Eine Reihe von Vektoren und Stämmen für die chromosomale Integration in Spalthefe

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9295 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Expression heterologer Gene ist eine wichtige Technik in der Hefegenetik. In Spalthefe wurden die Gene leu1 und ura4 hauptsächlich als selektierbare Marker für die heterologe Expression verwendet. Um das Repertoire an Selektionsmarkern für die heterologe Expression von Genen zu erweitern, haben wir hier neue Wirtsvektorsysteme unter Verwendung von lys1 und arg3 entwickelt. Mithilfe der Genombearbeitung mit dem CRISPR/Cas9-System isolierten wir mehrere Allele von lys1 und arg3, die jeweils eine kritische Mutation in der ORF-Region aufwiesen. Parallel dazu haben wir eine Reihe von Vektoren entwickelt, die die Aminosäureauxotrophie von lys1- und arg3-Mutanten ergänzen, wenn sie in jeden Locus integriert werden. Mithilfe dieser Vektoren in Kombination mit dem zuvor entwickelten Integrationsvektor pDUAL konnten wir erfolgreich die gleichzeitige Lokalisierung von drei Proteinen in einer Zelle beobachten, indem wir sie mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen fusionierten. Somit ermöglichen diese Vektoren die kombinatorische Expression heterologer Gene, was immer vielfältigere experimentelle Herausforderungen angeht.

Das Studium der Hefebiologie hat die Entwicklung anspruchsvoller experimenteller Systeme zur Aufklärung der molekularen Mechanismen angeregt, die einer Vielzahl biologischer Phänomene zugrunde liegen. Um diese molekularen Mechanismen tiefer zu erforschen, sind in letzter Zeit manchmal komplizierte experimentelle Systeme erforderlich. In vielen Fällen erfordert ein solch kompliziertes Experiment die Expression mehrerer Transgene in einer Zelle. Zu diesem Zweck wurden mehrere Vektoren, die als episomale Plasmide oder integrative Vektoren verwendet werden können, sowie konstitutive oder induzierbare Promotoren entwickelt1, 2. Expressionssysteme, die ähnliche Bedingungen wie physiologische Umgebungen reproduzieren können, werden bevorzugt. In diesem Sinne ist die Verwendung integrativer Vektoren anstelle episomaler Vektoren eines der modernsten Systeme, die in der Hefebiologie verwendet werden3.

Wir haben zuvor zwei Arten episomaler Vektoren entwickelt, die auch für die chromosomale Integration durch Single-Crossover-Rekombination4, 5 verwendet werden können. Ein Vektortyp ist für die Integration entweder in die Loci lys1, arg1 oder his3 konzipiert. Wenn diese Vektoren erfolgreich in die Zielorte integriert werden, werden die Transformanten für die entsprechenden Aminosäuren auxotroph. Der Vorteil dieser Vektoren besteht darin, dass sie für Stämme ohne Aminosäureauxotrophie verwendet werden können. Daher können diese Vektoren in vielen Fällen verwendet werden, ohne einen neuen Wirtsstamm vorzubereiten. Allerdings ist in manchen Fällen die Tatsache von Nachteil, dass es durch die Integration der Vektoren in das Genom zu einer Aminosäure-Auxotrophie kommt. Andererseits sind die Vektoren der pDUAL-Serie für die Integration in den leu1-Locus4 konzipiert. Obwohl sie nur für Stämme mit dem Leu1-32-Allel verwendet werden können, werden die Transformanten für Leucin prototroph, was eine einfache Selektion der Transformanten ermöglicht (Abb. 1). Die Tatsache, dass die pDUAL-Vektoren keine funktionelle Kopie des leu1-Gens enthalten, vermeidet die Selektion von Transformanten, bei denen Plasmide zufällig in das Genom integriert werden. Obwohl beide Arten von Vektoren ihre eigenen Vor- und Nachteile haben, scheinen Vektoren vom pDUAL-Typ im Hinblick auf die Auswahl und Aufrechterhaltung geeigneter Transformanten nützlicher zu sein.

Integration von pDUAL in das Genom der leu1-32-Mutante. Vektoren der pDUAL-Serie verfügen über einen Teil des leu1-Gens, der Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme innerhalb der leu1-ORF-Region enthält. Wenn eine einzelne Crossover-Rekombination stromabwärts des Mutationspunkts des leu1-32-Allels auftritt, wird erwartet, dass das resultierende Genom zwei Kopien von leu1 enthält, eine ohne den 3'-Teil und die andere ein funktionsfähiges Gen voller Länge. Der Schaltplan ist nicht maßstabsgetreu.

