Nanofaserbildung als vielversprechende Technologie zur Konservierung und einfachen Lagerung extrazellulärer Vesikel

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 22012 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind aus Zellen stammende, membranumschlossene Partikel mit dem Potenzial für ein breites Spektrum zukünftiger therapeutischer Anwendungen. Elektrofahrzeuge wurden jedoch fast immer durch Direktinjektion verabreicht, was ihre Wirksamkeit wahrscheinlich aufgrund der schnellen Clearance von der Injektionsstelle beeinträchtigt. Ziel der vorliegenden Studie war es, mittelgroße extrazelluläre Vesikel (mEVs) in sich schnell auflösende elektrogesponnene Nanofasern auf Polyvinylpyrrolidonbasis einzubauen, um die speicherabhängige Struktur-Aktivitäts-Beziehung der resultierenden Nanofaserformulierungen zu untersuchen. Für den Elektrospinnprozess wurden wässrige Vorläuferlösungen auf Polyvinylpyrrolidonbasis ausgewählt. Das Vorhandensein von Elektrofahrzeugen in den elektrogesponnenen Proben wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie, Durchflusszytometrie und konfokales Laser-Scanning-Mikroskop bestätigt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Faserstruktur der Proben bis zum Ende der 12-wöchigen Lagerzeit erhalten blieb. Darüber hinaus waren während des gesamten Versuchszeitraums unabhängig von der Lagertemperatur (4 °C oder Raumtemperatur) Nanofasern und mit Nanofasern assoziierte Elektrofahrzeuge vorhanden. Der Einbau von Elektrofahrzeugen in eine stabile, feste, polymere Trägerbasis könnte ihre Stabilität bewahren; mittlerweile kann je nach den Eigenschaften des Polymers eine gezielte und kontrollierte Freisetzung erreicht werden.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind kleine, durch Lipiddoppelschichten begrenzte Vesikel, die sich in Größe und Biogenese unterscheiden, auf natürliche Weise aus multivesikulären Körpern/Amphisomen oder der Plasmamembran freigesetzt werden und dann in die Körperflüssigkeiten gelangen1. Zusätzlich zu ihrer physiologischen Rolle bei der zellulären Homöostase, der interzellulären Kommunikation und der Immunantwort als natürliche biokompatible Träger bioaktiver Substanzen richtet sich das Interesse in jüngster Zeit auf ihre Verwendung als Mittel zur Arzneimittelabgabe2,3. Elektrofahrzeuge können die effiziente Internalisierung von vesikelverkapselten Arzneimitteln ermöglichen4,5. Elektrofahrzeuge können von Empfängerzellen aufgenommen werden, was ihre Anwendung sowohl als primäre Therapeutika als auch als Vehikel zur Arzneimittelabgabe ermöglicht.

Von mesenchymalen Stammzellen abgeleitete EVs (MSC-EV) haben ein vielversprechendes Potenzial für die Geweberegeneration gezeigt. Ihr therapeutisches Potenzial ist jedoch durch ihren schnellen Abbau und ihre kurze Halbwertszeit begrenzt6. Es wurden verschiedene Ansätze für den exogenen Einbau von Arzneimitteln in isolierte Elektrofahrzeuge beschrieben, die von der einfachen Inkubation über lipophile Moleküle bis hin zu aktiven Beladungstechniken hydrophobisierter Verbindungen wie wiederholtem Einfrieren und Auftauen und Permeabilisierung mit Saponin, Extrusion, Ultraschall und Elektroporation7 reichen. In Elektrofahrzeugen eingekapselte Moleküle können funktionell aktive biologische Substanzen sein, darunter Proteine, mRNA und miRNA, die in der Lage sind, Signale über Blut- und Lymphgefäße an umliegende Zielzellen sowie an entfernte Organe zu übertragen8. Die strukturelle Komplexität von Biologika kann auch zusätzliche Herausforderungen bei der Formulierung und Verabreichung mit sich bringen, insbesondere im Hinblick auf die Stabilität. Um das Zielgewebe zu erreichen, kann EV auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, beispielsweise intravenös, intraperitoneal, oral, intranasal und subkutan. Allerdings wurden Elektrofahrzeuge fast immer als Direktinjektionen verabreicht, was aufgrund des schnellen Ausflusses aus der Injektionsstelle wahrscheinlich ihre Wirksamkeit beeinträchtigt9. Um die toxische Wirkung von Elektrofahrzeugen in Nichtzielorganen zu minimieren und die beabsichtigten therapeutischen Wirkungen zu maximieren, sollten die isolierten Elektrofahrzeuge in Biomaterialien eingebaut werden, die ihre Freisetzung kontrollieren können.

