Peli3-Ablation verbessert Paracetamol

Experimentelle und molekulare Medizin (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Signalwege, die die durch Paracetamol (APAP) verursachte Leberschädigung steuern, wurden eingehend untersucht. Über die Ubiquitin-modifizierenden Enzyme, die für die Regulierung der APAP-induzierten Leberschädigung erforderlich sind, ist jedoch wenig bekannt. Hier untersuchten wir, ob das Pellino3-Protein, das über E3-Ligase-Aktivität verfügt, für eine APAP-induzierte Leberschädigung benötigt wird, und untersuchten anschließend seinen molekularen Mechanismus. Ganzkörper-Peli3-/--Knockout-Mäuse (KO) und Adenovirus-vermittelte Peli3-Knockdown-Mäuse (KD) zeigten ein verringertes Maß an zentrilobulärem Zelltod, Infiltration von Immunzellen und Biomarkern für Leberschäden, wie Alaninaminotransferase (ALT) und Aspartataminotransferase (AST) nach APAP-Behandlung im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (WT). Ein Peli3-Mangel in primären Hepatozyten verringerte die mitochondriale und lysosomale Schädigung und verringerte die Konzentration der mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Darüber hinaus waren die Phosphorylierungsniveaus von Serin 9 im Zytoplasma und die mitochondriale Translokation von GSK3β in primären Hepatozyten von Peli3-/- KO-Mäusen verringert, und diese Verringerungen gingen mit einer Abnahme der JNK-Phosphorylierung und der mitochondrialen Translokation einher. Pellino3 band im Vergleich zu JNK1 und JNK2 stärker an GSK3β und induzierte die durch Lysin 63 (K63) vermittelte Polyubiquitinierung von GSK3β. In Rettungsexperimenten stellte die ektopische Expression von Wildtyp-Pellino3 in Peli3-/−-KO-Hepatozyten die mitochondriale Translokation von GSK3β wieder her, diese Wiederherstellung wurde jedoch nicht mit der Expression einer katalytisch inaktiven Mutante von Pellino3 erreicht. Diese Ergebnisse sind die ersten, die auf einen mechanistischen Zusammenhang zwischen Pellino3 und APAP-induzierter Leberschädigung durch die Modulation der GSK3β-Polyubiquitinierung hinweisen.