In diesem Artikel haben wir unter Berücksichtigung der Strategie der Einzel-Crossover-Rekombination vom pDUAL-Typ versucht, neue Wirt-Vektor-Systeme zu entwickeln, die auf andere Loci als leu1 abzielen. Mit dem kürzlich entwickelten CRISPR/Cas9-System in Spalthefe6 konnten wir erfolgreich Stämme mit kritischen Frameshift-Mutationen in lys1 oder arg37, 8 isolieren. Wir konstruierten auch Vektoren, die die Aminosäureauxotrophie dieser Mutanten durch gezielte Integration in das Chromosom ergänzen könnten. Zusammen mit den zuvor entwickelten pDUAL-Vektoren ist nun die Expression von drei Transgenen in prototrophen Transformanten ohne Verwendung arzneimittelresistenter Marker möglich.

Die in dieser Studie verwendeten S. pombe-Stämme wurden von den Wildtyp-Stämmen JY743 (h– leu1-32 ura4-D18) oder AM324 (h+ leu1-32) abgeleitet. Die genomische DNA von Wildtyp-JY3 (h90-Prototroph) wurde zur PCR-Amplifikation von Genfragmenten für die Plasmidkonstruktion verwendet. Für die Kultivierung von Transformanten wurden Vollmedium YE (0,5 % Hefeextrakt, 2 % Glucose, 5 µg/ml Adenin) und Minimalmedien SD und EMM29 verwendet. Bei Bedarf wurden Leucin, Arginin, Lysin, Histidin und Uracil in einer Endkonzentration von jeweils 50 µg/ml verwendet. EMM2 wurde auch zur Transkriptionsinduktion von mit fluoreszierenden Proteinen fusionierten ORFs unter der Regulierung des nmt1-Promotors10 verwendet.

Genetische Methoden zum Umgang mit Spalthefe wurden bereits beschrieben9. Die Transformation von S. pombe-Zellen wurde ebenfalls beschrieben11. Ura+-, Lys+- und Arg+-Transformanten wurden auf SD-Medium ohne Uracil, Lysin bzw. Arginin selektiert. Bei der Isolierung mutierter Allele von lys1, arg1 und his1 wurden Transformanten auf SD-Medium gezüchtet, das Leucin bzw. Lysin, Arginin oder Histidin enthielt.

Die Isolierung von Stämmen mit kritischen Mutationen in Genen, die an Aminosäurebiosynthesewegen beteiligt sind, wurde mit geringfügigen Modifikationen mithilfe des von Zhang et al.12 berichteten CRISPR/Cas9-Systems durchgeführt. Die Plasmide pDB4280 (Kat.-Nr. 98699) und pDB4282 (Kat.-Nr. 98701) für das Spalthefe-CRISPR/Cas9-System wurden aus dem Addgene-Repository bereitgestellt. Das Design von Single-Guided RNAs (sgRNAs) erfolgte mit dem webbasierten Tool CRISPR4P13. Unter den von diesem Programm vorgeschlagenen Zielstellen haben wir zwei Sequenzen für jedes Gen ausgewählt, die relativ nahe am 5'-Ende jedes ORF positioniert sind. Die Homologiearme wurden im Vergleich zu den von Zhang et al.12 angegebenen 40 nt auf 30 nt verkürzt. Die Sequenzen für das Annealing mit dem Matrizenvektor pDB4282 wurden auf 20 nt verkürzt, verglichen mit den von Zhang et al. angegebenen 23 nt. Die verwendeten Primersequenzen waren wie folgt: his1-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAACAAGTCCAGGTACCTGAGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), his1-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAAGGTGAGACAATGCGTGCATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), arg3-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATCATGATCTCTC CGGTGACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), arg3-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATCCATTCGTGATCTTAGTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), lys1-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATTTAGCCAAAGTGTGCGATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC) und lys1-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACC GAAGAAATCCTCGTTAGTCGCATGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC). Jeder Primer wurde in der PCR in Kombination mit dem ura4-P75-Primer (CATCTGGTGTGTACAAAATTG) verwendet, um die Region von pDB4282 zu amplifizieren, die einen Teil des ura4-Markers, der Hammerhead-Ribozymsequenz und der sgRNA-Gerüstsequenz enthält12. Die PCR-Reaktion wurde im 20-µl-Maßstab durchgeführt und die erfolgreiche Amplifikation wurde durch Agarosegelelektrophorese bestätigt. Das PCR-Produkt (2,5 µl) wurde zusammen mit dem mit NotI verdauten und durch Ethanolfällung gereinigten pDB4280-Plasmid direkt für die Transformation des Wirtsstamms JY743 verwendet. Zur Transformation wurde auch ein Mikrogramm Lachssperma-DNA verwendet. Transformanten wurden auf einer SD-Platte, die Leucin und entweder Histidin, Arginin enthielt, oder einer Platte zur Herstellung von Masterplatten gezüchtet. Die Aminosäureauxotrophie der Transformanten wurde dann bestätigt, indem man sie auf der SD-Platte ausstrich, der eine entsprechende Aminosäure fehlte.