Elektrofahrzeuge können vom konditionierten Medium von Zellkulturen getrennt werden. Bezüglich der Lagerung von konditioniertem Medium empfiehlt die Internationale Gesellschaft für extrazelluläre Vesikel (MISEV2018) die Lagerung von Elektrofahrzeugen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei -80 °C in silikonisierten Gefäßen, um ein Anhaften von Elektrofahrzeugen an Oberflächen10 bei −80 °C zu verhindern.

Kürzlich PBS mit HEPES, menschlichem Serumalbumin und Trehalose11. Die Verwendung dieser Lagerbedingung kann jedoch durch Kosten- und Transportprobleme eingeschränkt sein.

Daher sind alternative Lösungen erforderlich, um die Lagerstabilität von Elektrofahrzeugen zu verbessern12. Basierend auf einigen früheren Studien13,14 lässt sich der Schluss ziehen, dass die Einbettung von Elektrofahrzeugen in Nanofasern eine gute Lösung zur Überwindung ihrer Stabilitätsprobleme sein könnte. Es hat sich gezeigt, dass die Zellen nach dem Elektrospinnen lebensfähig bleiben und die resultierenden mit Zellen gefüllten Fasern können für eine Vielzahl therapeutischer Anwendungen verwendet werden. Trindade et al.15 entwickelten schnell auflösende Gerüste, um eine schnelle Bewertung der EV-Belastung zu ermöglichen. Sie fanden heraus, dass die Wahl des Lösungsmittels besonders relevant ist, wenn biologisches Material beim Single-Fluid-Elektrospinnen verarbeitet wird. Anstelle von Ethanol wurde Trifluorethanol verwendet, da es ein schonenderes Lösungsmittel für biologische Proben ist16. Das Elektrospinnen ist eine schnelle, kostengünstige, skalierbare Raumtemperaturtechnologie zur Bildung komplexer Nanofaserstrukturen und eine gute Wahl für die Formulierung empfindlicher Wirkstoffe.

In unserem Projekt wurde als Basis der elektrogesponnenen Nanofaserformulierung Polyvinylpyrrolidon (PVP) gewählt. Das PVP ist ein inertes, ungiftiges und biokompatibles Polymer, das es zu einem vielseitigen Hilfsstoff sowohl für konventionelle Formulierungen als auch für neuartige kontrollierte oder gezielte Abgabesysteme macht und als Bindemittel, Beschichtungsmittel, Suspendiermittel, Porenbildner, Lösungsvermittler, Stabilisator usw. dient . PVP mit unterschiedlichen Molekulargewichten und Konzentrationen wird in verschiedenen Formulierungen für unterschiedliche Zwecke verwendet. Aufgrund der Wasserlöslichkeit, Hydrophilie und Fähigkeit zur Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen kann die Bioverfügbarkeit und Stabilität der pharmazeutischen Wirkstoffe verbessert, die physikalisch-chemische Stabilität der Präparate verbessert, die Freisetzungsrate von Arzneimitteln angepasst und die In-vivo-Wirkung verlängert werden Zirkulationszeit von Liposomen17,18.

Nanofaserige Proben, die mEVs enthalten, können ex tempore aufgelöst werden, daher ist die gute wasserlösliche Eigenschaft der Matrix von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus ist PVP eine gute Wahl für den Faserbildungsprozess, da es auch über ausgezeichnete Elektrospinnbarkeitseigenschaften verfügt19,20,21,22. Um die Struktur der Elektrofahrzeuge zu erhalten, ist eine isotonische Lösung erforderlich, allerdings erhöht sich die Oberflächenspannung der Lösung, was den stabilen Faserbildungsprozess erschwert. Es gibt andere hydrophile, biokompatible Polymere, z. B. Cellulosederivate, die ebenfalls häufig in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden, aber die Faserbildung aus ihren wässrigen Lösungen ist schwierig, geschweige denn aus ihren isotonischen Lösungen23,24,25. Allerdings bilden Cellulose-Nanofasern von Natur aus nanoporöse Netzwerke; Daher kann es potenziell nanoskalige Elektrofahrzeuge einschließen, die nahe an der Porengröße der Cellulose-Nanofasern liegen. Darüber hinaus könnten verschiedene chemische Wechselwirkungen, beispielsweise über Wasserstoffbrückenbindungen, elektrostatische Kräfte oder andere spezifische Wechselwirkungen, die Isolationseffizienz verbessern26.