Acetaminophen (N-Acetyl-p-aminophenol; APAP) ist ein mildes Analgetikum und Antipyretikum, das weltweit häufig verwendet wird. Eine Überdosierung mit APAP kann jedoch schwere Leberschäden verursachen, die zu akutem Leberversagen und Tod führen, obwohl APAP bei geeigneten therapeutischen Dosen als sicher gilt1. Zahlreiche in den letzten Jahrzehnten gesammelte Beweise deuten darauf hin, dass die Anhäufung von N-Acetyl-p-benzoquinonimin (NAPQI), dem reaktiven und toxischen Metaboliten von APAP, die Hauptursache für Leberschäden ist, die durch eine APAP-Überdosierung verursacht werden2. Obwohl geringe Mengen an NAPQI, das aus APAP durch hepatisches Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1) metabolisiert wird, durch Glutathion (GSH)-Konjugation entgiftet werden können, führt eine übermäßige Bildung von NAPQI nach einer APAP-Überdosierung schnell zu einer Erschöpfung von hepatischem GSH und verursacht so die Bildung von Proteinaddukten. insbesondere in mitochondrialen Proteinen3,4. Diese mitochondriale Proteinadduktbildung induziert eine übermäßige Bildung von mitochondrialem Superoxid, das mit Stickoxid (NO) reagieren kann, um Peroxynitrit zu produzieren, und dadurch die Proteinfunktion durch Nitrierung von Protein-Tyrosinresten stört5,6. Der Schutz vor APAP-induzierter Hepatoxizität durch das Superoxiddismutase (SOD)-Mimetikum Mito-TEMPO sowie die erhöhte Schädigung bei Mäusen mit teilweisem SOD-Mangel unterstreichen die Bedeutung von Superoxid in diesem Prozess7,8,9. Darüber hinaus weisen mehrere Studien zu APAP-induzierten Leberschäden darauf hin, dass die neuronale Stickoxidsynthase (nNOS) an der Erhöhung von NO10,11,12 beteiligt ist. Diese mitochondrialen Veränderungen der APAP-Hepatotoxizität, wie z. B. schwerer oxidativer Stress und nitrosativer Stress, tragen zur Öffnung der Übergangsporen der mitochondrialen Permeabilität bei, was zum Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und zur Freisetzung von Endonukleasen führt, die DNA-Schäden verursachen13. Alle diese Ereignisse führen letztendlich zu einer hepatozellulären Nekrose, obwohl neuere Studien auch auf die Bedeutung der Nekroptose hingewiesen haben14,15,16,17,18. Der nekrotische Zelltod bei APAP-Hepatotoxizität setzt schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) frei, darunter mitochondriale DNA, Kern-DNA-Fragmente, High-Mobility-Group-Box-1-Protein (HMGB1) und ATP, was zu einer sterilen Entzündung führt19,20. Diese DAMPs aktivieren die Inflammasom-Signalisierung durch Bindung an Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) und fördern die Verarbeitung von Pro-Caspase-1, was zur anschließenden Verarbeitung von Pro-IL-1β oder Pro-IL-18 zu aktiven Zytokinen führt21. Diese Zytokine scheinen für die Aktivierung und Rekrutierung von Neutrophilen und von Monozyten abgeleiteten Makrophagen in der Leber verantwortlich zu sein, obwohl umstritten bleibt, ob diese Entzündungszellen die Leberschädigung verschlimmern oder die Regeneration erleichtern19. Zusätzlich zu diesen Prozessen wurde berichtet, dass Autophagie eine wichtige Rolle bei der Erleichterung der Erholung und Regeneration der Leber spielt22,23,24.

Trotz umfangreicher pathophysiologischer Studien zu Leberschäden und den durch APAP-Überdosierung erzeugten reaktiven Metaboliten sind die Signalwege, die diese Hepatotoxizität steuern, wahrscheinlich komplizierter als unser derzeitiges Wissen. Umfangreiche Studien haben vor allem eine schädliche Rolle der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), einer Serin/Threonin-Proteinkinase, die zur Superfamilie der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) gehört, bei APAP-induzierter Hepatotoxizität gezeigt25,26,27, 28,29,30. Es wird angenommen, dass diese anhaltende Aktivierung von JNK im Zytosol und seine mitochondriale Translokation während einer APAP-Überdosierung den APAP-vermittelten mitochondrialen und nitrosativen Stress verstärken31.

Bei APAP-vermittelter Hepatotoxizität wurde berichtet, dass die JNK-Aktivierung durch vorgeschaltete Signalproteine ​​wie GSK3β, MLK3 und ASK132,33,34 moduliert wird. Jüngste Berichte weisen jedoch auch darauf hin, dass Proteinkinase C (PKC) und Rezeptor-interagierende Proteinkinase 1 (RIPK1) durch JNK-Aktivierung an der APAP-Hepatotoxizität beteiligt sind35,36. Unter diesen Kinasen ist GSK3β bekanntermaßen ein wichtiger Mediator, der durch seine Translokation in Mitochondrien sowie die JNK-Aktivierung an der APAP-vermittelten Hepatotoxizität beteiligt ist32.

