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Nature Biotechnology (2023)Diesen Artikel zitieren

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Reine Bakterienkulturen bleiben für detaillierte experimentelle und mechanistische Studien in der Mikrobiomforschung unerlässlich, und herkömmliche Methoden zur Isolierung einzelner Bakterien aus komplexen mikrobiellen Ökosystemen sind arbeitsintensiv, schwer zu skalieren und weisen keine Phänotyp-Genotyp-Integration auf. Hier beschreiben wir eine Open-Source-Roboter-Stammisolationsplattform mit hohem Durchsatz für die schnelle Generierung von Isolaten nach Bedarf. Wir entwickeln einen maschinellen Lernansatz, der die Koloniemorphologie und Genomdaten nutzt, um die Vielfalt der isolierten Mikroben zu maximieren und eine gezielte Auswahl bestimmter Gattungen zu ermöglichen. Die Anwendung dieser Plattform auf Stuhlproben von 20 Menschen führt zu personalisierten Darmmikrobiom-Biobanken mit insgesamt 26.997 Isolaten, die mehr als 80 % aller vorkommenden Taxa darstellen. Die räumliche Analyse von mehr als 100.000 visuell erfassten Kolonien zeigt Kowachstumsmuster zwischen den Familien Ruminococcaceae, Bacteroidaceae, Coriobacteriaceae und Bifidobacteriaceae, die auf wichtige mikrobielle Wechselwirkungen schließen lassen. Eine vergleichende Analyse von 1.197 hochwertigen Genomen aus diesen Biobanken zeigt interessante intra- und zwischenmenschliche Stammentwicklung, Selektion und horizontalen Gentransfer. Dieser Rahmen für die Kulturomik sollte neue Forschungsbemühungen zur Systematisierung der Sammlung und quantitativen Analyse bildgebender Phänotypen mit hochauflösenden Genomdaten für viele neue Mikrobiomstudien ermöglichen.

Die Metagenomik bietet die Möglichkeit, die Zusammensetzung verschiedener mikrobieller Ökosysteme, von Bodengemeinschaften bis hin zum Darmmikrobiom, umfassend zu untersuchen. Dennoch müssen Mikroben isoliert und kultiviert werden, um ihre funktionellen Rollen im Lebensraum und die unzähligen zwischen den Arten ablaufenden Prozesse mechanistisch zu analysieren. Herkömmliche Anbaumethoden, die auf der zufälligen Kolonieernte mit roher Gewalt basieren, sind mühsam und arbeitsintensiv1,2,3,4. Auf serieller Verdünnung basierende Isolierungsmethoden mit 96 oder 384 Vertiefungen sind ressourcenintensiv und führen zur wiederholten Isolierung derselben dominanten Stämme aus der Population5. Mikrofluidische Systeme ermöglichen das Wachstum in Nanoliterreaktoren, aber klonale Isolate sind schwer zu extrahieren6,7. Angesichts der Tatsache, dass ein typisches Mikrobiom Hunderte bis Tausende einzigartiger Arten enthalten kann, die eine langschwänzige Häufigkeitsverteilung8 aufweisen (das heißt, nur wenige dominieren, während die meisten selten sind), bleibt die Erstellung umfassender Stammsammlungen mittels systematischer Kulturforschung eine wichtige und herausragende Herausforderung.

Mikroben können anhand ihrer unterschiedlichen Phänotypen unterschieden werden, sei es anhand ihrer Fähigkeit, in bestimmten Medien zu wachsen, oder anhand der Metaboliten, die sie produzieren9,10,11,12. Eine wachstumsbasierte Selektion kann die Isolierung seltener Arten verbessern, beispielsweise durch Wachstumsmedien, die verschiedene Nährstoffe oder Antibiotika enthalten1,2,13. Massenspektrometriespektren können zur Unterscheidung zwischen Spezies14,15 verwendet werden, der Ansatz erfordert jedoch einen geringen Durchsatz und erfordert eine manuelle Verarbeitung. Die durch Bildgebung aktivierte Zellsortierung wurde entwickelt, um eukaryotische Zellen auf der Grundlage mehrdimensionaler Bilder zu isolieren. Diese Methode erfordert jedoch eine hochentwickelte Instrumentierung und wurde für Bakterien nicht implementiert16. Mit den jüngsten Fortschritten in der künstlichen Intelligenz (KI) und Deep-Learning-Modellen, die darauf trainiert sind, nuancierte Merkmale in mehrdimensionalen Bildgebungs- und biologischen Daten zu erkennen17, ist maschinelles Lernen (ML) kombinierter phänotypischer und genomischer Datenströme bereit, die mikrobielle Kulturwissenschaft der nächsten Generation zu verändern.

Hier beschreiben wir eine ML-gesteuerte Plattform zur Isolierung und Genotypisierung von Roboterstämmen, die bei Bedarf die schnelle und Hochdurchsatzgenerierung von kultivierten Biobanken ermöglicht. Dieses System nutzt einen intelligenten bildbasierten Algorithmus, um die taxonomische Vielfalt der Kulturwissenschaften im Vergleich zu einer Zufallsauswahlmethode zu erhöhen. Wir haben den Nutzen dieses Systems demonstriert, indem wir anaerob personalisierte Isolat-Biobanken für 20 menschliche Teilnehmer erstellt haben, was insgesamt 26.997 Isolate mit 1.197 hochwertigen Entwurfsgenomen ergab, die 394 16S-Amplikonsequenzvarianten (ASVs) umfassen. Mithilfe der gepaarten genomischen und morphologischen Informationen für jedes Isolat haben wir ein ML-Modell trainiert, das die taxonomische Identität nur auf der Grundlage der Koloniemorphologie vorhersagen kann. Die Anwendung dieses ML-Modells führte zu einer Verbesserung der gezielten Isolierung der interessierenden Mikroben. Eine groß angelegte bildgebende Analyse aller auf Agarplatten gezüchteten Kolonien ergab interessante artspezifische Wachstumsmuster und Wechselwirkungen zwischen den Arten. Die Gesamtgenomanalyse aus personalisierten Biobanken deckte personenspezifische Stammvariationen und Signaturen des horizontalen Gentransfers (HGT) innerhalb der wichtigsten Darmstämme auf. Wir haben eine webbasierte Open-Access-Datenbank (http://microbial-culturomics.com/) weiterentwickelt, die durchsuchbare genotypische, morphologische und phänotypische Daten aller durch automatisierte Culturomik generierten Isolate als einzigartige und wachsende Community-Ressource für den Mikrobiombereich enthält.

Colony Picking ist eine klassische mikrobiologische Methode zur klonalen Isolierung von Bakterienstämmen. Das Koloniewachstum auf Platten hängt von vielen Faktoren ab, darunter der Zusammensetzung des Mediums (z. B. verfügbare Nährstoffe), den atmosphärischen Bedingungen (z. B. Sauerstoffgehalt), dem Vorhandensein hemmender Moleküle (z. B. Antibiotika), dem pH-Wert, der Luftfeuchtigkeit und den Auswirkungen anderer diffundierbarer Metaboliten, die aus nahegelegenen Kolonien stammen18,19,20. Auf der Grundlage stammspezifischer physiologischer Unterschiede werden unterschiedliche Koloniemorphologien beobachtet, die durch Zellform, Steifheit, Motilität und Wachstumskinetik sowie die Produktion pigmentierter Moleküle oder extrazellulärer Matrizen und Tenside beeinflusst werden9,10,11,12. Obwohl diese Koloniemerkmale leicht quantifizierbar sind, werden sie während der Kolonieisolierung selten dokumentiert. Daher ist die selektive Kolonieauswahl mithilfe visueller Merkmale im Allgemeinen qualitativ und nicht standardisiert, und die Ergebnisse können je nach Experiment und Experimentator erheblich variieren. Um diese Mängel zu beheben, haben wir eine Plattform namens Culturomics by Automated Microbiome Imaging and Isolation (CAMII) entwickelt, um Culturomics mit morphologischen und genotypischen Daten für die Kolonieisolierung und Funktionsanalyse zu systematisieren.

Die CAMII-Plattform besteht aus vier Schlüsselelementen (Abb. 1a), die wie folgt erläutert werden: (1) einem Bildgebungssystem, das Morphologiedaten von Kolonien und einen KI-gesteuerten Kolonieauswahlalgorithmus sammelt, (2) einem automatisierten Kolonieauswahlroboter für Hoch- Durchsatzisolierung und Anordnung von Isolaten, (3) eine kostengünstige Pipeline zur schnellen Generierung von Genomdaten für ausgewählte Isolate und (4) eine physische Isolat-Biobank und eine digitale Datenbank mit durchsuchbaren Informationen zu Koloniemorphologie, Phänotyp und Genotyp. Somit kann diese End-to-End-Culturomics-Plattform mit minimiertem manuellen Aufwand Isolatsammlungen aus verschiedenen Input-Mikrobiomen erstellen. Das gesamte Bildgebungs- und Isolationssystem besteht aus handelsüblichen Komponenten, die in einer anaeroben Kammer untergebracht sind und eine Echtzeitkontrolle von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Sauerstoffgehalt ermöglichen (Abb. 1b und Ergänzungstabelle 1). Der CAMII-Roboter hat einen Isolationsdurchsatz von 2.000 Kolonien pro Stunde und kann 12.000 Kolonien pro Durchlauf verarbeiten, was einer mehr als 20-mal höheren Kapazität und schneller als der manuellen Kolonieisolation durch eine Person entspricht. Um sicherzustellen, dass unsere Genomanalysekapazität mit dem Durchsatz der Roboterisolierung übereinstimmt, haben wir außerdem eine kostengünstige Hochdurchsatz-Sequenzierungspipeline entwickelt, die die Automatisierung der Flüssigkeitshandhabung nutzt, um Barcode-Bibliotheken für die 16S-rRNA-Sequenzierung oder die Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS; Methoden) zu generieren. Die Kosten pro Isolat in dieser Pipeline betragen 0,45 US-Dollar für die Kolonieisolierung und Vorbereitung genomischer DNA (gDNA), 0,46 US-Dollar für die 16S-rRNA-Sequenzierung und 6,37 US-Dollar für WGS bei einer Abdeckung von >60× auf einer Illumina HiSeq-Plattform, was wesentlich günstiger ist als kommerzielle Dienste ( Ergänzungstabelle 2).