Das verbesserte Verständnis darüber, wie die isolierten und verarbeiteten therapeutischen Elektrofahrzeuge am besten gelagert werden können, würde es den auf Elektrofahrzeugen basierenden Ansätzen ermöglichen, ihr volles vielseitiges Potenzial als neue Klasse vielversprechender Therapeutika und Arzneimittelträger auszuschöpfen. Daher zielt die vorliegende Arbeit darauf ab, den Einbau von Elektrofahrzeugen in biologisch abbaubare, schnell auflösende, elektrogesponnene Nanofasern auf PVP-Basis zu untersuchen, die aus einer wässrigen Vorläuferlösung hergestellt werden, und die lagerungsabhängige Struktur-Aktivitäts-Beziehung der resultierenden Nanofaserformulierungen zu untersuchen. Unsere Charakterisierung der Nanofaserformulierungen umfasste die Bewertung der Morphologie, der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Lagerstabilität.

Als Basis der Formulierung wurde das biologisch abbaubare, biokompatible und gut elektrospinnbare Polymer Polyvinylpyrrolidon (PVP, Kollidon K90, mittleres Molekulargewicht, Mw ~ 1.500.000 g mol−1 (Merck Ltd., Budapest, Ungarn) gewählt. Polysorbat 80 (Molar Chemicals Ltd., Budapest). , Ungarn) wurde verwendet, um die Oberflächenspannung der Lösung zu verringern und die Faserbildungsfähigkeit der isotonischen Vorläuferlösung zu verbessern. Das Natriumchlorid (Molar Chemicals, Budapest, Ungarn) wurde für die Isotonisierung der PVP-basierten Vorläuferlösung verwendet Der Faserbildungsprozess. Für die Lösungsvorbereitung wurde destilliertes Wasser in Arzneibuchqualität ohne weitere Reinigung verwendet.

Die HEK293T-palmGFP-Zelllinie wurde freundlicherweise von Charles Lai und Xandra Breakefield zur Verfügung gestellt. Die HEK293T-palmGFP-Zellen wurden in DMEM kultiviert, das 10 % (v/v) fötales Rinderserum (FBS), 1000 U/L Penicillin, 1000 U/L Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1 g/L Glucose enthielt. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % (v/v) CO2 gehalten. Der Mykoplasmen-Infektionsstatus der Zellkultur wurde überwacht. Das konditionierte Medium wurde 24 Stunden nach dem FBS-Entzug aus acht 182,5 cm2 großen Flaschen mit behandelter Oberfläche (VWR, USA) gesammelt. Die Anzahl der Passagen lag zwischen 16 und 22, und die Zellkultur erreichte eine Konfluenz von 80–90 %, was 179 × 106 ± 69,3 × 106 Zellen pro Trennung entspricht. Während der EV-Trennung wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Färbung und Durchflusszytometrie sowie Färbung mit TO-PRO-3 und Annexin V bestimmt. Während der EV-Trennung wurde das konditionierte Medium 10 Minuten lang bei 300 g und 4 °C zentrifugiert und filtriert mit einem 5 μm Zellsieb (Millipore, USA). Die großen Evs wurden bei 2000 g und 4 °C 30 Minuten lang entfernt. Die mEVs wurden 40 Minuten lang bei 4 °C und 12.500 g vom Überstand abgetrennt. Das mEV-Pellet wurde einmal mit NaCl-HEPES (10 mM, 12.500 g, 4 °C, 40 min) gewaschen. Das mEV-Pellet wurde in 100 µL NaCl-HEPES (10 mM) resuspendiert. 50 µL (1,6 × 109 ± 6,7 × 108 Partikel) wurden zur Bildung mEV-haltiger PVP-Nanofasern (PVP-mEV) verwendet, 42 µL (1,3 × 109 ± 5,6 × 108 Partikel) wurden zur Erzeugung freier mEV-Kontrollproben verwendet und 8 µL wurde zur Charakterisierung der mEV-Fraktion verwendet. Das Vorhandensein von mEVs wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Durchflusszytometrie, Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) sowie Protein- und Lipidquantifizierung bestätigt. Die detaillierten Parameter der Zentrifugationsschritte sind in Tabelle S1 zusammengefasst.

Die Morphologie von Evs wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Die Proben wurden mit geringfügigen Modifikationen auf der Grundlage der Arbeit von Théry und Kollegen hergestellt27. Kurz gesagt, 2–3 µL der Probe wurden auf ein mit Formvar beschichtetes Gitter (Sigma, USA) gelegt und 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die restliche Lösung wurde entfernt und 10 Minuten lang mit 2 % Glutaraldehyd fixiert. Die Gitter wurden dreimal 5 Minuten lang gewaschen und dann der Kontrast mit Uranyloxalat erhöht. Die Proben wurden weiter kontrastiert und in eine Mischung aus 4 % (Gew./Vol.) Uranylacetat und 2 % (Gew./Vol.) Methylcellulose eingebettet. Die Proben wurden mit JEOL 1011 TEM (JEOL Ltd., Tokio, Japan) getestet.