Alle in dieser Studie verwendeten lys1- und arg3-Mutanten wurden zusammen mit Stämmen, die aus lys1-K24- oder arg3-R25-Mutanten durch genetische Kreuzungen mit ade6- und ura4-Mutanten gewonnen wurden, beim Yeast Genetic Resource Center (YGRC/NBRP) in Japan hinterlegt. Den Stämmen wurden die Zugangs-IDs FY47712-FY47734 zugewiesen.

Die Sequenzanalyse der Lysin-auxotrophen Allele wurde wie unten beschrieben durchgeführt. Die Region um die sgRNA-Zielstelle wurde durch PCR unter Verwendung des Genoms jedes Kandidaten amplifiziert. Zur Amplifikation der Region um die Zielstellen von lys1-sgRNA#1 und lys1-sgRNA#2 verwendete Primer waren lys1-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCTTGACACTCTCCGTTAC) und lys1-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCCACCGATAGGACCTGTAA). Die resultierenden PCR-Fragmente wurden mit der Gap-Repair-Klonierungstechnik14 in den Vektor pUC119 kloniert. Die gesamten Inserts wurden mit einem 3730xl DNA-Analysator (Applied Biosystems) sequenziert.

Auf ähnliche Weise wurde auch eine Sequenzanalyse für mutierte Allele von his1 und arg3 durchgeführt. Die verwendeten Primer waren wie folgt: arg3-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCGCAGTCTGAGAGAGAACTAG) und arg3-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCGTCTTTAGAAGCCTGTGTC) für arg3; und his1-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCTGCATAGAGGGTCGTTT) und his1-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCCGAGTGAATGCTGAGGA) für his1. PCR-Produkte wurden in den mit SmaI verdauten E. coli-Vektor pUC119 kloniert.

Um den Vektor pCLys1 zu konstruieren, ersetzten wir das leu1-Fragment von pDUAL, das den nmt1-Promotor4 enthält, durch einen Teil des lys1-Gens, das den lys1-Promotor und den 5'-Teil seines ORF enthält. Diese Region wurde durch PCR unter Verwendung der genomischen DNA des Wildtyp-S. pombe-Stamms JY3 amplifiziert. Die Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms für NotI wurde innerhalb dieser Region durch die Verkettung zweier PCR-Fragmente, die auf einer Seite die NotI-Stelle enthielten, durch PCR erzeugt. Die verwendeten Primer waren wie folgt: KpnI-Plys1-F3 (GGGATAACAGGGTAATATGGTACCGAGCTGTTTGGACATGTTATG) und NotI-lys1-R3 (AACTACATCAGCGGCCGCTCTCAATTCCATTCTTTACGAG); und NotI-lys1-F4 (GGAATTGAGAGCGGCCGCTGATGTAGTTATGGTTTATGC) und EcoRI-lys1-R4 (CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGTCAGCTCCTTTTGAGACTG). Die Klonierung des verketteten PCR-Fragments in den Vektor erfolgte mit dem In-Fusion HD Kit (TaKaRa Bio).

Die Konstruktion des pCArg3-Vektors wurde auf ähnliche Weise durchgeführt. Die verwendeten Primer waren wie folgt: KpnI-Parg3-F1 (GGGATAACAGGGTAATATACTAGTCGGTACCTGAGTTATCAATATAGTAACAC), NotI-arg3-R1 (AACGTTATTGCGGCCGCATCACCTACCCATGCAAC), NotI-arg3-F2 (GTAGGTGATGCGGCCGCAATAACGTTTTACATGATTTG) und EcoRI-arg3-R 2 (TGTAAAACGACGGCCA GTGAATTCAGCATTTTTAACAGCAACC).

Die vollständigen Sequenzen von pCLys1 und pCArg3 sind in der DDBJ-Datenbank mit den Zugangsnummern LC745737 bzw. LC745738 hinterlegt. Diese Plasmide wurden auch beim Yeast Genetic Resource Center of Japan mit den Zugangsnummern für FYP5995 (pCLys1) und FYP5996 (pCArg3) hinterlegt, sodass sie auf Anfrage erhältlich sind.

Die Konstruktion von pCLys1- und pCArg3-Vektoren, die GFP oder mCherry enthielten, wurde wie unten beschrieben abgeschlossen. Zunächst wurde der ORF von GFP oder mCherry jeweils in pCLys1 und pCArg3 kloniert. Die für die Amplifikation von GFP verwendeten Primer waren wie folgt: NheI-GFP-F (TTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCCTCGAGCCCGGGATGAGTAAAGGAGAAGAAC) und BamHI-GFP-R (GCTTATTTAGAAGTGGCGCGCCGGATCCCGGGTTTGTATAGTTCATCCATGCC). pDUAL-GFH14 wurde als Vorlage für die PCR verwendet. Ein GFP-Fragment wurde amplifiziert und dann mit pCLys1 oder pCArg3, verdaut mit NheI und BamHI, gemischt und die Mischung in kompetente Zellen des E. coli-Stammes DH5α eingeführt. Auf ähnliche Weise wurde auch mCherry in dieselben Vektoren geklont. Die für die Amplifikation von mCherry verwendeten Primer waren SmaI-mC-F (TTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCCTCGAGATGGTGAGCAAGGG) und SmaI-mC-R (ATTTAGAAGTGGCGCGCCGGATCCCGAGCTCGTCCATGCCGCCG). Das amplifizierte mCherry-Fragment wurde mit den mit SmaI verdauten Vektoren gemischt und anschließend in E. coli eingeführt.