a, Rahmen der phänotyp- und morphologiegesteuerten Stammisolierung und Datenerfassung des menschlichen Darmmikrobioms. Menschliche Stuhlproben wurden ausplattiert und unter Auswahl verschiedener Antibiotika kultiviert. Anschließend wurden morphologisch unterschiedliche Kolonien isoliert, in einer Biobank angelegt und durch nachgeschaltete Sequenzierung analysiert. b, Aufbau des automatisierten anaeroben mikrobiellen Isolations- und Kultivierungssystems CAMII. c, Illustration der morphologiegesteuerten Kolonieisolierung auf CAMII. Auf Platten gezüchtete Kolonien werden unter Durch- und Auflichtbeleuchtung abgebildet und einer Kontursegmentierung und Extraktion morphologischer Merkmale unterzogen. Die Daten werden mittels PCA analysiert, um die Gruppe der morphologisch vielfältigsten Kolonien zu identifizieren, die dann von einem integrierten Kolonie-Picker isoliert werden. d, Illustration der vielfältigen Koloniemorphologie auf Platten. Merkmale der Koloniegröße und -form wurden aus durchleuchteten Bildern extrahiert, und Merkmale der Koloniefarbe wurden aus auflichtbeleuchteten Bildern extrahiert. e, Stuhlproben H1t1 wurden mit sieben verschiedenen Antibiotika kultiviert, um ihre Fähigkeit, die einzigartigsten und vielfältigsten Bakterien zu produzieren, durch 16S-Analyse auf Familienebene zu bewerten. Ciprofloxacin, Trimethoprim und Vancomycin wurden für nachfolgende Kolonieisolierungen ausgewählt. f, Anzahl einzigartiger ASVs, die aus der phänotypgesteuerten Isolierung im Vergleich zur zufälligen Isolierung von drei menschlichen Stuhlproben H1t4, H5t1 und H6t1 erhalten wurden. Die Isolierung wurde von CAMII durchgeführt; Eine zufällige Isolierung wurde an einer zufälligen Teilmenge aller auf den Platten nachgewiesenen Kolonien durchgeführt, und eine phänotypgesteuerte Isolierung wurde an morphologisch ausgewählten Kolonien durch den Algorithmus durchgeführt (ergänzende Abbildung 1b). Der P-Wert wird durch einen zweiseitigen gepaarten t-Test für die Fläche unter der Kurve berechnet. Bänder auf den Kurven stellen die Standardabweichungen der Anzahl der vom Algorithmus erhaltenen eindeutigen ASVs dar.

Ein wichtiges Alleinstellungsmerkmal der CAMII-Plattform ist das Bildgebungssystem, das morphologische Daten von Bakterienkolonien sammelt und daraus lernt (Abb. 1c). Insbesondere werden durchleuchtete Bilder, die Höhe, Radius und Rundheit einer Kolonie zeigen, und durchleuchtete Bilder, die Farbe und komplexe morphologische Merkmale wie Falten zeigen, auf CAMII erfasst, um einen mehrdimensionalen und quantifizierbaren morphologischen Datensatz zu erhalten. Wir haben eine benutzerdefinierte Kolonieanalyse-Pipeline entwickelt, die Kolonien nach verschiedenen morphologischen Merkmalen segmentiert (Methoden; Ergänzungstabelle 3 und Ergänzungsabbildung 1). Fläche, Umfang und mittlerer Radius spiegeln die Koloniegröße wider, während Kreisförmigkeit, Konvexität und Trägheit die Kolonieform offenbaren. Pixelintensitäten und ihre Varianzen in den roten, grünen und blauen (RGB) Kanälen heben alle Dichteabstufungen und Farben in einer Kolonie hervor (Abb. 1d). Als nächstes kamen wir zu dem Schluss, dass morphologisch unterschiedliche Kolonien mit größerer Wahrscheinlichkeit phylogenetisch vielfältig sind, was zur Verbesserung der Kolonieisolierung genutzt werden könnte. Daher haben wir eine bildgesteuerte „Smart Picking“-Strategie entwickelt, um vielfältigere Isolate zu isolieren, indem wir Kolonien basierend auf erfassten Merkmalen in einen mehrdimensionalen euklidischen Raum einbetten und maximal entfernte Punkte in diesem Raum auswählen, die die morphologisch unterschiedlichsten Kolonien darstellen (ergänzende Abbildung 1; Methoden). Um die Vielfalt der Bakterien, die kultiviert und untersucht werden können, weiter zu erhöhen, verwendet CAMII auch verschiedene Antibiotika-Ergänzungsmittel, um die einzigartigsten und vielfältigsten Untergruppen von Mikroben anzureichern1,13 (ergänzende Abbildung 2a,b). Beispielsweise lösten in einer Probe eines gesunden menschlichen Darmmikrobioms (H1t1) drei Antibiotika (Ciprofloxacin, Cip; Trimethoprim, Tmp; Vancomycin, Van) mit unterschiedlichen Wirkmechanismen die deutlichsten Anreicherungskulturen aus (Abb. 1e und ergänzende Abb. 2c). .

Um die Kapazität und Genauigkeit der bildgebenden Kolonieisolierung systematisch zu bewerten, haben wir CAMII auf Darmmikrobiomproben von drei menschlichen Freiwilligen (H1t4, H5t1 und H6t1; Ergänzungstabelle 4) angewendet. Morphologische Daten aus plattierten Kolonien wurden mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) analysiert, um die informativsten visuellen Merkmale zu bewerten (Abb. 1c und ergänzende Abb. 1c; Methoden). Interessanterweise waren Koloniedichte und -größe die dominantesten Signaturen (Hauptkomponenten 1 bzw. 2), die zusammen 72, 0% der morphologischen Varianz ausmachten (ergänzende Abbildung 3). Anschließend haben wir mit dem CAMII-Roboter 6.144 Kolonien isoliert. Etwa die Hälfte davon wurde zufällig aus mGAM-Platten ausgewählt und die andere Hälfte mithilfe unserer bildgebungsgesteuerten „Smart Picking“-Strategie und Antibiotikaauswahl. Isolate wurden in 384 Vertiefungen gezüchtet und zur Identifizierung der Taxonomie einer 16S-rRNA-Sequenzierung unterzogen. Einzigartige 16S-V4-Sequenzen wurden dann in ASVs (100 % Identitäts-Cutoff) geclustert, die eine ungefähre Identität auf Artenebene liefern21. Bemerkenswerterweise ergab die auf phänotypischen Daten basierende Kolonieisolierung einen wesentlich vielfältigeren Satz von ASVs als die zufällige Isolierung für alle drei Mikrobiomproben (Abb. 1f). Um beispielsweise 30 einzigartige ASVs zu erhalten, müssen mit unserer bildgebenden selektiven Strategie nur 85 ± 11 Kolonien isoliert werden, im Vergleich zu 410 ± 218 Kolonien, die bei der Zufallsauswahl benötigt werden. Bemerkenswert ist, dass diese verbesserte Isolationseffizienz während der gesamten Kommissionierung beibehalten wurde, was darauf hindeutet, dass die Verwendung unserer Strategie in einem Bereich der gewünschten Isolationstiefe einen nachhaltigen Vorteil bietet (ergänzende Abbildung 4a) und die generierte Isolatsammlung die zugrunde liegende mikrobielle Inputvielfalt besser repräsentierte und war wesentlich gleichmäßiger in der Zusammensetzung, gemessen an Shannons Gleichberechtigung (ergänzende Abbildung 4b). Die phylogenetische Analyse der Isolate zeigte, dass die CAMII-optimierte Kolonieauswahl die Diversität der gewonnenen Mikroben erheblich verbesserte (ergänzende Abbildung 5). Dieser Vorteil wird besonders deutlich, wenn man bedenkt, dass es mit zunehmender Anzahl von Isolaten asymptotisch schwieriger wird, eindeutige ASVs zu finden. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass unser KI-gesteuertes, datengesteuertes Isolations-Framework in der CAMII-Plattform die Effizienz der Kulturforschung erheblich steigern und den Arbeitsaufwand für die Isolierung besonders seltener Arten verringern kann.

Während Mikrobiome verschiedener Menschen ähnliche Gruppen von Bakterienarten aufweisen können, sind die zu diesen Arten gehörenden Stämme für das Individuum sehr einzigartig und können über viele Jahre hinweg denselben Wirt kolonisieren22,23. Wir wollten den Nutzen von CAMII zur Erstellung personalisierter Darmisolatsammlungen für 20 gesunde Menschen demonstrieren (Ergänzungstabelle 4 und Ergänzungsabbildung 6a, b). Insgesamt wurden 102.071 Kolonien visuell analysiert und 26.997 Kolonien ausgewählt und durch 16S-rRNA-Sequenzierung taxonomisch identifiziert (Abb. 2a), was 394 einzigartige ASVs ergab, die eine breite Vielfalt an gesunden kommensalen Darmmikrobiomen abdecken (Abb. 2b, c und Ergänzungstabelle 5). ).

a, Statistiken von 20 personalisierten Darmisolat-Biobanken. b, Phylogenetischer Baum von 394 ASVs, die in dieser Studie von 26.997 Darmmikrobiom-Isolaten abgedeckt wurden. Der benachbarte Stammbaum der Phylogenie wurde auf der Grundlage von 16S-V4-Sequenzen erstellt. Die Zweigfarbe unterscheidet den Bakterienstamm und der äußere Kreis zeigt die Prävalenz isolierter ASVs in den 20 Biobanken. c, Anzahl der Isolate für die Top-20-Taxonomie auf Familienebene. d, Kumulierte relative Häufigkeit der ASVs, die durch Isolate aus personalisierten Biobanken in ursprünglichen Stuhlproben repräsentiert werden. Die Balken zeigen Isolate von jeder Person in der gesamten Sammlung und die roten Linien zeigen Isolate, die von derselben Person stammen. e, Heatmaps für die relative Häufigkeit reichlich vorhandener ASVs in ursprünglichen Stuhlproben und deren Vorhandensein oder Fehlen in den Biobanken. ASVs mit einer durchschnittlichen relativen Häufigkeit von > 0,1 % werden angezeigt und die Seitenleiste links stellt ihre Taxonomie auf Familienebene dar. In personalisierten Biobanken gefundene ASVs werden in der rechten Heatmap als schwarze Balken angezeigt und nicht kultivierte ASVs, die in keiner Biobank gefunden wurden, werden hervorgehoben. f, Korrelation der durchschnittlichen relativen Häufigkeit in der ursprünglichen Kotprobe und der Anzahl der Isolate in der gesamten Sammlung für ASVs. Besonders häufig vorkommende ASVs, die schwer zu kultivieren sind, d. h. mit weniger Isolaten, werden hervorgehoben. g: Durchschnittliche relative Häufigkeit der am häufigsten vorkommenden ASVs, jedoch mit nicht mehr als 2 Isolaten in der gesamten Sammlung. Die Farbe der Balken stellt die Taxonomie auf Familienebene dar.