Die Größenverteilung, die mittlere Größe und die Partikelkonzentration der mEVs wurden mithilfe von NTA bestimmt. Die Messung wurde mit einem ZetaView PMX-120 (Particle Metrix GmbH, Meerbusch, Deutschland) unter Verwendung der ZetaVIEW-Software durchgeführt. Die Parameter der Messung sind in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefasst. Der NTA war nicht für die Charakterisierung von in PVP-Fasern eingebetteten mEVs geeignet, da die Anzahl der erkannten Partikel nach der Auflösung reiner PVP-Fasern deutlich anstieg (Abb. S1).

Die Proteinkonzentration wurde mithilfe eines Micro-BCA-Assays (ThermoFisher, USA) bestimmt, für den EV-Proben durch 3–4 Einfrier-Auftau-Zyklen und Ultraschallbehandlung (10 Minuten, 4 °C) vorbereitet wurden. Der Lipidgehalt wurde mit dem von Visnovitz et al., 201928, optimierten Sulfophosphovanillin-Lipid-Assay gemessen.

Die mEVs wurden mit dem CytoFLEX S-Durchflusszytometer (Beckman Coulter, USA) basierend auf dem Nachweis von GFP, AnnexinV, CD81 und CD63 charakterisiert. mEVs wurden in Annexin-Bindungspuffer (AxBB, 10 mM HEPES, 0,14 M NaCl, 2,5 mM CaCl2) verdünnt, der Fluorochrom-konjugiertes AnnexinV oder Antikörper enthielt. Die folgenden Reagenzien wurden verwendet: AnnexinV-AF647 (1:200, Sony Biotechnology, USA), monoklonaler Anti-Human-CD81-PerCP-Cy5.5 (1:200, Isotyp: Maus-IgG1, Klon: 5A6, Sony Biotechnology, USA) , monoklonales Anti-Human-CD63-PerCP-Cy5.5 (1:200, Isotyp: Maus-IgG1, Klon: H5C6, Sony Biotechnology, USA), monoklonales Maus-IgG1-PerCP-Cy5.5 (1:200, Klon: MOPC21, Sony Biotechnology, USA). Nach 15-minütiger Inkubation wurden die Proben eine Minute lang bei einer mittleren Flussrate (30 µL/Minute) analysiert. Das Vorhandensein von mEVs wurde durch Lyse mit Triton X-100 (0,1 %, Molar Chemicals Kft., Budapest, Ungarn) bestätigt. Rohdaten wurden mit der FlowJo-V10-Software verarbeitet. Alle in diesem Experiment verwendeten Antikörper sind in Tabelle S3 aufgeführt.

Reine und mEV-beladene 15 % (Gew./Gew.) wässrige PVP-Polymervorläuferlösungen wurden mit NaCl isotonisch gemacht und für den Faserbildungsprozess verwendet. Um die Faserbildungsfähigkeit der erhöhten Leitfähigkeit und Oberflächenspannung der isotonischen Lösungen zu verbessern, wurde Polysorbat 80 in 1 % (Gew./Gew.) zugesetzt.

Zur Herstellung der Faserproben wurde ein Elektrospinngerät in Laborgröße (SpinSplit Ltd., Budapest, Ungarn) verwendet. Homogene Vorläuferlösungen in einer Kunststoffspritze (Luer-Lock-Spritze, Merck Ltd., Budapest, Ungarn) wurden mit einem Teflonschlauch an einen herkömmlichen Emitter (22 G) angeschlossen. Die Spritzenpumpe sorgte für eine kontinuierliche Flussrate der Vorläuferlösung. Die angelegte Spannung betrug 22–23 kV, der Emitter-Kollektor-Abstand betrug 20 cm und die Flussrate betrug 0,08 μL/s während des Faserbildungsprozesses. Die Elektrospinnen-Experimente wurden in einem gut temperierten Raum mit einer Temperatur von 22 ± 1 °C und 40 ± 5 % Luftfeuchtigkeit durchgeführt.