Mit GFP oder mCherry zu fusionierende ORFs wurden durch PCR aus unserer Eingangsklonsammlung der Spalthefe ORFeome15 amplifiziert. Zur Amplifikation verwendete Primer waren Ent-GFP-R (CCTTTACTCATCCCGGGCTCGAGGCTAGCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTA) für die GFP-Fusion und Ent-mC-R2 (CGCCCTTGCTCACCATCTCGAGGCTAGCAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTG) für die mCherry-Fusion in Kombination mit 221_pREY_F (ACTTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCGATATCAAAAAAGC). AGGCTCTCATATG) als Partner der beiden oben genannten Primer. Jeder amplifizierte ORF wurde mittels Lückenreparaturtechniken in pCLys1 oder pCArg3 mit GFP oder mCherry kloniert. Die Klonierung eines ORF in den pDUAL-Vektor mit YFP (pDUAL-YFH1c) erfolgte mit der Gateway-Technologie.

Die Fluoreszenz von CFP, GFP, YFP und mCherry wurde mit dem All-in-One-Fluoreszenzmikroskop BZ-X700 (KEYENCE) beobachtet. Zum Einsatz kam das Objektiv CFI Plan Apo λ 100XH (Nikon). Die Zellen wurden auf einer YE- oder EMM2-Platte, die Thiamin enthielt, vorkultiviert und dann auf einer EMM2-Platte ausgestrichen, um die Expression von fluoreszierenden Protein-fusionierten Proteinen zu induzieren, die durch den nmt1-Promotor gesteuert wurden.

Um die chromosomale Single-Crossover-Integration vom pDUAL-Typ zu ermöglichen, werden Stämme mit einer Punktmutation in Genen benötigt, die vorzugsweise für Proteine ​​kodieren, die im Aminosäure- oder Nukleotid-Biosyntheseweg funktionieren. In der Spalthefe gibt es mehrere solcher auxotrophen Mutanten. Die Mutationspunkte der meisten von ihnen wurden jedoch nicht identifiziert oder sind aufgrund der Position nicht für eine integrationsvermittelte Komplementierung geeignet. Wir verwendeten daher das CRISPR/Cas9-System, um solche Mutanten des Biosynthesewegs zu isolieren, gemäß der klonierungsfreien Methode, die kürzlich von Zhang et al.12 beschrieben wurde.

Auf dem Gebiet der Spalthefegenetik werden leu1, ade6 und ura4 häufig als Selektionsmarker verwendet16,17,18. Das leu1-Gen befindet sich auf dem rechten Arm von Chromosom 2, während sich ade6 und ura4 auf Chromosom 3 befinden. Wir haben Integrationsorte von Chromosom 1 ausgewählt, um eine einfache Handhabung bei der genetischen Kreuzung zwischen neuen Markern und den oben genannten drei Loci zu ermöglichen. Als Ergebnis wählten wir drei Gene – lys1, arg3 und his119 – als Zielorte aus. Anschließend haben wir mithilfe des webbasierten sgRNA-Vorhersageprogramms CRISPR4P13 einfach gesteuerte RNA-Sequenzen entworfen, die auf den offenen Leserahmen dieser Gene abzielen. Unter den von CRISPR4P vorgeschlagenen sgRNA-Zielsequenzen haben wir zwei Sequenzen ausgewählt, die sich in der Nähe des Initiationscodons jedes ORF befinden, da sich ein Allel, in dem sich eine Punktmutation befindet, entweder in der Nähe des 5'- oder 3'-Endes eines ORF befindet Geeignet für die chromosomale Single-Crossover-Integration.