Um die Vollständigkeit dieser Isolatsammlung zu beurteilen, haben wir die Häufigkeit isolierter ASVs in den entsprechenden Stuhlproben durch Bulk-16S-rRNA-Sequenzierung berechnet (Abb. 2d). Bemerkenswert ist, dass für jedes Individuum 80,9 ± 9,4 % der ASVs nach Häufigkeit mindestens einmal in der gesamten Isolatsammlung vertreten sind. Von jeder Person stammende Isolate machten im Durchschnitt 45,6 ± 21,6 % der gesamten bakteriellen ASV-Häufigkeit innerhalb dieser Person aus (Abb. 2d). Darüber hinaus zeigte der Vergleich von Isolatsammlungen und großen Kotproben, dass die meisten der häufig vorkommenden und weit verbreiteten ASVs mindestens einmal in der Sammlung isoliert werden (ergänzende Abbildung 6c – e). Darüber hinaus ahmt jede personalisierte Isolatsammlung die Hauptkotprobe mit vergleichbaren Mikrobiomprofilen und dem Shannon-Diversitätsindex nach (ergänzende Abbildung 6f, g).

Insgesamt haben wir die Verwendung von CAMII zum Aufbau einer tiefen Isolatsammlung aus dem menschlichen Darm demonstriert, die 26.997 Isolate aus 394 ASVs mit einem umfangreichen Satz verknüpfter morphologischer, phänotypischer, taxonomischer und WGS-Daten enthält. Um den Nutzen für die Forschungsgemeinschaft zu erhöhen, haben wir eine durchsuchbare Online-Ressource (http://microbial-culturomics.com) weiterentwickelt, in der alle CAMII-fähigen Biobankdaten, einschließlich Genomen, Phänotypen und Bildern, gespeichert sind. Wir gehen davon aus, dass dieses Portal weitere Genotyp-zu-Phänotyp-Analysen erleichtern und zu mehr gemeinsamen Isolatsammlungen aus anderen Umgebungen führen wird.

Frühere Studien haben beobachtet, dass es schwierig ist, viele Mikroben aus unterschiedlichen Umgebungen im Labor zu kultivieren24,25. Wir haben daher unsere systematisch generierten Isolat-Biobanken genutzt, um die Kultivierungsfähigkeit des menschlichen Darmmikrobioms zu bewerten und bakterielle ASVs zu identifizieren, die in unserem experimentellen Umfeld der Isolierung weiterhin widersprechen. In allen 20 personalisierten Isolatsammlungen haben wir festgestellt, ob in der Biobank reichlich ASVs in der gesamten Fäkalienmasse (durchschnittliche relative Häufigkeit > 0,1 %) gefunden werden. Bemerkenswerterweise gehörte ein erheblicher Teil der nicht kultivierten Darmbakterien zu den Familien Ruminococcaceae und Lachnospiraceae (Abb. 2e und Ergänzungstabelle 6), was zuvor auch als „nicht kultivierbar“ dokumentiert wurde24. Für jedes ASV haben wir die Anzahl der in unserer gesamten Isolatsammlung erzeugten Isolate mit ihrer durchschnittlichen Häufigkeit im Hauptkot verglichen (Abb. 2f), was offenbar positiv korreliert war. Dennoch haben wir eine Reihe reichlich vorhandener, aber schwer zu kultivierender Bakterien identifiziert, darunter Faecalibacterium ASV-58, Prevatella ASV-470 und ASV-324, Oscillibacter ASV-215 und Clostridium XlVa ASV-287 (Abb. 2g). Interessanterweise stimmte Faecalibacterium ASV-58, von dem wir ein Isolat erhielten und WGS durchführten, mit einer genomweiten durchschnittlichen Nukleotididentität (ANI) von >98 % mit dem Metagenom-assemblierten Genom (MAG) von Candidatus cibiobacter qucibialis überein. Von diesem Stamm in unserer Sammlung wurde zuvor berichtet, dass er die am häufigsten vorkommende unkultivierte Art im menschlichen Darm ist25 und bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) stark dezimiert ist, ebenso wie andere Faecalibacterium-Stämme26.

Darüber hinaus verglichen wir Isolate in unseren Biobanken mit der bestehenden Datenbank1,3,22,25 von WGS und identifizierten 11 weitere Arten, die in keiner Referenzsammlung (BIO-ML, CGR und HMP) kultiviert wurden, sondern nur mit MAGs im SGB assoziiert sind Sammlung (Ergänzungsabbildung 7 und Ergänzungstabelle 7). Beispielsweise haben wir neben Faecalibacterium ASV-58 eine weitere häufig vorkommende Art, Faecalibacterium sp., isoliert. ASV-76, das im Durchschnitt eine relative Häufigkeit von >3 % in der Hauptfäkaliensubstanz darstellt, was die Sammlung kultivierbarer Darmmikrobiome weiter erweitert. Zusammengenommen heben diese Ergebnisse kultivierte Isolate und die verbleibende fehlende Diversität basierend auf unseren aktuellen Medien- und Wachstumsbedingungen hervor und bieten Anweisungen für zukünftige Kulturforschungsbemühungen, die sich auf dieses Darmmikrobiom aus „dunkler Materie“ konzentrieren (Ergänzungstabelle 6).

Die gezielte Kultivierung von interessierenden Bakterien aus einer Mikrobiomprobe kann für mechanistische Studien von entscheidender Bedeutung sein. Leider fehlt uns die Fähigkeit, die meisten Bakterienarten selektiv und auf eine bestimmte Art und Weise zu kultivieren. Folglich ist das Auswählen einer großen Anzahl von Kolonien und das Vertrauen auf statistische Wahrscheinlichkeit die einzige praktische Lösung, um die gewünschten Bakterien zu erhalten. Diese Strategie ist jedoch oft zu ressourcenintensiv, da sie möglicherweise die manuelle Auswahl Tausender Kolonien erfordert. CAMII bietet eine ML-gesteuerte und automatisierte Methode zur Kolonieauswahl, die auf der Verknüpfung der taxonomischen Identität mit der Koloniemorphologie basiert und somit theoretisch die gezielte Isolierung verbessern könnte. Um dies zu testen, haben wir unsere Sammlung von Tiefdarm-Isolaten systematisch untersucht, um die Beziehung zwischen morphologischen und genotypischen Daten zu analysieren. Interessanterweise zeigten Kolonien verschiedener Gattungen unterschiedliche morphologische Muster (Abb. 3a, b). Beispielsweise sind Kolonien von Dorea, Bacteroides und Collinsella im Allgemeinen groß und dicht, weisen jedoch unterschiedliche Zirkularitäten auf (Collissella > Bacteroides > Dorea), was Unterschiede in ihren Wachstumseigenschaften widerspiegelt. Andererseits sind Kolonien von Faecalibacterium kleiner und schwächer, was mit unseren früheren Ergebnissen über ihre schlechte Kultivierbarkeit übereinstimmt. Darüber hinaus sind die Koloniemorphologien entsprechend ihrer Phylogenie signifikant geclustert (P = 0,008 nach PERMANOVA-Test in Abb. 3c). Beispielsweise liegen die meisten Clostridien-Gattungen durch morphologische Ordination näher beieinander (Abb. 3c). Daher können Koloniemorphologien eine beträchtliche Menge an Informationen enthalten, die mit taxonomischen Identitäten verknüpft werden könnten.

a, Heatmap der durchschnittlichen Z-Werte morphologischer Merkmale verschiedener Bakteriengattungen. Verschiedene Gattungen mit unterschiedlichen morphologischen Mustern wurden durch hierarchische Gruppierung in verschiedene Gruppen eingeteilt, und der farbige Punkt auf der rechten Seite stellt ihre Taxonomie auf Klassenebene dar. b, Beispiele für Koloniebilder. Durchlichtete Bilder befinden sich auf der linken Seite und durchleuchtete Bilder auf der rechten Seite. c, PCA-Ordination von Gattungen basierend auf ihren koloniemorphologischen Merkmalen. Farben geben die Taxonomie auf Klassenebene an. d, Leistung der Bakteriengattungsvorhersage basierend auf morphologischen Merkmalen durch einen zufälligen Waldklassifikator. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Isolate für jede Gattung an. Modelltraining und -bewertung wurden 20 Mal gebootstrappt und die Boxplots zeigen die Varianz der Leistung (n = 20). Die blaue Linie stellt die Leistung des Nullmodells dar. Definition von Boxplot-Elementen – Mittellinie, Median; Boxgrenzen, oberes und unteres 25. Quartil; Whiskers, 1,5× Interquartilabstand. e, Leistung der modellbasierten gezielten Isolierung. Die Balken stellen den Mittelwert der Vorhersagegenauigkeit anhand individueller Modelle dar, die 20 Mal gebootstrappt wurden, und Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen dar. Die P-Werte wurden durch einen zweiseitigen Student-t-Test auf Genauigkeiten von n = 20 zufällig initialisierten Modell-Bootstrappings berechnet.

Wir haben untersucht, ob die taxonomische Identität von Kolonien eindeutig vorhergesagt werden kann, indem nur ihre morphologischen Informationen auf den Platten berücksichtigt werden. Wir haben ein zufälliges Waldklassifizierungsmodell mithilfe von Morphologie- und Taxonomiedaten aus zufällig ausgewählten Teilmengen von Isolaten (70 % der Gesamtmenge; Methoden) trainiert. Die Modellleistung wurde an den verbleibenden 30 % der Isolate bewertet. Bemerkenswerterweise erreichte unser Modell eine Genauigkeit von ~70 % für die meisten Gattungen, deren Trainingsdatensatz mehr als 100 Isolate enthielt (Abb. 3d). Die Rückrufrate auf Gattungsebene schwankte stärker, was offene Möglichkeiten zur Verwendung ausgefeilterer Modelle zum Erlernen zusätzlicher einzigartiger Koloniemerkmale verdeutlicht27,28,29. Einige Gattungen wie Eggerthella wiesen eine hohe Präzision und Erinnerung auf, was darauf hindeutet, dass hochkonservierte und einzigartige Koloniemorphologien gezielt für taxonomische Vorhersagen genutzt werden könnten. Bei der Analyse von Isolaten desselben ASV stellten wir fest, dass die Koloniemorphologie bei Isolaten derselben Person stark konserviert war, zwischen Isolaten verschiedener Personen jedoch viel variabler war (ergänzende Abbildung 8). Angesichts der Tatsache, dass verschiedene Menschen in der Regel unterschiedliche Stämme derselben Art tragen, deuten unsere Ergebnisse auf ein hohes Maß an Variation auf Stammniveau in der Koloniemorphologie hin.