Die morphologische Analyse der elektrogesponnenen Proben wurde nach dem Sputtern mit Gold mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) vom Typ JEOL JSM-6380LA (JEOL Ltd., Tokio, Japan) durchgeführt. Die Messungen wurden bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV und einem Probenabstand von 10 mm durchgeführt. Auf der Aluminiumfolie geformte Proben wurden mit doppelseitigem Kohlenstoffkleber an Kupferbarren befestigt und dann nach dem Vergolden bei mehrfacher Vergrößerung untersucht. Die Faserdurchmesser wurden mit der ImageJ-Software (US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) gemessen und der durchschnittliche Faserdurchmesser anhand von 100 verschiedenen, zufällig ausgewählten Einzelfasern bei 3500-facher Vergrößerung berechnet.

Die Stabilität freier mEVs und PVP-mEVs, die bei 4 °C oder RT aufbewahrt wurden, wurde 12 Wochen lang zweimal pro Woche mit einem Durchflusszytometer überwacht. Die PVP-mEV-Nanoröhren wurden mit einem Spatel von der Oberfläche der Aluminiumfolie entfernt und die Masse in einem Eppendorf-Röhrchen mit einer Analysenwaage gemessen. PVP-mEV-Nanoröhren wurden in AxBB (33,9 ± 3,7 µL AxBB/1 mg PVP-mEV) gelöst. Als Kontrollen wurden leere PVP-Nanofasern verwendet. Die PVP-, PVP-mEV- und freien mEV-Proben wurden zehnfach in Antikörper oder AnnexinV-haltiger AxBB-Lösung verdünnt. Annexin V-AF647 (1:200, Sony Biotechnology, USA), monoklonales Anti-Human-CD81-PerCP-Cy5.5 (1:200, Isotyp: Maus-IgG1, Klon: 5A6, Sony Biotechnology, USA), monoklonales Maus-IgG1- Es wurde PerCP-Cy5.5 (1:200, Klon: MOPC21, Sony Biotechnology, USA) verwendet. Nach 15-minütiger Inkubation wurden die Proben fünffach verdünnt und mit einem CytoFLEX S-Durchflusszytometer (Beckman Coulter, USA) eine Minute lang bei einer mittleren Flussrate (30 µL/Minute) gemessen. Zählperlen wurden in 20-facher Verdünnung (Count Check Beads-High, 2,436 × 105 Perlen/ml, Sysmex, Deutschland) verwendet, um die mEV-Zahl basierend auf der folgenden Gleichung zu bestimmen:

Die Integrität der mEVs wurde durch Lyse mit TritonX-100 (0,1 %) überprüft. Zur Analyse der Rohdaten wurde die Software FlowJo-V10 verwendet. Alle in diesem Experiment verwendeten Antikörper sind in Tabelle S3 aufgeführt.

Die Stabilität von PVP-mEV-Proben, die bei 4 °C oder RT aufbewahrt wurden, wurde 12 Wochen lang viermal pro Woche mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop überwacht. Die PVP-mEV-Nanoröhren waren auf 24 × 32 mm großen Deckgläsern (VWR, USA) erhältlich. Die Deckgläser wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica TCS SP8 (Leica, Deutschland) untersucht. Durch die umgekehrte Anordnung des Mikroskops konnten wir das Vorhandensein von mit Nanoröhren verbundenen mEVs mit hoher Auflösung nachweisen (unten und oben wurde Immersionsöl verwendet). Die Proben wurden unter den gleichen Einstellungen getestet: 63 × Objektiv, 0,9 % Laserleistung (488 nm), Brechungsindex: 1,516, 16-Linien-Mittelung, 3064 × 3064 Auflösung. Das GFP-Fluoreszenzsignal wurde von einem Hybriddetektor mit sichtbarem Licht bei 300 V PMT erfasst.

Die Werte werden als Mittelwert ± Standardfehler angezeigt. Die statistische Analyse und die Zahlen wurden mit der Software GraphPad Prism 7.00 (USA) erstellt. Zum Vergleich der Daten wurden eine Zwei-Wege-ANOVA und Tukey-Post-hoc-Tests verwendet. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant akzeptiert.

Die mEVs wurden vom konditionierten Medium der HEK293T-palmGFP-Zellen getrennt. Die Lebensfähigkeit der Zellen betrug 93,3 ± 0,9 % (mit Trypanblau-Färbung). Basierend auf durchflusszytometrischen Messungen betrug der Anteil der apoptotischen (AnnexinV+) und sekundären nekrotischen Zellen (AnnexinV+, TO-PRO-3+) 3,9 ± 2,0 % bzw. 5,8 ± 2,1 % (Abb. 1A). Die Größenverteilung der mEVs wurde durch NTA bestimmt (Abb. 1B), basierend darauf, dass ihre mittlere Größe 332,4 ± 25,7 nm betrug (Abb. 1C). Die Partikelzahl betrug 1,7 × 106 ± 2,2 × 105/105 Zellen (Abb. 1D). Das Protein/Lipid-Verhältnis der mEVs betrug 3,0 ± 2,5 (Abb. 1E). Basierend auf durchflusszytometrischen Messungen waren die mEVs GFP-, AnnexinV-, CD81- und CD63-positiv und empfindlich gegenüber der Triton X-100-Lyse (Abb. 1F).

