist die Fähigkeit der Methode, mit vielen verschiedenen Arten von Gewebeproben zu arbeiten.“

Weitere Studienautoren sind Piyumi Wijesekara, Emma F. DiBernardo, Zhangyu Cheng von Carnegie Mellon; Sinda Fekir und Christopher I. Moore von der Brown University; Donna B. Stolz von Pitt; Franca Cambi von der Pitt and Veterans Administration; und Steven L. Brody und Amjad Horani von der Washington University.

Diese Arbeit wurde von Carnegie Mellon, der Kaufman Foundation und der DSF Charitable Foundation, dem US-Verteidigungsministerium (VR190139), den National Institutes of Health (DP2 OD025926-01 und NIH RF1 MH114103) und dem Air Force Office of Scientific Research (FA9550) unterstützt -19-1-13022629), NeuroNex (GR5260228.1001) und Brown University.

– Diese Pressemitteilung wurde von der Carnegie Mellon University bereitgestellt