Um zu beurteilen, ob KI-informierte Koloniemerkmale die gezielte Isolierung von Mikroben verbessern können, haben wir als nächstes zufällige Waldmodelle auf unserer Biobank trainiert und isoliert Daten von drei verschiedenen Personen (H12, H13 und H14). Die Modelle wurden verwendet, um Kolonien von Bifidobacterium, Parabacteroides und Eggerthella aus neuen Platten vorherzusagen, die aus denselben Stuhlproben stammten, und die Kolonien wurden dann mit CAMII isoliert und 16S-rRNA sequenziert, um die taxonomische Identität zu bestätigen (Methoden). Bemerkenswert ist, dass das morphologiegesteuerte Pflücken die Isolationseffizienz für diese Zielgattungen im Durchschnitt um das Achtfache verbesserte (Abb. 3e), wodurch die Präzision des Pflückens deutlich erhöht wurde und die Notwendigkeit, viele Kolonien zu screenen, um die gewünschten Mikroben zu finden, verringert wurde. Diese Ergebnisse unterstreichen den Wert unserer Biobank-Datensätze, die den Phänotyp mit dem Genotyp verknüpfen und taxonomische Vorhersagen allein anhand visueller Koloniemerkmale zeigen, was die gezielte mikrobielle Isolierung erheblich verbessern kann.

Bakterienkolonien können das Wachstum ihrer Nachbarn durch Arteninteraktionen beeinflussen, z. B. indem sie um Nährstoffe konkurrieren oder sich mit essentiellen Metaboliten gegenseitig ernähren. Frühere Studien legen nahe, dass benachbarte Zellen die Größe von Kolonien auf vorhersehbare Weise entscheidend beeinflussen können19. Da CAMII das kinetische Wachstum von Kolonien kontinuierlich verfolgen kann, haben wir die Kowachstumszusammenhänge zwischen Darmisolaten auf Agarplatten systematisch untersucht. Eine Stuhlprobe (H1t5; Ergänzungstabelle 4) wurde täglich ausplattiert und abgebildet. Anschließend wurden alle Kolonien am 6. Tag isoliert und ihre taxonomischen Identitäten mit 16S-Sequenzierung bestimmt (Abb. 4a). Für jedes ASV korrelierte die kumulative Fläche der Kolonien auf Agarplatten mit ihrer Häufigkeit in der ursprünglichen Stuhlprobe (ergänzende Abbildung 9), was darauf hinweist, dass unsere In-vitro-Bedingungen das Wachstum im Allgemeinen im gleichen Maße wie im Darm förderten. Interessanterweise zeigten Kolonien der Gattung Faecalibacterium ein langsameres anfängliches Wachstum und begannen erst in Gegenwart anderer wachsender Kolonien in der Nähe zu entstehen (Abb. 4b; Methoden). Diese Beobachtung legt nahe, dass zwischen Faecalibacterium und anderen Arten kommensale oder wechselseitige Interaktionen eine Rolle spielen könnten.

a, Bilder einer Beispielplatte während 6 Tagen Wachstum und Kolonieidentitäten auf der Platte durch 16S-Sequenzierung. b, Anteil der nachweisbaren Kolonien zu verschiedenen Zeitpunkten im Vergleich zum 6. Tag für jede Gattung. Farben geben die Taxonomie auf Familienebene an. c, Korrelation der Koloniegröße und der Anzahl benachbarter Kolonien für zwei repräsentative ASVs. Eine vollständige Liste der Korrelationen finden Sie in der Ergänzungstabelle 8. P-Werte werden durch einen einseitigen Mann-Whitney-U-Test auf der Fläche von Kolonien mit nicht mehr als einer Kolonie in der Nähe oder nicht weniger als vier Kolonien in der Nähe berechnet (n = 101 gegenüber 82 für). ASV-6 und 17 gegenüber 9 für ASV-39). Definition der Boxplot-Elemente: Mittellinie: Median; Boxgrenzen: oberes und unteres 25. Quartil; Whiskers: 1,5× Interquartilabstand. d, Paarweise wachstumsfördernde und hemmende Netzwerke zwischen Gattungen. Gerichtete wachstumsfördernde Wirkungen werden durch rote scharfe Pfeile und gerichtete wachstumshemmende Wirkungen durch blaue stumpfe Pfeile dargestellt. Knoten stellen Bakteriengattungen dar und sind nach Familien gefärbt. Die Knotengrößen sind proportional zur Anzahl der in dieser Analyse verwendeten Isolate und die Kantenbreiten sind proportional zur Signifikanz der Wechselwirkungen.

Um die durch CAMII ermöglichten Arteninteraktionen systematischer zu untersuchen, haben wir die Daten zur Koloniemorphologie, zur taxonomischen Identität und zur Kolonienachbarschaft gemeinsam analysiert. Wir haben Morphologiedaten und physikalische Koordinaten von 102.071 visuell erfassten Kolonien (26.997 isoliert) gesammelt und beurteilt, ob das Wachstum einer Kolonie durch benachbarte Zellen beeinflusst wird. Überraschenderweise beobachteten wir eine Reihe interessanter Kowachstumsmuster, die möglicherweise Wechselwirkungen zwischen den Arten widerspiegeln (Ergänzungstabelle 8). Beispielsweise korreliert die Koloniegröße von Phocaeicola vulgatus ASV-6 negativ mit der Anzahl benachbarter Zellen, was mit dem Szenario übereinstimmt, dass es allgemeine negative Wechselwirkungen gibt, die durch Konkurrenz oder Antagonismus zwischen P. vulgatus und anderen Bakterien im Darm vermittelt werden30 (Abb. 4c). Andererseits wuchs bei Faecalibacterium prausnitzii ASV-39, einer der Arten, die mit einem langsameren anfänglichen Wachstum der Koloniekinetik verbunden sind (Abb. 4b), größere Kolonien mit mehr Nachbarn, was auf eine positive Arteninteraktion schließen lässt (Abb. 4c).

Als nächstes haben wir taxonomische Informationen zu benachbarten Kolonien einbezogen und untersucht, wie die Koloniegröße einer bestimmten Gattung durch andere Gattungen beeinflusst werden könnte. Kurz gesagt, haben wir für jedes Gattungspaar die Koloniegrößen einer Gattung mit der anderen in der Nachbarschaft vorhandenen Gattung ohne vorhandene Kolonien verglichen (Methoden). Bemerkenswerterweise identifizierten wir Isolate aus zwei Gattungen, Faecalibacterium und Clostridium IV, die zu größeren Größen heranwuchsen, wenn die Isolate in der Nähe von Bifidobacterium, Phocaeicola und Bacteroides waren (Abb. 4d). Es wurde berichtet, dass Faecalibacterium und Clostridium IV die wichtigsten Butyrat-produzierenden Bakterien im Darm sind und vom Kokulturwachstum mit Bifidobacterium- und Bacteroides-Arten profitieren könnten31,32,33, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt. Andererseits beobachteten wir, dass Phocaeicola-Isolate mit Faecalibacterium-Isolaten als Nachbarn kleiner sind (Abb. 4d), was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung mit dem gemeinsamen Wachstum möglicherweise nur für eine Seite von Vorteil ist. Darüber hinaus haben wir im Einklang mit unserer vorherigen Korrelationsanalyse, bei der die Anzahl benachbarter Isolate ohne Berücksichtigung der Identität der Nachbarn untersucht wurde, beobachtet, dass das Wachstum von Phocaeicola und Bacteroides durch mehrere andere Gattungen gehemmt werden könnte, was weitere Untersuchungen nahelegt, um den zugrunde liegenden Mechanismus dieser positiven Eigenschaften besser zu verstehen und negative Wechselwirkungen zwischen Darmmikrobiota. Zusammengenommen unterstreichen unsere Ergebnisse, dass CAMII Muster des gemeinsamen Wachstums von Kolonien aufdecken kann, die durch Wechselwirkungen zwischen den Arten gesteuert werden, was dabei helfen kann, wachstumsfördernde Mikroben und ihre diffusionsfähigen Metaboliten zu identifizieren, die das In-vitro-Wachstum anspruchsvoller Arten stimulieren.

Die Kartierung der genomweiten Diversität von Darmbakterien innerhalb eines Menschen auf Stammebene ist wichtig für das Verständnis der Dynamik der Darmbesiedlung und der Treiber der bakteriellen Selektion und Anpassung, die für jeden menschlichen Wirt spezifisch sind1,2,34. Ein wesentlicher Vorteil des CAMII-Systems ist die Möglichkeit, WGS für eine große Anzahl von Isolaten zu isolieren und durchzuführen, um die Untersuchung inter- und intrapersonaler genomischer Variationen zu unterstützen. Aus diesem Grund haben wir aus unserer 20-köpfigen Mikrobiom-Biobank Isolate ausgewählt, die die einzigartigsten und am weitesten verbreiteten ASVs abdecken, und eine WGS durchgeführt, die 1.197 hochwertige Entwurfsgenome ergab (ergänzende Abbildung 10 und ergänzende Tabelle 9). Genomassemblierungen wurden weiter analysiert, um die genaue Taxonomie der Isolate auf Artenebene zu bestimmen (Methoden).