Wir führten PCR-Fragmente, einschließlich sgRNA-Zielsequenzen und eines Teils von ura4+, zusammen mit verdautem pDB4280, das Cas9 und den 5'-Teil von ura4+12 enthielt, in eine ura4-D18-Mutante JY743 ein. Nach dem Nachweis von Ura+-Transformanten überprüften wir die Aminosäureauxotrophie der Transformanten. Ähnlich wie bei his1 wurden viele Ura+-Transformanten sowohl aus der sgRNA #1- als auch aus der #2-Transformation erhalten. Allerdings zeigten nur wenige Stämme eine Aminosäure-Auxotrophie, was darauf hindeutet, dass diese sgRNAs nicht für die gezielte Ansteuerung jeder einzelnen Stelle geeignet waren. Das Gleiche galt für lys1-sgRNA-#1-Transformanten. Im Gegensatz dazu zeigten im Fall der lys1-sgRNA-#2-Transformanten viele Transformanten eine Aminosäureauxotrophie, trotz der geringeren Anzahl von Transformanten im Vergleich zu lys1-sgRNA-#1. Viele auxotrophe Transformanten wurden im Fall von arg3 auch aus zwei verschiedenen sgRNAs erhalten. Anschließend analysierten wir durch Sequenzierung nach PCR-Amplifikation der ORF-Region, ob und wo eine Mutation im Zielgen aufgetreten ist. Infolgedessen fanden wir mehrere Mutationen in lys1 und arg3, jedoch nicht in his1 (Abb. 2a, b). Es gab auch mehrere Arginin-auxotrophe Mutanten, die keine Mutationen in der ORF-Region von arg3 aufwiesen, ähnlich wie bei his1. Dies kann auf Off-Target-Effekte zurückzuführen sein, wie sie häufig beim CRISPR/Cas9-System diskutiert werden. Bei den meisten gefundenen Mutationen handelte es sich um Deletionen oder Insertionen einzelner Nukleotide, die alle nur in der Sequenz auftraten, die als sgRNA-Ziel verwendet wurde.

Mutationen auxotropher Mutanten, die in dieser Studie isoliert wurden. Alle Mutationen von (a) Lysin- und (b) Arginin-auxotrophen Mutanten wurden in den Regionen gefunden, auf die sgRNAs abzielen. Nukleotidsequenzen rund um die sgRNA-Zielsequenzen werden angezeigt und Aminosäuresequenzen werden unten im Kontext des Leserahmens angezeigt. Die Nummer des ersten Nukleotids jedes ORF ist auf 1 gesetzt. Die Zielsequenzen der sgRNA sind unterstrichen. Ein eingefügtes Nukleotid wird in Kleinbuchstaben angezeigt. Ein Bindestrich weist auf ein gelöschtes Nukleotid hin. Ein Sternchen zeigt ein Terminationscodon an. Aminosäureänderungen gegenüber der Standardsequenz sind kursiv dargestellt. (c) Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des arg3-R25-Allels. Die eingefügte Nukleotidsequenz ist fett dargestellt. Die erwartete Aminosäuresequenz des vom arg3-R25-Allel exprimierten Proteins ist unterhalb der Nukleotidsequenz dargestellt.

Unter diesen Mutanten enthält das arg3-R25-Allel ein Insert von 262 Nukleotiden (Abb. 2c). In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis wurde durch PCR-Amplifikation dieses Locus ein längeres Produkt erhalten, wenn das Genom des arg3-R25-Stammes als Matrize verwendet wurde. Eine BLASTN-Suche dieser Sequenz ergab eine vollständige Übereinstimmung mit einem Teil des Genoms von Oncorhynchus tshawytscha, bekannt als Chinook-Lachs oder Königslachs. Dieses Ergebnis deutet stark darauf hin, dass die 262-bp-Sequenz von der Lachssperma-DNA stammt, die bei der Transformation von Hefezellen verwendet wurde, wie bereits berichtet20. Obwohl die von uns verwendete Lachssperma-DNA von der Lachsart Oncorhynchus keta stammte, konnten wir im verfügbaren O. keta-Datensatz keine Sequenz finden, die mit der 262-bp-Sequenz übereinstimmt. Daher haben wir diese Sequenz in der DDBJ-Datenbank als Teil des O.-keta-Genoms registriert (Zugangsnummer LC764838). Da die Einfügung eines langen Fragments für die chromosomale Integration eines Plasmids von Vorteil war, um eine auf der Genumwandlung basierende Komplementierung einer Mutation zu vermeiden21, haben wir das arg3-R25-Allel ausgewählt, das als Ziel für den Integrationsvektor dient. Im Fall von lys1 haben wir das Allel lys1-K24 ausgewählt, das eine Deletion von Adenin am 268. Nukleotid vom Anfang des lys1-ORFs aufweist, was zur Erzeugung eines Terminationscodons direkt stromabwärts dieser Mutationsstelle führt (Abb. 2a). .

Parallel zur Mutantenisolierung haben wir Vektoren für die chromosomale Integration entworfen und konstruiert. Für die Konstruktion eines Vektors namens pCLys1 (Abb. 3a), der in den lys1-Locus integriert werden kann, haben wir die genomische Region, die den Promotor und den 5'-Teil des lys1-ORF enthält, amplifiziert und die leu1-Region des pDUAL-Vektors durch diese ersetzt. Es wurde erwartet, dass das klonierte lys1-Fragment nicht funktionsfähig ist, da nur weniger als 30 % des lys1-ORF geklont wurden. Dieses kurze lys1-Fragment wurde zunächst durch PCR aus dem Wildtyp-Genom in zwei Teilen amplifiziert und dann mit einer NotI-Erkennungsstelle dazwischen fusioniert. Somit konnte das klonierte Teilgen in der ORF-Region durch NotI-Verdau in zwei Teile gespalten werden. Die NotI-Stelle wurde etwa 700 bp stromabwärts des Mutationspunkts des lys1-K24-Allels erstellt. Wenn der durch NotI-Verdau linearisierte pCLys1-Vektor in den lys1-Locus mit der lys1-K24-Mutation integriert wird, würde ein funktionelles lys1-Gen erzeugt, und es wird erwartet, dass die Transformanten Lysin-prototroph sind (Abb. 4a).