Charakterisierung von HEK293T-palmGFP-abgeleiteten freien mEVs. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert (A). Wir haben die Größenverteilung (B), die mittlere Größe (C) und die Partikelkonzentration (D) von mEVs durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) bestimmt. Wir haben die Vesikel anhand ihres Protein- und Lipidgehalts (E) quantifiziert. Das Vorhandensein von GFP, externalisiertem Phosphatidylserin (gefärbt mit AnnexinV), CD81 und CD63 wurde mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen (F). (AB: Antigenspezifische Färbung mit Antikörper, Tx: Triton X-100, IC: Isotypkontrolle) (Abbildung wurde mit GraphPad Prism 7.00 für Windows, GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, USA, http://www.graphpad erstellt. com).

Die morphologische Charakterisierung der elektrogesponnenen Proben wurde mittels REM durchgeführt. Das Bild zeigt, dass die Zugabe von Vesikeln zur Vorläuferlösung keinen negativen Einfluss auf die Faserbildung hat (Abb. 2A). Es wurde eine deutlich faserige Struktur mit 465 nm ± 62 nm durchschnittlichem Faserdurchmesser ± Standardabweichung mit scheinbar normaler Verteilung erhalten (Abb. 2B). Die Oberfläche der Fasern ist glatt, was darauf hindeutet, dass sowohl die Lösungs- als auch die Faserproduktionsparameter für die Faserproduktion geeignet waren.

REM-Bild der elektrogesponnenen Probe, hergestellt aus PVP-basierten Vorläuferlösungen, die mittelgroße extrazelluläre Vesikel (mEV) enthalten (Vergrößerung: 2500×) (A) und Faserdurchmesserverteilung der Probe (B).

Freie mEV- und PVP-mEV-Proben wurden durch Durchflusszytometrie, konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und TEM charakterisiert (Abb. 3A – C). Im Vergleich zu freien mEVs nahm die mittlere GFP-Fluoreszenzintensität (MFI) von PVP-mEVs ab und die Standardabweichung der Größenverteilung basierend auf dem Violet-SSC-Wert nahm zu. Während freie mEVs empfindlich auf die Lyse von Triton X-100 reagierten, änderte sich die Anzahl der PVP-mEVs nicht wesentlich. Bezüglich des CD81-EV-Markers zeigte freies mEV einen höheren MFI-Wert im Vergleich zu PVP-mEVs. Freie mEVs zeigten AnnexinV-Positivität. Im Gegensatz dazu waren PVP-mEVs AnnexinV-negativ (Abb. 3A).

Vergleich von freien mEVs und mEV-beladenen PVP-Fasern (PVP-mEVs). Freie mEVs und PVP-mEVs wurden durch Durchflusszytometrie basierend auf GFP-Signal, TritonX-100-Lyse, CD81 und Phosphatidylserin (AnnexinV)-Markern verglichen (A). Die mEVs wurden anhand der GFP-Fluoreszenz nachgewiesen, während Nanofasern mit sichtbarem Licht unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (B) nachgewiesen wurden. Das Vorhandensein und die Morphologie von mEVs wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (C) bestätigt. (AB: Antigenspezifische Färbung mit Antikörper, Tx: Triton X-100).

Das Vorhandensein von mEVs wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie nachgewiesen. In beiden Proben wurde ihr Vorhandensein anhand des Fluoreszenzsignals von GFP erfolgreich nachgewiesen. Bei PVP-mEV-Proben ist zu erkennen, dass mEVs in nanofaserassoziierter Form vorliegen (Abb. 3B). Die Morphologie freier mEVs und PVP-mEVs nach der Auflösung wurde durch TEM charakterisiert. Wir konnten mEVs in beiden Proben identifizieren (Abb. 3C).