Wir haben zunächst die zwischenmenschlichen genomischen Variationen auf Stammebene in unserer Isolatsammlung untersucht (Methoden). In Übereinstimmung mit früheren Berichten1,35 wiesen die meisten Isolate innerhalb derselben Personen nur sehr wenige genomische Variationen auf (d. h. weniger als 102 SNPs), während sich die Isolate zwischen Personen um 103–105 genomweite SNPs unterschieden (Abb. 5a). Interessanterweise wurde beobachtet, dass einige phylogenetisch unterschiedliche Isolate (d. h. mehr als 104 SNPs) derselben Art bei derselben Person koexistieren (Abb. 5a). Beispielsweise wurden zwei unterschiedliche Stämme von P. vulgatus aus dem H4-Individuum isoliert und zwei unterschiedliche Stämme von B. uniformis im H2-Individuum gefunden (ergänzende Abbildung 11).

a, Anzahl der genomweiten SNPs zwischen Isolaten desselben oder verschiedener Individuen für 14 Isolate-reiche Arten. Die Zahlen hinter dem Artnamen geben die Anzahl der interindividuellen (rot) und intraindividuellen (blau) Paare an. Definition der Boxplot-Elemente: Mittellinie: Median; Boxgrenzen: oberes und unteres 25. Quartil; Whiskers: 1,5× Interquartilabstand. b, Korrelation zwischen der Anzahl genomweiter SNPs und der relativen Häufigkeit in der ursprünglichen Stuhlprobe für Isolat-reiche Arten in einzelnen H1. Die Größe des Punkts stellt die Anzahl der in dieser Analyse verwendeten Isolate dar und die Farbe stellt den Anteil der SNPs dar, die nur in einem Genotyp vorhanden sind. c, Netzwerk von 2 kb + HGT-Frequenz basierend auf 409 Isolaten aus H1. Knoten stellen Bakterienarten dar und sind nach Familien gefärbt. Die Knotengrößen sind proportional zur Anzahl der Isolate in der H1-Sammlung und die Kantenopazität ist proportional zur HGT-Häufigkeit zwischen den beiden verbundenen Arten. Die Kantenfarbe stellt verschiedene Arten von HGT dar, d. h. Interphyla, Intraphyla und Interfamilie, oder Intrafamilien-HGT, und die Farbe der Knotenumrisse stellt die Gram-Färbung der Art dar.

Als nächstes versuchten wir, die Diversität auf Stammebene innerhalb einer einzelnen Person zu beurteilen, indem wir 408 Isolatgenome analysierten, die vom H1-Individuum stammten (ergänzende Abbildung 10; Methoden). Da davon auszugehen ist, dass zahlreiche Arten im Darm mehr Zellteilungen durchlaufen, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass sie möglicherweise mehr SNPs in ihren Genomen ansammeln, vorausgesetzt, die Dauer der Darmbesiedlung ist ungefähr gleich. Tatsächlich korreliert die Anzahl der genomweiten SNPs innerhalb jedes Taxons im Allgemeinen mit seiner Häufigkeit im ursprünglichen Mikrobiom (Abb. 5b). B. fragilis weist einen höheren Anteil (56,0 %) an Blatt-SNPs auf (d. h. sie sind nur in einem Genotyp vorhanden), während andere Arten viel geringere Anteile aufweisen, darunter P. goldsteinii (20,5 %), B. stercoris (22,4 %) und B. stercoris (22,4 %). . Xylanisolvens (25,6 %), was auf unterschiedliche Populationsengpässe und selektive Sweeps auf Artenebene hindeutet. Auf Genebene beobachteten wir auch Hinweise auf eine konvergente adaptive Evolution. Beispielsweise haben wir zwischen verschiedenen P. dorei-Isolatlinien zwei kodierende Varianten im Gen TodS identifiziert (ergänzende Abbildung 12), das einen Zweikomponenten-Kinasesensor kodiert, der den Toluolstoffwechsel in Bakterien reguliert. Toluol und andere aromatische Kohlenwasserstoffe kommen in Lebensmitteln vor und werden auch als industrielle Rohstoffe verwendet, die Lebensmittel kontaminieren und so die Evolution im Darm vorantreiben könnten37.

Ein weiterer wichtiger Treiber für die Entwicklung des Darmmikrobioms im menschlichen Körper ist HGT. Dementsprechend verwendeten wir alle im gesamten Genom sequenzierten H1-Isolate, um ein HGT-Netzwerk gemeinsamer DNA-Elemente mit einer Länge von mehr als 2 kb zu rekonstruieren (Methoden). In Übereinstimmung mit jüngsten Berichten 38, 39 beobachteten wir, dass HGT-Ereignisse stark mit der Phylogenie der Isolate verknüpft waren, d Ergänzungstabelle 10). Interessanterweise beobachteten wir, dass HGTs überwiegend zwischen Isolaten mit derselben Gram-Färbung angereichert waren, wobei gramnegative Arten häufigere HGTs aufwiesen als grampositive Arten (P = 0,0005 nach Pearsons Chi-Quadrat-Test). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit aktuellen Erkenntnissen39 und legt nahe, dass unterschiedliche Zellwandstrukturen bei HGTs eine wichtige Rolle spielen könnten. Bemerkenswerterweise wurden in unserem Datensatz auch HGTs zwischen grampositiven und -negativen Arten beobachtet, was zukünftige Studien dazu inspirierte, die Wirkung von Zellwandstrukturen auf HGTs zu untersuchen und diese HGT-Elemente in ein Mikrobiom-Bearbeitungstool zu integrieren. Um zu untersuchen, ob diese HGTs kürzlich aufgetreten sind, haben wir als Nächstes die mittlere HGT-Häufigkeit zwischen allen Artenpaaren berechnet (Methoden). Wir stellten die Hypothese auf, dass HGTs, wenn sie kürzlich zwischen zwei Arten auftraten, nur mit einem kleinen Anteil der Isolate assoziiert wären, was zu einer geringen Häufigkeit zwischen den Arten führen würde, während HGTs, wenn sie früher auftraten und Wachstumsvorteile boten, später angereichert und vertikal vererbt würden Erzeugung, was zu einer hohen Frequenz führt. Interessanterweise stellten wir fest, dass die meisten HGT-Elemente häufig in allen Isolaten vorhanden waren (71,5 % HGTs mit einer Häufigkeit von >50 %), insbesondere bei solchen innerhalb der Bacteroidaceae-Arten (Abb. 5c), was darauf hindeutet, dass sie in der fernen Vergangenheit auftraten und durch starke Selektion darin angereichert wurden die Darmumgebung.

Angesichts der hohen Prävalenz und Häufigkeit innerindividueller HGT haben wir als Nächstes die proteinkodierenden Sequenzen der am weitesten verbreiteten HGT-Elemente kommentiert, um ihre möglichen Funktionen zu untersuchen (Methoden). Interessanterweise identifizierten wir mehrere Antibiotikaresistenzgene (ARGs) mit unterschiedlichen Wirkmechanismen sowie Gene des Sekretionssystems (ergänzende Abbildung 13). Beispielsweise kommen die vier am weitesten verbreiteten HGT-Sequenzen überraschenderweise in mindestens 13 verschiedenen Arten von Bacteroidaceae, Porphyromonadaceae, Odoribacteraceae und Rikenellaceae vor und enthielten mehrere ARGs, darunter ribosomale Protektoren und Antibiotika-Effluxpumpen sowie Sekretionssysteme vom Typ III und Typ IV . Während ARGs und Sekretionssysteme, die über HGT geteilt werden, klare evolutionäre Vorteile mit sich bringen können, gab es bei verschiedenen Arten zahlreiche weit verbreitete Elemente mit Genen unbekannter Funktion (ergänzende Abbildung 13), was auf unerforschte Mechanismen hindeutet, die ihre langfristige Persistenz im Darm bestimmen . Zusammenfassend verdeutlichen diese Ergebnisse, dass Isolate innerhalb und zwischen Menschen über eine genomische Vielfalt verfügen, die mithilfe von CAMII-gestütztem Deep-Strain-Biobanking und Genomanalyse systematisch charakterisiert werden kann, um personenspezifische Kolonisierung, Anpassung und Ökologie des Darmmikrobioms zu untersuchen.

Die Stammisolierung aus dem Darmmikrobiom wurde in der Vergangenheit ad hoc durchgeführt, wobei wichtige phänotypische Merkmale unzureichend erfasst und zusammen mit den Genomdaten schlecht dokumentiert wurden. Hier haben wir die CAMII-Plattform beschrieben, um die Erstellung von Isolat-Biobanken durch die Nutzung von Automatisierung, maschinellem Sehen, überwachtem Lernen und Genomik zu industrialisieren. In Kombination mit der kostengünstigen 16S- und Gesamtgenomsequenzierung bilden die systematisch generierten phänotypischen und genomischen Daten aus der Pipeline eine reichhaltige Ressource für die Untersuchung der Morphologie, Diversität und Evolution mikrobieller Kolonien. Am Beispiel des Darmmikrobioms führte die CAMII-gestützte Isolierung zu umfangreichen Isolat-Biobanken von 20 gesunden Personen, die insgesamt mehr als 80 % aller vorhandenen Mikrobiota abdeckten. Diese Isolatsammlung deckt einen Großteil der mikrobiellen Vielfalt im gesunden Darm ab und ist eine der umfangreichsten personalisierten Isolat-Biobanken, die bisher beschrieben wurden. Mithilfe dieser Ressource haben wir gezeigt, dass eine quantitative Analyse der Koloniemorphologien die Taxonomie vorhersagen, die Isolierung gezielter Gattungen verbessern und potenzielle Wechselwirkungen zwischen Mikroben aufdecken kann. Die systematische Analyse genomischer Unterschiede zwischen Isolaten innerhalb und zwischen Menschen ergab interessante Muster der Populationsselektion, Anpassung und HGT.

Der Großteil der hier präsentierten Daten stützte sich auf ein gängiges mGAM-reiches Medium zur Stammisolierung und -charakterisierung im Kontext des menschlichen Darmmikrobioms. Die Erforschung alternativer Medienformulierungen, anderer Mikronährstoffe und Makronährstoffe sowie wirts- oder umweltbedingter biochemischer Störungen (z. B. Gallensäuren und xenobiotische Verbindungen) könnte zu Veränderungen der Morphologie und des Wachstumsprofils führen, die unerforschte Physiologien und Eigenschaften des Darmmikrobioms beeinflussen. Die aus CAMII-Datensätzen abgeleiteten Interaktionen zwischen den Arten könnten weiter genutzt werden, um die Treiber der Mikrobiomdynamik systematisch abzubilden. Wir gehen davon aus, dass diese Wechselwirkungen die Kultivierung des widerspenstigen Mikrobioms der „dunklen Materie“ erleichtern könnten, indem sie dabei helfen, unbekannte mikrobiell abgeleitete Moleküle zu identifizieren, die das in dieser und anderen Studien beobachtete kooperative Wachstum fördern.