In dieser Studie entwickelte Vektoren. Struktur von pCLys1 (a) und pCArg3 (b). Der Selektionsmarker besteht aus dem Promotor und einem Teil des ORF von entweder lys1 (pCLys1) oder arg3 (pCArg3). Beide Vektoren verfügen über den nmt1-Promotor und den ADH1-Terminator für die heterologe Genexpression. Multiklonierungsstellen enthalten Erkennungssequenzen für NheI, XhoI, SmaI, BamHI und AscI. Eine Pfeilspitze zeigt die NotI-Stelle zur Linearisierung der Plasmide an. Der Schaltplan ist nicht maßstabsgetreu.

Ein konzeptionelles Diagramm, das die Integration von Vektoren in das Genom zusammenfasst. Gezeigt wird die Integration von pCLys1 (a) und pCArg3 (b) in das Chromosom. Ein Sternchen gibt den Mutationspunkt des lys1-K24-Allels an. Ein Kästchen mit diagonalen Linien zeigt ein 262-bp-Fragment an, das in den ORF von arg3 eingefügt wurde. Die Länge des Vektor-Backbones ist nicht maßstabsgetreu.

Durch einen ähnlichen Prozess haben wir auch den pCARg3-Vektor für die Integration in den arg3-Locus konstruiert (Abb. 3b). Wie bei lys1 wurde erwartet, dass das in den pCArg3-Vektor klonierte partielle arg3-Fragment nicht funktionsfähig ist, da sich das Ende des klonierten Fragments immer noch stromaufwärts der Mutationspunkte in den Allelen befand, die durch arg3 sgRNA #1-Transformation erhalten wurden.

Anschließend untersuchten wir, ob die neu entwickelten Vektoren wie erwartet in die Zielorte integriert werden konnten (Abb. 4a, b). Wenn Stämme mit den Allelen lys1-K24 oder arg3-R25 mit pCLys1 bzw. pCArg3 transformiert werden, würden prototrophe Transformanten erhalten. Wir haben diese Plasmide vor der Transformation der Hefezellen mit NotI linearisiert. Als Kontrolle haben wir die Plasmide direkt in die auxotrophen Mutanten eingeführt, um zu untersuchen, ob eine Linearisierung für die Integration erforderlich ist oder nicht.

Nach der Einführung von Plasmiden oder deren verdauten Fragmenten in auxotrophe Mutanten traten große Kolonien nur bei den Stämmen auf, die mit verdauten Fragmenten sowohl für lys1-K24 als auch für arg3-R25 transformiert wurden (Abb. 5a). Obwohl aus den mit unverdauten Plasmiden transformierten Stämmen winzige Kolonien entstanden, vergrößerten sich diese nicht. Um zu sehen, ob ein bestimmtes Gen mit den in dieser Studie entwickelten Vektoren exprimiert werden kann, haben wir stellvertretend einen ORF, der für grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, in pCLys1 und pCArg3 geklont. Wir haben diese Plasmide in das Chromosom integriert und einige Transformanten ohne Aminosäureauxotrophie aufgenommen. Als wir die GFP-Fluoreszenz nach dem Ausstreichen von Transformanten auf einer EMM2-Platte überprüften, beobachteten wir Signale, die sich in den Zellen verteilten und sich leicht im Zellkern anhäuften, was mit der Lokalisierung freier GFP-Proteine ​​in Spalthefe übereinstimmt (Abb. 5b)22. Um zu bestätigen, dass verdaute Fragmente erfolgreich in die Zielorte integriert wurden, untersuchten wir die Genomstruktur der prototrophen Transformanten mittels Kolonie-PCR. Diese Analyse zeigte, dass alle von pCLys1-GFP oder pCArg3-GFP abgeleiteten Fragmente erwartungsgemäß nur dann in jeden Zielort integriert wurden, wenn GFP-Fluoreszenz nachgewiesen wurde (Abb. 5c).