Der beobachtete Unterschied zwischen den freien mEV- und den PVP-mEV-Proben kann durch die Tatsache erklärt werden, dass PVP über Wasserstoffbrückenbindungen an die Oberfläche von Nanopartikeln auf Lipidbasis binden kann29. Es bildet eine makromolekulare Schutzhülle, die Nanopartikeln Stabilität verleiht und vor Aggregation schützen kann30. PVP kann aufgrund seiner elektrischen Neutralität die Bindung von Proteinen an Liposomen reduzieren31. Da sich Liposomen und EVs in vielerlei Hinsicht ähnlich verhalten, gehen wir davon aus, dass sich um mEVs eine PVP-Hülle bilden kann. Aufgrund des Vorhandenseins der PVP-Hülle kann die Zugänglichkeit von CD81 und Phosphatidylserin für Antikörper und AnnexinV verringert werden. Da PVP die Stabilität von mEVs erhöht, weisen sie eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der TritonX-100-Lyse auf.

Die Stabilität von PVP-mEVs und freien mEVs, die bei 4 °C oder RT gehalten wurden, wurde 12 Wochen lang überwacht. Die Proben wurden alle zwei Wochen mit einem Durchflusszytometer basierend auf GFP-, Violet-SSC-, CD81-Parametern und Partikelanzahl analysiert. Die GFP-MFI- und Violet-SSC-Medianwerte der freien mEVs waren erhöht (Abb. 4A, B). Parallel dazu nahm der relative MFI von CD81 bereits in Woche 2 deutlich ab. Dieser Trend war bei Proben, die bei RT aufbewahrt wurden, stärker ausgeprägt (Abb. 4C). Unabhängig von der Temperatur nahm die berechnete Partikelzahl nach zwei Wochen ab und blieb während des gesamten Experiments niedrig (Abb. 4D). Die an PVP-Nanofasern gebundenen mEVs blieben 12 Wochen lang stabil, basierend auf dem Medianwert von Violet-SSC, GFP-MFI und Partikelanzahl (Abb. 4A, B, D). Der relative CD81-MFI der bei RT aufbewahrten Proben nahm nach 6 Wochen deutlich ab, während die Proben bei 4 °C stabil blieben (Abb. 4C). Der relative MFI-Wert der CD81-Isotyp-Kontrollen blieb während der Versuchsdauer niedrig (Abb. S2). Zusätzlich zu den Medianwerten haben wir auch den robusten Variationskoeffizienten (rCV) der Verteilungskurven ermittelt (Abb. S3). Bei den freien mEVs konnten wir bei allen drei Parametern einen leichten Anstieg feststellen. Im Fall von PVP-mEVs sahen wir einen zunehmenden Trend für den CD81-Marker in RT-Proben. Basierend auf der ähnlichen H-Brücken-Wechselwirkung, die innerhalb von PVP und der Oberfläche des Liposoms beschrieben wird, können PVP-Fasern eine makromolekulare Schutzhülle bilden, die Nanopartikeln Stabilität verleiht und vor Aggregation schützen kann (Abb. 4E). Darüber hinaus kann PVP aufgrund seiner elektrischen Neutralität die Bindung von Proteinen an Liposomen reduzieren. Da sich Liposomen und Elektrofahrzeuge in vielerlei Hinsicht ähnlich verhalten, gehen wir davon aus, dass sich um mittelgroße Elektrofahrzeuge eine PVP-Hülle bilden kann. Aufgrund des Vorhandenseins der PVP-Hülle kann die Zugänglichkeit von CD81 und Phosphatidylserin für Antikörper und AnnexinV verringert werden. Da PVP die Stabilität mittelgroßer Elektrofahrzeuge erhöht, sind diese weniger empfindlich gegenüber der TritonX-100-Lyse.

Stabilitätsuntersuchung von freien mEV und mEV-beladenen PVP-Fasern (PVP-mEVs) mittels Durchflusszytometrie. Die Stabilität freier mEVs und PVP-mEVs, die bei 4 °C oder RT gehalten wurden, wurde 12 Wochen lang alle zwei Wochen durch Durchflusszytometrie überwacht. Die Stabilität wurde anhand des membrangebundenen GFP-Signals von mEVs (A), des Violet-SSC-Parameters untersucht, der mit der Vesikelgröße (B), der CD81-Expression (C) und der Partikelanzahl (D) korreliert. Schematische Darstellungen des hypothetischen Mechanismus der beobachteten Veränderungen bei freien mEV- und PVP-mEV-Proben, die bei 4 °C aufbewahrt werden, sind in Panel (E) zusammengefasst. nmEV-GFP = 3, nViolet-SSC = 3, nCD81 = 3, nPartikelzahl = 2 (Abbildung wurde mit GraphPad Prism 7.00 für Windows, GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, USA, http://www.graphpad.com erstellt) .