Das CAMII-System verwendet im Handel erhältliche Standardkomponenten und Open-Source-Code, der von anderen Forschern problemlos repliziert werden kann (Liste der Komponenten finden Sie in der Ergänzungstabelle 1). Wir gehen davon aus, dass das durchsuchbare Online-Portal den Austausch standardisierter phänotypischer und genomischer Daten erleichtern wird, die im Laufe der Zeit wachsen werden. Die CAMII-Hardware könnte weiter ausgebaut werden, um massenspektrometrische Messungen zu integrieren, um zusätzliche Koloniecharakteristikprofile zu erhalten, die die Identifizierung von Arten und Metaboliten verbessern können. Die automatisierte Onboard-Mikroskopie könnte darüber hinaus orthogonale Datenströme einführen, um mikrobielle Zellen mit Mikrometerauflösung über verschiedene Spektralkanäle hinweg sichtbar zu machen. Verbesserte Bildverarbeitungs- und ML-Algorithmen könnten zu noch besseren Dehnungsvorhersagen führen und die Isolationsleistung verbessern.

Da einzelne Stämme die Handlungseinheit innerhalb einer komplexen Gemeinschaft darstellen, sind umfassendere Stammsammlungen erforderlich. Solche umfassenden Biobanken können verwendet werden, um einen ganzheitlicheren Kontext zu schaffen, der die Zusammensetzung, die Wechselwirkungen zwischen den Arten und die Stoffwechselkapazität der gesamten Gemeinschaft berücksichtigt, was die Untersuchung der Funktion, Dynamik und Stabilität des Mikrobioms verbessern wird. Über den menschlichen Darm hinaus kann CAMII für andere Mikrobiome nützlich sein, beispielsweise aus dem Boden, aus Gewässern oder aus der Landwirtschaft, einschließlich der weiteren Isolierung und Analyse von Phagen, Pilzen und Protozoen. Das Roboterautomatisierungssystem kann auch dazu beitragen, systematische Stammbibliotheken wie Arrayed-Transposon-Insertion-Knockout-Sammlungen42 oder funktionale Genom-Expressionsbibliotheken43 zu erstellen und das Screening nach handhabbaren mikrobiellen Chassis für die Gentechnik zu verbessern44.

Diese Studie wurde gemäß dem Protokoll AAAR0753 des Columbia University Medical Center Institutional Review Board genehmigt und durchgeführt. Von den Studienteilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

Von 20 gesunden menschlichen Spendern wurden frische Stuhlproben entnommen und innerhalb von 3 Stunden nach dem Stuhlgang verarbeitet. Kurz gesagt, der Kot wurde mit dem Commode Specimen Collection System (Fisher, 02-544-208) gesammelt. Eine umgedrehte sterile 200-µl-Pipettenspitze (Rainin, RT-L200F) wurde verwendet, um eine kleine Probe aus der Stuhlprobe zu entnehmen, die dann sofort in ein steriles Kryoröhrchen (Fisher, NC9347001) gegeben wurde. Die gesammelten Stuhlproben wurden dann in eine anaerobe Kammer (Coy Laboratory) überführt und in 5 ml vorreduziertem PBS durch gründliches Vortexen homogenisiert. Homogenisierte Proben wurden weiter durch einen 40-µ-Filter (Fisher, 22363547) geleitet, um Nahrungsreste zu entfernen, mit Glycerin (20 % Endkonzentration) in mehrere Kryoröhrchen aufgeteilt und zur Langzeitlagerung in einen Gefrierschrank mit –80 °C überführt.

Alle Darmmikrobiota wurden in Gifu Anaerobic Medium Broth, Modified (mGAM; HyServe, 05433) unter anaeroben Bedingungen (5 % H2, 10 % CO2 und 85 % N2) in einer anaeroben Kammer gezüchtet. Kurz gesagt, 1,5 % Agarplatten (Thermo Fisher Scientific, 242811) mit mGAM-Medium wurden mit einer peristaltischen Pumpe (New Era Pump Systems NE-9000) hergestellt und mit eindeutigen Barcodes beschriftet. Bei Platten, die mit Ciprofloxacin (10 µg ml-1), Trimethoprim (50 µg ml-1) oder Vancomycin (50 µg ml-1) ergänzt waren, wurden während der Plattenvorbereitung Antibiotika hinzugefügt. Alle Platten wurden dann in die anaerobe Kammer überführt und vor dem Plattieren etwa 24 Stunden lang vorreduziert. Gefrorene Stuhlproben wurden in der anaeroben Kammer aufgetaut und für jede Kultivierungsbedingung auf 103 KBE pro ml verdünnt. Optimale Verdünnungen wurden durch probenspezifische Reihenverdünnungsexperimente ermittelt. Anschließend wurden 200 Mikroliter verdünnter Stuhlproben auf die Platte gegeben und mit sterilen Glasperlen verteilt. Die Platten wurden in Ziploc-Beuteln versiegelt, um die Austrocknung zu reduzieren, und 5 Tage lang bei 37 °C für das Koloniewachstum inkubiert.

Die Stammbildgebung und -isolierung wurde mithilfe eines benutzerdefinierten automatisierten Bildgebungs- und Kolonieauswahlsystems (CAMII) durchgeführt. Nach 5 Tagen Wachstum wurden die Agarplatten automatisch auf dem CAMII-System abgebildet (Abb. 1c). Kurz gesagt, die Teller wurden zunächst auf einen Karussellstapler gelegt. Ein Roboterarmgreifer transportierte einzelne Platten an einem Barcode-Scanner vorbei zu einer beleuchteten Bildplattform auf dem Koloniepflücker, wo sie unter zwei Lichtbedingungen (Epi-Beleuchtung und Durchleuchtung) von der Hudson RapidPick-Steuerungssoftware abgebildet wurden. Die Plattenetiketten sind mit den aufgenommenen Bildern verknüpft und die bebilderten Platten wurden vom Roboterarm automatisch neu gestapelt. Nach Abschluss des Bildgebungsprozesses wurden die Platten in Ziploc-Beuteln versiegelt, um ein Austrocknen zu vermeiden, und ein benutzerdefiniertes Skript wurde verwendet, um verschiedene Kolonien zu segmentieren und morphologisch einzigartige Kolonien für die anschließende Entnahme anhand von Plattenbildern zu identifizieren (ergänzende Abbildung 1a). Zu den morphologischen Merkmalen gehören Fläche, Umfang, mittlerer Radius, Zirkularität, Konvexität, Trägheit sowie Mittelwert und Varianzen entlang des Graukanals (durchleuchtete Bilder) und RGB-Kanälen (auflichtbeleuchtete Bilder). Es werden auch Rohbilder aller Kolonien auf der Platte gesammelt.

Für die in dieser Studie durchgeführte Zufallsauswahl wurde vom Skript aus allen erkannten Kolonien eine zufällige Teilmenge einer bestimmten Anzahl von Kolonien generiert und die automatische Isolierung dieser Kolonien durchgeführt. Für die phänotypgesteuerte Auswahl wurden alle erkannten Kolonien zunächst einer optimierten Selektion auf der Grundlage ihrer Morphologie unterzogen und eine Teilmenge einer bestimmten Anzahl von Kolonien mit maximierter morphologischer Diversität wurde durch CAMII isoliert. Ein detaillierter Algorithmus zur optimierten Kolonieauswahl ist in der ergänzenden Abbildung 1b zu finden. Auf Skripte zur Analyse von Plattenbildern und Koloniemorphologien kann unter https://github.com/hym0405/CAMII zugegriffen werden.

Nach der Analyse der Plattenbilder und der Erstellung einer Liste der zu pflückenden Kolonien wurde ein ähnliches Roboterprotokoll ausgeführt, um diese Kolonien zu isolieren. Zuerst wurden die Platten zur Entnahme neu gestapelt und ein Mehrkanal-Medienspender wurde verwendet, um 50 µl mGAM-Flüssigmedium in jede Vertiefung von zwei mit Strichcode versehenen, sterilen optischen 384-Well-Platten (Thermo Fisher Scientific, 12-566-2; Duplikat „A“ und „A“ zu verteilen 'B'), die dann zum Koloniepicker verschoben wurden. Als nächstes wurde eine Agarplatte auf den Koloniepflücker übertragen und hitzesterilisierte Nadeln pflückten einzelne Kolonien in die duplizierten optischen Platten. Die Platten wurden automatisch ausgetauscht, wenn alle Zielkolonien gepickt (Agarplatte) oder alle Vertiefungen beimpft waren (optische Platte). Nach der Kolonieernte wurden die beimpften optischen Platten in einen Plattenverschließer (Brandel, 9795) überführt, versiegelt und erneut gestapelt. Anschließend wurden die optischen Platten zur Bakterienkultivierung etwa 5 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Nach dem Bakterienwachstum wurden die „A“-Platten einer nachgeschalteten gDNA-Extraktion unterzogen und 30 µl 40 % Glycerin in jede Vertiefung der „B“-Platten gegeben, die zur Langzeitlagerung auf –80 °C überführt wurden.

Um eine morphologieorientierte Kolonieauswahl zu erreichen, wurden die in der Rohbildverarbeitung extrahierten koloniemorphologischen Merkmale zentralisiert und auf Einheitsvarianz skaliert und dann durch PCA eingebettet. Ein optimierter Kolonieauswahlalgorithmus wurde außerdem auf eingebettete Merkmale angewendet, um eine Reihe von Kolonien mit der größten morphologischen Vielfalt zu durchsuchen (ergänzende Abbildung 1b).

Um zu bewerten, wie verschiedene ASVs auf nahe gelegene Kolonien reagieren (Abb. 4c), wurde die Anzahl der nahegelegenen Kolonien für Isolate auf Platten berechnet und das Paar „nahegelegene Kolonien“ als zwei Kolonien definiert, deren Abstand zwischen ihren X-Y-Koordinaten weniger als 30 Pixel und mehr beträgt die Summe ihrer Radien. Um mögliche Auswirkungen von Antibiotika auf die Koloniemorphologie zu vermeiden, wurden für die Morphologieanalyse nur Kolonien verwendet, die auf reinen mGAM-Platten gezüchtet wurden.