Einführung neu entwickelter Vektoren zur heterologen Genexpression. (a) Transformanten, die nach Einführung der in dieser Studie entwickelten linearisierten Plasmide entstanden. Die Stämme AM595 (h– leu1-32 lys1-K24) und AM597 (h– leu1-32 arg3-R25) wurden entweder mit pCLys1 oder pCArg3 mit oder ohne NotI-Vorbehandlung transformiert und auf SD-Selektionsmedium ohne Lysin und Arginin ausplattiert. (b) Expression von GFP, eingeführt mit pCLys1 und pCArg3. Transformanten, die nach Einführung von linearisiertem pCLys1-GFP und pCArg3-GFP in die Stämme lys1-K24 oder arg3-R25 entstanden, wurden nachgewiesen und die GFP-Fluoreszenz wurde unter Fluoreszenzmikroskopie überwacht. (c) Bestätigung der chromosomalen Integration durch PCR. Die Integration von pCLys1-GFP oder pCArg3-GFP in das Chromosom wurde durch PCR unter Verwendung der durch Pfeilspitzen angezeigten Primer analysiert. Die Transformanten Nr. 1 und Nr. 2 waren Stämme, bei denen GFP-Fluoreszenz beobachtet wurde, wohingegen Transformant Nr. 3 keine Fluoreszenz aufwies. Als Größenmarker wurde mit EcoT14I verdaute Lambda-DNA verwendet. (d) Gleichzeitige Expression von drei Proteinen in einer Zelle. Mit pCLys1, pCArg3 und pDUAL transformierte Zellen, die uvi15-CFP, gpi16-YFP bzw. gar2-mCherry exprimierten, wurden unter Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Maßstabsbalken zeigen 10 μm an.

Abschließend untersuchten wir, ob mit den in dieser Studie entwickelten Vektoren in Kombination mit dem zuvor entwickelten pDUAL-Vektor drei Gene gleichzeitig exprimiert werden können. Um ihre Expression nachzuweisen, verwendeten wir drei fluoreszierende Proteine, CFP, YFP und mCherry. Aus unserem Lokalisierungsdatenarchiv haben wir mehrere Proteine ​​identifiziert, die eine klare subzelluläre Lokalisierung zeigen15. Wir haben das nukleoläre Protein Gar2, das ER-Protein Gpi16 und Uvi15 ausgewählt, das an Zellspitzen und Septen lokalisiert ist, und ihre ORFs stromaufwärts von CFP (pCLys1), YFP (pDUAL) bzw. mCherry (pCArg3) kloniert. Diese Fusionsgene wurden unter der Kontrolle des nmt1-Promotors exprimiert. Wir integrierten diese Plasmide nacheinander in das Chromosom eines Stammes mit den Allelen arg3-R25, lys1-K24 und leu1-32 und nahmen einige Transformanten auf, die keine Aminosäureauxotrophie zeigten. Wir haben auch versucht, Zellen mit allen drei Plasmidfragmenten zu transformieren. Unter diesen Bedingungen konnten wir jedoch keine Transformanten erhalten. Selbst wenn zwei der drei Plasmide verwendet wurden, war die Anzahl der erhaltenen Transformanten nahezu vernachlässigbar. Als wir die Fluoreszenz überprüften, nachdem wir Transformanten auf einer EMM2-Platte kultiviert hatten, um den nmt1-Promotor zu aktivieren, beobachteten wir klare Signale von allen Fusionsproteinen (Abb. 5d). Wie erwartet zeigte Uvi15 eine konstante Lokalisierung an Zellspitzen oder Septen, während Gpi16 an ER-ähnlichen Membranstrukturen sichtbar gemacht wurde. In einem bestimmten Kompartiment im Zellkern wurde ein starkes Signal des Kernproteins Gar2 beobachtet. Damit haben wir gezeigt, dass die Einführung und Expression von drei verschiedenen Transgenen mithilfe der neu entwickelten Integrationsvektoren möglich ist.

Wir haben zwei Sätze von Spalthefe-Wirt-Vektor-Systemen entwickelt, die für die heterologe Expression von Genen aus den Loci lys1 oder arg3 verwendet werden können. Mithilfe dieser Vektoren haben wir gezeigt, dass entwickelte Vektoren ordnungsgemäß in die Zielorte integriert wurden, was zur Erzeugung prototropher Transformanten führte. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass in die Vektoren kloniertes GFP nach der chromosomalen Integration wie erwartet exprimiert wurde. Diese Art der Integration führt zur Erzeugung duplizierter Sequenzen auf beiden Seiten des integrierten Fragments1, die als Homologieregionen für eine weitere Rekombination dienen können, die zur Löschung des integrierten Fragments führt, wie bereits erwähnt3. Um dieses Problem zu lösen, wurden Integrationsvektoren entwickelt, die keine repetitiven genomischen Regionen durch den Einsatz der Doppel-Crossover-Rekombination erzeugen3. Solche stabilen Ersetzungen sind für Langzeitstudien geeignet, allerdings mit einer relativ geringen Transformationseffizienz. Andererseits weisen Single-Crossover-Integrationsvektoren eine hohe Transformationseffizienz auf, die der durch herkömmliche Plasmideinführung erzielten ähnelt, wobei sogar ein geringes Risiko einer weiteren Rekombination besteht. Aufgrund dieser Eigenschaften können einzelne Crossover-Vektoren für qualitative und quantitative Experimente geeignet sein, die eine hohe Transformationseffizienz erfordern, wie z. B. das Screening mithilfe von Plasmidbibliotheken. Praktisch können Transformanten, die aus den in dieser Studie entwickelten Vektoren sowie pDUAL gewonnen wurden, in einem Medium gehalten werden, dem die entsprechenden Aminosäuren fehlen, wodurch leicht selektiver Druck auf die Transformanten ausgeübt wird.