Trotz des aktuellen Wissens über die Signalwege, die an der APAP-Hepatotoxizität beteiligt sind, sind die Ubiquitin-modifizierenden Systeme bei APAP-vermittelten Leberschäden weniger verstanden als die Phosphorylierung von Signalkomponenten. Es wurde festgestellt, dass die Ubiquitinierung von Zielproteinen für verschiedene zelluläre Prozesse wie Proteinstabilität, Signaltransduktion, Endozytose und Transport von entscheidender Bedeutung ist. Diese vielseitige Modifikation wird hauptsächlich durch E3-Ubiquitin-Ligasen vermittelt37. Das vom Peli3-Gen kodierte Pellino3-Protein ist ein Mitglied der Pellino-Familie, bestehend aus Pellino1, Pellino2 und Pellino338. Pellino3 verfügt über eine RING-Domäne mit E3-Ligase-Aktivität und ist an verschiedenen entzündlichen Signalwegen beteiligt, wie z. B. Toll-like-Rezeptor-Signalwegen, NOD2-Signalwegen und TNF-Signalwegen39,40,41,42. Interessanterweise wurde festgestellt, dass eine Überexpression von Pellino3-Proteinen die Aktivierung von MAPKs wie JNK und p3843,44 erleichtert. Diese Ergebnisse deuten stark auf eine mögliche Rolle von Pellino3 bei der APAP-vermittelten Hepatotoxizität hin, die bisher nicht untersucht wurde.

In dieser Studie zeigen wir eine Rolle des Pellino3-Proteins bei der APAP-vermittelten Hepatotoxizität durch seine Beteiligung an der mitochondrialen Translokation und Phosphorylierung von GSK3β durch den Einsatz von Ganzkörper-Peli3-/--Knockout (KO) und Adenovirus-vermitteltem Peli3-Knockdown ( KD) Mausmodelle. Dieser Bericht liefert die erste Identifizierung einer E3-Ubiquitin-Ligase, die die Funktion von GSK3β bei APAP-vermittelten Leberschäden moduliert.

Um Peli3 -/- KO-Mäuse zu erzeugen, wurde ein bedingter Knockout-Vektor, der auf das Peli3-Gen abzielt, unter Verwendung eines Rekombinationssystems (ergänzende Abbildung 1a) konstruiert. Ein 5,9 kb großes genomisches DNA-Fragment, das Peli3-Exon 2 enthielt, wurde in das pLMJ235-Plasmid eingefügt. Die loxP-Sequenz und die frt-loxP-Neo-frt-loxP-Kassette, die einen positiven Selektionsmarker (Neomycin-Resistenzgen) aufweist, wurden 117 bp stromaufwärts bzw. 304 bp stromabwärts von Exon 2 eingefügt. Der linearisierte Targeting-Vektor gegen das Peli3-Gen wurde zunächst in 2 × 107 J1-Maus-ESCs elektroporiert. Ungefähr dreihundert G418- und 1-(2-Desoxy-2-fluor-1-β-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil (FIAU)-resistente Kolonien wurden zufällig ausgewählt und diese Klone wurden durch genomische Southern-Blot-Analysen gescreent externe Sonden. Gezielte ESCs wurden in Blastozysten des Stammes C57BL/6 (B6) injiziert. ESC-Kultur und Blastozysteninjektionen wurden mit Standardmethoden durchgeführt. Männliche Chimären wurden mit B6-Weibchen gezüchtet, um den Peli3+/3f-Stamm in einem 129/B6-Hybridhintergrund zu etablieren. Peli3+/3f-Mäuse wurden mit β-Actin-Cre-Mäusen gekreuzt, um einen Mausstamm mit dem Peli31f-Null-Allel46 zu erzeugen, bei dem Exon 2 deletiert war. Um Peli3-KO-Mäuse mit dem C57BL/6-Hintergrund zu erzeugen, wurden Peli3-KO-Mäuse mit dem Hybridhintergrund über mehr als zehn Generationen mit C57BL/6-Mäusen rückgekreuzt. Die Genotypen von Wildtyp- und Peli3-/- KO-Mäusen wurden mittels PCR unter Verwendung der angegebenen Primer analysiert (ergänzende Abbildung 1b). Die Expression von Peli3-mRNA in Peli3-/- KO-Mäusen wurde auch durch quantitative Echtzeit-RT-PCR (qRT-PCR) mit den in der Ergänzungstabelle 1 beschriebenen Primern bestätigt.