Um zu bewerten, wie das Wachstum einer bestimmten Gattung durch andere Gattungen beeinflusst werden könnte (Abb. 4d), haben wir zunächst wie oben beschrieben „nahe Kolonien“-Paare identifiziert und die Wachstumsauswirkungen von Gattung A auf Gattung B durch Vergleich quantifiziert Koloniegrößen der Gattung B mit in der Nachbarschaft vorhandener Gattung A, d Gattung A vorhanden bis durchschnittliche Koloniegröße ohne Kolonien in der Nähe, und die P-Werte wurden durch den Mann-Whitney-U-Test anhand der Größenverteilungen zwischen Gattung A in der Nachbarschaft und ohne Kolonien in der Nähe sowie der Falscherkennungsrate (FDR) berechnet ) Die Korrektur wurde mithilfe der Bonferroni-Holm-Methode durchgeführt. Um mögliche Auswirkungen von Antibiotika auf die Koloniemorphologie zu vermeiden, wurden für die Morphologieanalyse nur Kolonien verwendet, die auf reinen mGAM-Platten gezüchtet wurden.

Um zu testen, ob die Koloniemorphologie auf Platten zur Vorhersage der taxonomischen Identität beitragen kann, wurden Kolonien datenreicher Gattungen (>100 Isolate aus allen 20 Individuen) einem Modelltraining und -test unterzogen. Unter Berücksichtigung der potenziellen Auswirkungen von Antibiotika-Störungen und Nachbarkolonien wurde ein Multilabel-Random-Forest-Modell auf 70 % der Isolate trainiert, das anhand von 14 morphologischen Merkmalen der Kolonien, dem Antibiotika-Zustand und der Anzahl benachbarter Kolonien sowie der Leistung (Präzision und Erinnerung) zufällig beprobt wurde. des Modells wurde an den verbleibenden 30 % der Isolate ausgewertet. Der Vorgang des Modelltrainings und der Modellbewertung wurde 20-mal mit unterschiedlichen Randomisierungseinstellungen gebootstrappt, um Verzerrungen zu minimieren, und die Hintergrundleistung des Modells wurde mithilfe eines Nullmodells berechnet (Vorhersage basierend auf der Anzahl der Isolate). Um eine gezielte mikrobielle Isolierung durchzuführen, wurde ein Multilabel-Zufallswaldmodell auf Kolonien datenreicher Gattungen (> 15 Isolate desselben Individuums) der Individuen H12, H13 und H14 separat trainiert, wie oben beschrieben. Anschließend wurden die gleichen Stuhlproben ausplattiert und das Modell nach dem Bakterienwachstum auf die neuen Platten angewendet, um alle Kolonien auf den Platten zu screenen und Kolonien mit der angestrebten Taxonomie auf Gattungsebene vorherzusagen. Alle Kolonien der Platten wurden dann auf CAMII isoliert und einer 16S-V4-Sequenzierung unterzogen, um ihre Taxonomie zu identifizieren und die Leistung der gezielten Isolierung zu bewerten.

Um die Wachstumskinetik täglich zu überwachen, wurde die Stuhlprobe H1t5 auf reine mGAM-Platten ausplattiert und die Platten wurden jeden Tag während 6 Tagen des Wachstums bebildert. Die Kolonieerkennung und -segmentierung wurde anhand von Bildern durchgeführt, und die Merkmale der Koloniemorphologie an verschiedenen Tagen wurden anhand ihrer X-Y-Koordinaten abgeglichen (Abb. 4a). Alle Kolonien auf den Platten wurden dann am 6. Tag auf CAMII isoliert und einer Taxonomieidentifizierung durch 16S-rRNA-Sequenzierung unterzogen. Um das unterschiedliche anfängliche Wachstum von Gattungen zu quantifizieren, wurde die Anzahl der nachweisbaren Kolonien jeder Gattung an jedem Tag (verfolgt durch x-y-Koordinaten) auf ihre Gesamtzahl der Kolonien am Tag 6 normalisiert, um den Anteil der nachweisbaren Kolonien zu berechnen (Abb. 4b). an jedem Tag.

Die gDNA ausgewählter Isolate wurde im 384-Well-Format unter Verwendung eines auf Silikatkügelchen basierenden Protokolls extrahiert, das aus einer früheren Studie übernommen wurde45. Zunächst wurden 40 µl 0,1 mm Zirconia Silica-Kügelchen (Biospec, 11079101Z) und 120 µl Lyselösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 0,2 mM EDTA) in jede Vertiefung von 384-Well-Deep-Well-Platten (Thermo Fisher Scientific) gegeben , 07-202-505). Anschließend wurden 40 µl Kulturlösungen der Isolate in jede Vertiefung gegeben und die Platten 1 Minute lang bei 4.500 g zentrifugiert und mit einer Dichtungsmatte (Axygen, AM-384-DW-SQ) befestigt. Um eine Überhitzung während des Perlenschlagens zu vermeiden, wurden die Platten vor dem Schlagen 5 Sekunden lang gevortext und bei –20 °C 10 Minuten lang inkubiert. Dann wurden die Platten auf einem Perlenrührer (Biospec, 1001) befestigt und 5 Minuten lang einem Perlenklopfen unterzogen, gefolgt von einer 10-minütigen Abkühlperiode. Der Perlenschlagzyklus wurde einmal wiederholt und die Platten wurden 5 Minuten lang bei 4.500 g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu zerkleinern. Als nächstes wurden 10 µl Zelllysat auf eine 384-Well-PCR-Platte (Bio-Rad, HSP3801) übertragen und 2 µl Proteinase-K-Lösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 1 µg µl-1 Proteinase K (Lucigen, MPRK092)) hinzugefügt. ) wurde mit einer Formulatrix Mantis hinzugefügt. Abschließend wurde das Zelllysat einem Proteinase-K-Verdau auf einem Thermocycler (65 °C 30 min, 95 °C 30 min, 4 °C unendlich) unterzogen und zur Langzeitlagerung auf –20 °C überführt. Die gDNA-Extraktion für große Kotproben wurde nach dem gleichen Protokoll mit vergrößerten Reaktionsvolumina im 96-Well-Format durchgeführt.

Die 16S-Sequenzierung der V4-Region zur Identifizierung der Taxonomie von Isolaten wurde im 384-Well-Format unter Verwendung eines Satzes von Sequenzierungsprimern mit doppelter Indexierung durchgeführt. Kurz gesagt, barcodierte 16S-V4-Amplikonprimer wurden auf der Grundlage universeller 16S-V4-Primer entworfen und von Integrated DNA Technologies synthetisiert. Als nächstes wurde 1 µl jeder einzigartigen Kombination aus barcodiertem Vorwärtsprimer 16SV4f_5xx und Rückwärtsprimer 16SV4r_7xx mit Labcyte Echo auf eine 384-Well-PCR-Platte übertragen, um einzigartige, doppelt indizierte Primerplatten herzustellen. Dann wurden ca. 130 nl gDNA mit einem 384-Well-Pin-Replikator (Scinomix, SCI-6010.OS) auf eine Primerplatte übertragen und 2 µl NEBNext Q5 PCR-Mastermix (NEB, M0543L) wurden mit Formulatrix Mantis in jedes Well gegeben . Anschließend wurden die Proben einer 16S-V4-Amplifikation auf einem Thermocycler unterzogen (98 °C 30 s, 40 Zyklen: 98 °C 10 s, 55 °C 20 s, 65 °C 60 s; 65 °C 5 min; 4 °C). unendlich). Die resultierenden Amplikonbibliotheken wurden manuell gepoolt und einer Gelelektrophorese auf E-Gel EX Agarosegelen, 2 % (Thermo Fisher Scientific, G402002), unterzogen. Erwartete DNA-Banden (~390 bp) wurden aus dem Gel herausgeschnitten und mit dem Wizard SV Gel and PCR Cleanup System (Promega, A9282) extrahiert, wobei die Anweisungen des Herstellers zum Entfernen von PCR-Primern und Adapterdimeren befolgt wurden. Gelgereinigte Bibliotheken wurden mit dem Qubit dsDNA HS-Assay (Thermo Fisher Scientific, Q32851) quantifiziert und auf der Illumina MiSeq-Plattform (Reagenzienkits: v2 300 Zyklen, Paired-End-Modus) bei einer Beladungskonzentration von 8 pM mit 20 % PhiX-Spike-in sequenziert (Illumina, FC-110-3001) zusammen mit benutzerdefinierten Sequenzierungsprimern, die gemäß den Anweisungen des Herstellers in eine Miseq-Reagenzienkartusche (6 µl 100 µM Stammlösung; Vertiefung 12: 16SV4_read1, Vertiefung 13: 16SV4_index1, Vertiefung 14: 16SV4_read2) gegeben wurden. Die Sequenzen aller bei der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 11 aufgeführt. Die 16S-V4-Sequenzierung der Massenproben wurde unter Verwendung eines ähnlichen Protokolls mit vergrößerten Reaktionsvolumina im 96-Well-Format durchgeführt. Darüber hinaus wurde SYBR Green I (Endkonzentration: 0,2×; Thermo Fisher Scientific, S7563) zur PCR-Reaktion hinzugefügt und eine quantitative 16S V4-Amplifikation durchgeführt und während der Exponentialphase (typischerweise 13–17 Zyklen) gestoppt und die Reaktion vorangetrieben bis zum letzten Erweiterungsschritt.

Rohsequenzierungsablesungen des 16S V4-Amplikons wurden mit USEARCH v11.0.667 (Ref. 46) analysiert. Insbesondere wurden Paired-End-Lesevorgänge im Modus „-fastq_mergepairs“ mit der Standardeinstellung zusammengeführt. Zusammengeführte Lesevorgänge wurden dann einer Qualitätsfilterung im Modus „-fastq_filter“ mit der Option „-fastq_maxee 1.0 -fastq_minlen 240“ unterzogen, um nur Lesevorgänge mit weniger als einer erwarteten Fehlerbasis und mehr als 240 bp beizubehalten. Die verbleibenden Lesevorgänge wurden dedupliziert (-fastx_uniques) und in ASVs (-unoise3) mit 100 % Identität geclustert. Zusammengeführte Lesevorgänge wurden dann anhand von ASV-Sequenzen (-otutab) durchsucht, um eine ASV-Anzahltabelle zu erstellen. Die Taxonomie von ASVs wurde mithilfe des Ribosomal Database Project-Klassifikators v2.13 zugewiesen, der mit dem 16S-rRNA-Trainingssatz 18 trainiert wurde (Lit. 47). Die relative Häufigkeit von ASVs in Massenproben wird als Leseanzahl von ASVs normalisiert durch die Gesamtzahl der zugeordneten Lesevorgänge definiert.