Ein großes Problem im Zusammenhang mit der Nutzung des CRISPR/Cas9-Systems ist die Möglichkeit von Off-Target-Effekten, die die Einführung unbeabsichtigter Mutationen an anderen Genomstandorten als dem beabsichtigten Ziel beinhalten. In unserer Studie stießen wir auf mehrere auxotrophe Stämme, die die Markergene für das Ziel behielten, möglicherweise aufgrund von Effekten außerhalb des Ziels. Darüber hinaus beobachteten wir einen unerwarteten Einbau eines Lachs-DNA-Fragments in den arg3-ORF. Die unbeabsichtigte Integration exogener DNA in das Genom des Wirtsorganismus stellt ein zusätzliches potenzielles Problem beim Einsatz des CRISPR/Cas9-Systems dar. Frühere Studien haben über die Einfügung von Lachs-DNA-Fragmenten in das Genom von Spalthefen berichtet20, und ähnliche Vorkommnisse wurden auch bei anderen Organismen dokumentiert23, 24. Daher bietet CRISPR/Cas9 zwar ein erhebliches Potenzial für die Genombearbeitung, es muss jedoch unbedingt sorgfältig darüber nachgedacht werden -Gezielte Effekte und unbeabsichtigte Einfügungen. Obwohl der Prozess zur Gewinnung des arg3-R25-Allels unerwartet war, ist die Insertion von exogener DNA in der 5'-Region des arg3-ORF für dieses experimentelle System von großem Vorteil. Dies liegt daran, dass die Insertion einen Selektionsdruck auf die Rekombinationsregion stromabwärts des Insertionspunkts ausübt, was ideal ist, um geeignete Integranten zu erhalten, die einer Arginin-Auxotrophie unterliegen (Abb. 4b). Daher haben wir arg3-R25 als das am besten geeignete Allel für das Targeting von arg3 mithilfe der Vektoren der pCArg3-Serie ausgewählt.

In der Spalthefeforschung wurden hauptsächlich leu1+ und ura4+ als Selektionsmarker verwendet1. Das am häufigsten verwendete Leu1-Allel des Wirts ist Leu1-32 mit einer Missense-Mutation im Leu1-ORF4. Andererseits ist der im Wirtsstamm am häufigsten verwendete ura4-Marker die vollständige Deletion ura4-D1818. Daher kann ura4-D18 nicht für die Single-Crossover-Rekombination verwendet werden. Obwohl nach und nach Vektoren entwickelt wurden, die andere Selektionsmarkergene verwenden, stehen uns immer noch begrenzte Möglichkeiten für die chromosomale Integration eines Transgens zur Verfügung. Die in dieser Studie entwickelten Vektoren werden in Kombination mit den meisten der zuvor beschriebenen Marker als wertvolle Option für die heterologe Genexpression vom Chromosom dienen. In diesem Zusammenhang werden diese Vektoren erheblich zu Experimenten beitragen, die die Expression mehrerer Transgene erfordern.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Gelb fluoreszierendes Protein

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Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI Grant Numbers 15K14925 und 22K05361 unterstützt.

Forschungsgruppe für chemische Genomik, RIKEN Center for Sustainable Resource Science, 2-1, Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japan

Akihisa Matsuyama, Atsushi Hashimoto und Minoru Yoshida

Labor für Mikrobiologie, Abteilung für Biotechnologie, Graduiertenschule für Agrar- und Biowissenschaften, Universität Tokio, Tokio, 113-8657, Japan

Akihisa Matsuyama, Shinichi Nishimura und Minoru Yoshida

Collaborative Research Institute for Innovative Microbiology, The University of Tokyo, Tokio, 113-8657, Japan

Shinichi Nishimura und Minoru Yoshida

Graduate School of Integrated Sciences for Life, Universität Hiroshima, Higashi-Hiroshima, 739-8528, Japan

Shinichi Nishimura

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Diese Arbeit wurde von AM und MY konzipiert. Alle Experimente wurden von AM durchgeführt und AHAM erstellte den Originalentwurf. SN und MY haben das Manuskript bearbeitet. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Akihisa Matsuyama.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Matsuyama, A., Hashimoto, A., Nishimura, S. et al. Eine Reihe von Vektoren und Stämmen für die chromosomale Integration in Spalthefe. Sci Rep 13, 9295 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36267-1

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Eingegangen: 3. Februar 2023

Angenommen: 31. Mai 2023

Veröffentlicht: 08. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36267-1

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