Menschliche embryonale Nierenzellen 293 (HEK293) wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erworben. HEK293-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Thermo Fisher Scientific), 10 Einheiten/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin (Thermo Fisher) gehalten Wissenschaftlich). Die HEK293-Zellen wurden routinemäßig mittels PCR auf Mykoplasmenkontamination getestet. Primäre Hepatozyten der Maus wurden in M199-Medium (Sigma-Aldrich) mit 10 % FBS, 10 Einheiten/ml Penicillin, 10 mg/ml Streptomycin, 23 mM HEPES und 10 nM Dexamethason (Sigma-Aldrich) inkubiert. Acetaminophen (APAP) wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Plasmide wurden unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI) vorübergehend in HEK293-Zellen transfiziert. Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) wurde zur Transfektion in primäre Hepatozytenzellen der Maus verwendet.

Männliche Peli3–/– KO-Mäuse (8–9 Wochen alt) und ihre Wildtyp-Wurfgeschwister wurden für die Gesamtexperimente verwendet, in einer pathogenfreien Einrichtung gehalten, hielten einen zirkadianen 12-Stunden-/12-Stunden-Rhythmus aufrecht und wurden gefüttert Standardfutter. Um ein APAP-induziertes Leberschädigungsmodell zu etablieren, wurden Mäusen, die 14 Stunden lang in Gegenwart von Wasser und nur Nahrung gefastet hatten, oral 500 mg/kg APAP verabreicht. Vor der Verabreichung wurde APAP in destilliertem Wasser bei 55 °C gelöst und auf 37 °C abgekühlt. Als Kontrolle wurde den Mäusen destilliertes Wasser oral verabreicht. Nach der Verabreichung von APAP wurde das Überleben der Mäuse zu den angegebenen Zeitpunkten überwacht. Lebergewebe und Blutserum wurden 24 Stunden nach der APAP-Behandlung für weitere Experimente gesammelt. Die Konstruktion rekombinanter Adenoviren, die eine unspezifische RNAi-Kontrolle (shCON) und Peli3-spezifische shRNAs (shPeli3 #3 und shPeli3 #4) exprimieren, sowie die damit verbundenen Tierversuche wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt47. Die spezifischen RNAi-Sequenzen gegen endogene Peli3-mRNA, die in den rekombinanten Adenoviren verwendet werden, sind in der Ergänzungstabelle 2 beschrieben. Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Sungkyunkwan University School of Medicine (SUSM) überprüft und genehmigt Die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International) akkreditierte Einrichtung hält sich an die Richtlinien des Institute of Laboratory Animal Resources (ILAR). In allen Tierversuchen wurden Mäuse zufällig für die Erstellung des APAP-induzierten Leberschädigungsmodells ausgewählt.