Nach dem ASV-Clustering wurde die ASV-Anzahltabelle analysiert, um die folgenden Metriken für jedes Isolat zu berechnen: Gesamtzahl der Lesevorgänge, die ASVs mit der höchsten Lesezahl und Reinheit dieses ASV. Isolate mit unzureichenden Lesewerten oder schlechter Reinheit (Lesezahlen < 5 oder Reinheit < 0,5) wurden gefiltert und die Taxonomie der verbleibenden Isolate wurde als die ASVs mit der höchsten Lesezahl definiert. Um die Phylogenie der Isolate zu konstruieren, wurde ein Multisequenz-Alignment an ASV-Sequenzen der Isolate unter Verwendung von MUSCLE v5 (Ref. 48) durchgeführt und ausgerichtete ASV-Sequenzen wurden anschließend mit MEGA v11.0.11 (Ref. 49) analysiert, um den nachbarschaftlich verbundenen Baum mit zu berechnen Standardeinstellung für die Phylogenie-Rekonstruktion.

Dieselbe gDNA, die für die 16S-V4-Amplikonsequenzierung verwendet wurde, wurde einer Gesamtgenomsequenzierung für Isolate unterzogen. Paired-End-Bibliotheken wurden nach einem veröffentlichten Protokoll zur Vorbereitung kleiner Nextera-Bibliotheken50 erstellt und auf der Illumina Nextseq 500/550-Plattform (2 × 75 bp) und der HiSeq-Plattform (2 × 150 bp) sequenziert. Rohe Lesevorgänge wurden dann von Cutadapt v2.1 mit den folgenden Parametern verarbeitet: '--minimum-length 25:25 -u 10 -u -5 -U 10 -U -5 -q 15 --max-n 0 --pair -filter=any‘, um minderwertige Basen und Nextera-Adapter zu entfernen. Die Abdeckung betrug 1,42 ± 2,86 Millionen Paired-End-Reads pro Isolat und für einige Isolate wurde von SNPsaurus eine PacBio-Long-Read-Sequenzierung durchgeführt, um die Leistung der De-novo-Genomassemblierung zu verbessern.

Illumina-Reads, die die Qualitätsfilterung bestanden, und PacBio-Long-Reads wurden von Unicycler v0.4.4 (Ref. 51) mit der Standardeinstellung zum Generieren von Entwurfsgenomen von Isolaten zusammengestellt, und die Qualität und Taxonomie der Entwurfsgenome auf Artenebene wurden dann von QUAST v4.6.3 bewertet (Ref. 52), CheckM v1.0.13 (Ref. 53) und GTDB-Tk v0.2.2 (Ref. 54). Von allen 3.271 Isolat-Assemblies wurden 1.197 als hochwertige Entwurfsgenome definiert (Abdeckung > 20×; N50 > 5.000 bp; Vollständigkeit > 80 %; Kontamination < 5 %) und für die nachgelagerte genomische Variation und HGT-Analyse verwendet. Um die genomische Variation von Darmmikrobiota-Isolaten innerhalb und zwischen Individuen auf Stammebene zu identifizieren, wurden Entwurfsassemblys mit der höchsten Vollständigkeit und N50 jeder Art als Referenzgenome für die Ausrichtung der Lesevorgänge ausgewählt und verarbeitete Illumina-Messwerte der Isolate wurden mit den Referenzgenomen der Isolate abgeglichen gleiche Art von Bowtie2 v2.3.4 (Ref. 55) im Paired-End-Modus mit der Einstellung „--very-sensitive“. Die resultierenden Leseausrichtungen wurden dann von SAMtools v1.9 und BCFtools v1.9 (Ref. 56) mit der Einstellung „--ploidy 1“ verarbeitet, um genomische Variationen (SNPs und Indels) aufzurufen. Die resultierenden Variationen wurden dann einer Qualitätsfilterung unterzogen, um „zuverlässige“ Genotypen zu identifizieren (abgedeckt durch ≥5 Reads; mit ≥0,9 Haploidie) und nur SNP-Variationen mit mehr als 90 % „zuverlässigen“ Genotypen über alle Isolate hinweg wurden für die nachgelagerte Analyse verwendet. Um eine SNP-basierte Phylogenie zu erstellen, wurden Basisprofile von Isolaten an SNP-Standorten miteinander verkettet und der UPGMA-Baum wurde dann von MEGA v11.0.11 mit der Standardeinstellung berechnet.

Um in unserer Biobank isolierte Arten zu identifizieren, die zuvor nicht kultiviert wurden, wurde die durchschnittliche Nukleotididentität zwischen den in dieser Studie erhaltenen Entwurfsgenomen und MAGs oder isolierten Genomen aus öffentlich zugänglichen Datenbanken mit FastANI v1.0 (Ref. 57) und Genomen mit berechnet Bei >95 % der ANI wurde davon ausgegangen, dass es sich um die gleiche Art handelte.

Um HGT zu identifizieren, das zwischen Arten innerhalb von H1-Isolaten auftritt, haben wir alle Genompaare verschiedener Arten mit BLASTN v2.7.1 (Ref. 58) mit der Einstellung „-evalue 0.1 -perc_identity 99“ verglichen, um Blöcke von Genomregionen mit hoher Sequenzidentität systematisch zu screenen. Der P-Wert der HGT-Kandidaten wurde dann auf der Grundlage des genomweiten ANI zwischen Isolaten berechnet und durch das Benjamini-Hochberg-Verfahren weiter angepasst. Explosionstreffer mit einem angepassten P-Wert <1 × 10−5 und einer Länge von mehr als 2.000 bp wurden als HGT-Ereignisse zwischen Isolaten verschiedener Arten betrachtet. Die Häufigkeit von HGTs zwischen Arten wurde mithilfe einer zuvor veröffentlichten Methode quantifiziert39, 59, definiert als die Anzahl der Genompaare zwischen Arten, die mindestens ein HGT gemeinsam haben, geteilt durch die Gesamtzahl der Genompaare zwischen Arten. Um ARGs und Sekretionssysteme in HGT-Elementen zu kommentieren, wurden Sequenzen von HGT-Elementen von Prokka v1.12 (Ref. 60) im Metagenommodus annotiert und die resultierenden CDS wurden mit BLASTP v2.7.1 anhand der CARD-Datenbank v3.1.4 (Ref. 61) durchsucht um ARG-Treffer mit einem e-Wert <1 × 10−5, einer Identität >20 und einer Abfrageabdeckung >50 zu identifizieren. Sekretionssysteme wurden von EffectiveDB62 mit der Standardeinstellung auch auf CDS von HGT-Elementen vorhergesagt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Sequenzierungsdaten wurden an die NCBI BioProject-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/) unter der Zugangsnummer PRJNA745993 (Ref. 63) übermittelt. Weitere zugehörige Daten der Isolatsammlung, einschließlich morphologischer Merkmale und Rohbilder, können unter http://microbial-culturomics.com abgerufen werden. Die Taxonomie von ASVs wurde basierend auf dem 16S-rRNA-Trainingssatz 18 zugewiesen, der vom Ribosomal Database Project bereitgestellt wurde. Die Annotation von ARG-Genen und Sekretionssystemen in HGT-Elementen basierte auf der CARD-Datenbank v3.1.4 bzw. der EffectiveDB-Datenbank.

Auf die in dieser Studie zur Analyse von Plattenbildern verwendeten Skripte kann unter https://github.com/hym0405/CAMII ref zugegriffen werden. 64.

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Wir danken den Mitgliedern des Wang-Labors für ihre Ratschläge und Kommentare zum Manuskript. HHW erkennt die relevante Finanzierungsunterstützung aus dem NSF (MCB-2025515), NIH (1R01AI132403, 1R01DK118044 und 1R21AI146817), ONR (N00014-18-1-2237 und N00014-17-171717171717171717171717353), IRMOUGHS (N00014-18-12237 und NOV00014-17-17-17-17-17-171) an. T. Hirschl Trust und Schaefer Research Award. RUS wird durch ein Fannie and John Hertz Foundation Fellowship und ein NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1644869) unterstützt. TM wird vom NIH Medical Scientist Training Program (T32GM007367) unterstützt. MR und FV-C. werden durch NSF Graduate Research Fellowships (DGE-1644869) unterstützt. CR wird durch ein Junior Fellows-Stipendium der Simons Society of Fellows unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yiming Huang, Ravi U. Sheth.

Abteilung für Systembiologie, Columbia University, New York, NY, USA

Yiming Huang, Ravi U. Sheth, Shijie Zhao, Lucas A. Cohen, Kendall Dabaghi, Thomas Moody, Deirdre Ricaurte, Miles Richardson, Florence Velez-Cortes, Tomasz Blazejewski, Andrew Kaufman, Carlotta Ronda und Harris H. Wang

Abteilung für Biomedizinische Informatik, Columbia University, New York, NY, USA

Yiwei Sun

Abteilung für Pathologie und Zellbiologie, Columbia University, New York, NY, USA

Harris H. Wang

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YH, RUS und HHW entwickelten das ursprüngliche Konzept; YH, KD und TB entwickelten eine morphologiebasierte Kolonieauswahlsoftware; YH, RUS und LAC führten Experimente durch und analysierten Daten mit Input von HHW; TM, DR, YS, MR, FV-C., AK und CR unterstützten die Kolonieisolierung; YS und SZ unterstützten die Isolate WGS; YH, RUS, SZ und HHW haben das Manuskript geschrieben. Alle anderen Autoren diskutierten die Ergebnisse und genehmigten das Manuskript.

Korrespondenz mit Harris H. Wang.

HHW ist wissenschaftlicher Berater von SNIPR Biome, Kingdom Supercultures, Fitbiomics, Arranta Bio, VecX Biomedicines, Genus PLC und wissenschaftlicher Mitbegründer von Aclid, die alle nicht an der Studie beteiligt sind. RUS und KD sind Mitbegründer von Kingdom Supercultures. Alle anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Biotechnology dankt Peter Turnbaugh und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Abbildungen. 1–13.

Ergänzende Tabellen 1–11.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Huang, Y., Sheth, RU, Zhao, S. et al. Mikrobielle Kulturomik mit hohem Durchsatz mithilfe von Automatisierung und maschinellem Lernen. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01674-2

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Eingegangen: 12. August 2021

Angenommen: 11. Januar 2023

Veröffentlicht: 20. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-023-01674-2

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