Die Stabilität von PVP-mEV-Faserproben, die bei 4 °C oder RT aufbewahrt wurden, wurde 12 Wochen lang alle vier Wochen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop überwacht (Woche 0, 4, 8 und 12). PVP-Nanofasern wurden mit sichtbarem Licht nachgewiesen, während EVs durch ihre GFP-Fluoreszenz nachgewiesen wurden. In Abb. 5 ist deutlich zu erkennen, dass die faserige Struktur der Probe bis zum Ende der 12-wöchigen Lagerzeit sichtbar blieb, außerdem wurden unabhängig von der Temperatur (4 °C oder RT) Nanofasern und nanofaserassoziiertes GFP- Während des gesamten Experiments waren positive mEVs vorhanden.

Untersuchung der Stabilität mEV-beladener PVP-Fasern (PVP-mEV) mittels konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop. Die Stabilität von PVP-mEVs, die bei 4 °C oder RT gehalten wurden, wurde 12 Wochen lang alle vier Wochen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop überwacht.

Die vielversprechendste Lagerbedingung für Elektrofahrzeuge liegt bei −80 °C; Diese Bedingung kann jedoch durch Kosten- und Transportprobleme eingeschränkt sein. Eine alternative Technik zur Konservierung von Elektrofahrzeugen ist die Lyophilisierung, sie ist jedoch kostspielig und ihre Reproduzierbarkeit wirft Fragen auf. Elektrospinnen bietet eine gute alternative Lösung zur Verbesserung der Lagerstabilität von Vesikeln. Diese schnelle, kostengünstige, skalierbare Raumtemperaturtechnologie kann komplexe Nanofaserstrukturen bilden und eine Technologieplattform schaffen, was sie zu einem praktikablen Werkzeug für die Formulierung empfindlicher Medikamente macht. Die Einbettung von Elektrofahrzeugen in Nanofasern ermöglicht die stabilitätserhaltende Festphasenspeicherung von Vesikeln und eröffnet neue Horizonte in der Forschung für therapeutische Anwendungen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel [und seinen ergänzenden Informationsdateien] enthalten.

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Diese Forschung wurde vom Semmelweis Science and Innovation Fund (STIA-KF-2021) und dem National Cardiocular Laboratory Project, Ungarn, unterstützt. Das Projekt erhielt außerdem Mittel aus dem EU-Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 739593.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Krisztina Németh und Adrienn Kazsoki.

Abteilung für Genetik, Zell- und Immunbiologie, Semmelweis-Universität, Nagyvárad-Platz 4, Budapest, 1089, Ungarn

Krisztina Németh, Tamás Visnovitz & Edit I. Buzás

ELKH-SE Translational Extrazelluläre Vesikel-Forschungsgruppe, Budapest, Ungarn

Krisztina Németh & Edit I. Buzás

Universitätsapotheke, Abteilung für Pharmazieverwaltung, Semmelweis-Universität, Hőgyes-Endre-Straße 7-9, Budapest, 1092, Ungarn

Adrienn Kazsoki & Romana Zelkó

Abteilung für Pflanzenphysiologie und molekulare Pflanzenbiologie, Eötvös-Loránd-Universität, Pázmány Péter Sétány 1/C, Budapest, 1117, Ungarn

Tamás Visnovitz

Abteilung für Polymertechnik, Fakultät für Maschinenbau, Technische und Wirtschaftswissenschaftliche Universität Budapest, Műegyetem Rkp. 3, Budapest, 1111, Ungarn

Balázs Pinke & László Mészáros

ELKH-BME-Forschungsgruppe für Verbundstoffwissenschaft und -technologie, Technische Universität Rkp. 3, Budapest, 1111, Ungarn

László Mészáros

HCEMM-SU Extrazelluläre Vesikel-Forschungsgruppe, Budapest, Ungarn

Edith I. Buzas

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RZ und EIB – Konzeptualisierung, KN, AK, TV und BP – Methodik, KN, AK und LM – formale Analyse, Untersuchung – KN und AK, Schreiben, ursprüngliche Entwurfsvorbereitung – KN und AK; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten – EIB, RZ und LM, Visualisierung – AK und KN; Aufsicht – RZ, EIB

Korrespondenz mit Edit I. Buzás oder Romána Zelkó.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Németh, K., Kazsoki, A., Visnovitz, T. et al. Nanofaserbildung als vielversprechende Technologie zur Konservierung und einfachen Lagerung extrazellulärer Vesikel. Sci Rep 12, 22012 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25916-6

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Eingegangen: 27. September 2022

Angenommen: 07. Dezember 2022

Veröffentlicht: 20. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25916-6

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