HA-markierte humane Pellino3a- und Pellino3b-Expressionsplasmide wurden bereits beschrieben48. Unter Verwendung von HA-hPellino3a und HA-hPellino3b als Matrizen für die PCR mit spezifischen Primern wurden Pellino3a- und Pellino3b-cDNAs in die EcoRI- und XhoI-Stellen des pcDNA-Flag-Vektors (Thermo Fisher Scientific) oder die XhoI- und KpnI-Stellen des pCS3+MTBX subkloniert Vektor, der freundlicherweise von Dr. CY Choi (Sungkyunkwan University, Korea) zur Verfügung gestellt wurde, und dieser Prozess ergab Flag-hPellino3a und Flag-hPellino3b bzw. 6xMyc-hPellino3a und 6xMyc-hPellino3b. Maus-Pellino3-cDNA in voller Länge wurde aus primären Hepatozyten der Maus amplifiziert und in die EcoRI- und Humane GSK3β-cDNA voller Länge wurde durch PCR aus einem zuvor beschriebenen Plasmid, das für HA-GSK3β49 kodiert, amplifiziert und dann in die EcoRI- und SalI-Stellen des pCS3+MTBX-Vektors oder die EcoRI- und NcoI-Stellen des pCS5-Flag-Vektors subkloniert, um 6xMyc- zu ergeben. GSK3β oder Flag-GSK3β. Maus-GSK3β in voller Länge wurde in die EcoRV- und NcoI-Stellen des pCS5-Flag-Vektors subkloniert, was zu Flag-mGSK3β führte. JNK1-, JNK2- und MLK3-cDNAs voller Länge wurden von Addgene (Watertown, MA, USA) gekauft und nach der PCR-Amplifikation in die EcoRV- und XhoI-Stellen des pcDNA-Flag-Vektors subkloniert. Menschliche MKK4- und MKK7-cDNAs voller Länge wurden aus den cDNAs von HEK293-Zellen amplifiziert und in die BamHI/XhoI- und EcoRI/XhoI-Stellen des pcDNA-Flag-Vektors subkloniert, was Flag-MKK4 bzw. Flag-MKK7 ergab. Katalytisch inaktive Mutanten von humanem Pellino3a und Pellion3b sowie Maus-Pellino3-cDNAs wurden mit dem QuikChange Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) unter Verwendung von Flag-hPellino3a, Flag-hPellino3b und Flag-mPellino3 als Vorlagen erzeugt, was Flag-hPellino3a ergab -CI, Flag-hPellino3b-CI und Flag-mPellino3-CI. Die Maus-GSK3β-S9A-Mutante wurde ebenfalls mit dem QuikChange-Mutagenese-Kit erzeugt, was zu Flag-mGSK3β-S9A führte. Plasmide, die für HA-markiertes Ubiquitin (HA-Ubi) und His-markiertes Ubiquitin (His-Ubi) kodieren, wurden bereits beschrieben47,48. PCR-generierte Teile aller Konstrukte in dieser Studie wurden durch Sequenzierung verifiziert. Die Sequenzen der Primer, die in dieser Studie für die PCR-Amplifikation und ortsgerichtete Mutagenese verwendet wurden, sind in der Ergänzungstabelle 3 beschrieben.

Immunblot- und Immunpräzipitationstests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt49. Die Firmennamen, Katalognummern, Spezies und Verdünnungsverhältnisse der für Immunblotting und Immunpräzipitation verwendeten Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 4 beschrieben. Die Isolierung der Gesamt-RNA und die cDNA-Synthese wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt49. Die Sequenzen der Primer für Peli3-, Tnf- und Ifn1-mRNAs, die für die Echtzeit-qRT-PCR verwendet werden, sind in der Ergänzungstabelle 1 beschrieben. Die Echtzeit-qRT-PCR wurde mit einem CFX Connect-Echtzeit-PCR-Gerät und iQ SYBR Green SuperMix durchgeführt ( Bio-Rad, Hercules, CA, USA) zur Messung der Genexpression unter folgenden Bedingungen: 40 Zyklen mit 95 °C für 10 s, 62 °C für 10 s und 72 °C für 30 s. Alle Reaktionen wurden unabhängig voneinander mindestens dreimal wiederholt, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

Alle Experimente, einschließlich Immunoblots, wurden mit drei unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde durch einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA unter Verwendung der GraphPad Prism 5-Software (GraphPad, La Jolla, CA, USA) berechnet. P < 0,05 wurde als Hinweis auf statistische Signifikanz angesehen.

Details zur histologischen Analyse, Neutrophileninfiltration, terminaler Desoxynukleotidyltransferase-vermittelter Desoxyuridintriphosphat-Nick-End-Markierung (TUNEL)-Assay, primäre Hepatozytenisolierung, Messungen von Glutathion und reaktiven Sauerstoffspezies, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) und lysosomale Aktivitätstests, Fraktionierung von zytosolischen und mitochondrialen Extrakten, Immunblotting, Immunpräzipitation, In-vitro-Ubiquitinierungstest, ELISA und Myeloperoxidase (MPO)-Tests werden in den ergänzenden Informationen bereitgestellt.

Obwohl berichtet wurde, dass das Pellino3-Protein mit seiner intrinsischen E3-Ligase-Aktivität an der Aktivierung von MAPKs wie JNK und p3843,44 beteiligt ist, ist seine pathophysiologische Rolle bei APAP-induzierten Leberschäden unbekannt. Um die genaue Funktion von Pellino3 bei APAP-induzierten Leberschäden zu untersuchen, haben wir Ganzkörper-Peli3-/- KO-Mäuse erzeugt (ergänzende Abbildung 1a). Der Knockout des Peli3-Gens wurde durch Genotypisierung und quantitative Echtzeit-RT-PCR bestätigt, da alle kommerziell erhältlichen Antikörper gegen das Pellino3-Protein die endogene Pellino3-Expression nicht nachweisen konnten (ergänzende Abbildung 1b, c). Ganzkörper-Peli3-/--KO-Mäusen und Wildtyp-Mäusen (Peli3+/+ WT) wurde oral eine hohe Dosis APAP (500 mg/kg) verabreicht, und ihre Überlebensraten wurden 4 Tage lang beobachtet. Am Tag 4 zeigten Peli3−/− KO-Mäuse (n = 15) eine Überlebensrate von 80 %, wohingegen Peli3+/+ WT-Mäuse (n = 15) eine Überlebensrate von 20 % zeigten (P < 0,05) (Abb. 1a). Darüber hinaus waren die Werte der Biomarker für Leberschäden, nämlich Serum-Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST), bei Peli3 −/− KO-Mäusen im Vergleich zu Peli3+/+ WT-Mäusen signifikant verringert (Abb. 1b). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigte die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) von Lebergeweben, dass der zentrilobuläre nekrotische Zelltod und die Infiltration von Immunzellen, die durch die APAP-Behandlung bei Peli3+/+ WT-Mäusen induziert werden, bei Peli3–/– KO-Mäusen signifikant reduziert waren ( Abb. 1c). Der TUNEL-Assay von Peli3-/-KO-Mäusen unterstützte die Verringerung des Zelltods in der Leber (Abb. 1d, e). Darüber hinaus waren die Spiegel proinflammatorischer Zytokine wie IL-1β, IL-6 und TNFα bei der APAP-Behandlung in den Seren von Peli3–/– KO-Mäusen im Vergleich zu Peli3+/+ WT-Mäusen signifikant reduziert (Abb. 1f– H). In Übereinstimmung mit der verringerten Expression dieser Zytokine zeigten die Immunhistochemie für die Neutrophilenmarker Ly6G und Ly6C sowie MPO-Assays eine verringerte Infiltration von Neutrophilen in die Lebern von Peli3-/- KO-Mäusen (Abb. 1i, j).

a Peli3–/– Mäusen und Wildtyp (WT)-Wurfgeschwistern wurden 500 mg/kg APAP oral verabreicht, und das Gesamtüberleben der Mäuse wurde zu den angegebenen Zeiten überwacht. n = 15 pro Gruppe. Die Daten wurden statistisch mit dem Log-Rank-Test analysiert (**P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe, Peli3+/+ WT-Mäuse). b Die Serum-ALT- und AST-Spiegel wurden 24 Stunden nach der oralen Verabreichung von APAP gemessen. n = 5 pro Gruppe. Sham bezeichnet die Verabreichung von destilliertem Wasser (DW). Die Daten wurden statistisch durch eine Zwei-Wege-ANOVA analysiert, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest (**P < 0,01 und ****P < 0,0001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe). Die Balken stellen die Mittelwerte ± SDs dar. c H&E-Färbung von Lebern, die 24 Stunden nach der oralen Verabreichung von APAP aus Peli3-/-- und WT-Mäusen isoliert wurden. Maßstabsbalken, 100 μM (Originalbilder), 500 μm (vergrößerte Einschübe). d TUNEL-Assays der Lebern von Peli3-/-- und WT-Mäusen 24 Stunden nach oraler Verabreichung. Maßstabsbalken, 100 μm (Originalbilder), 500 μm (vergrößerte Einschübe). e Mindestens fünf Hotspots in einem Abschnitt aus den TUNEL-Tests wurden ausgewählt und die durchschnittliche Anzahl bestimmt. Die Daten wurden statistisch durch eine Zwei-Wege-ANOVA analysiert, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest (**P < 0,01 im Vergleich zur angegebenen Gruppe). Die Balken stellen die Mittelwerte ± SDs dar. f–h ELISAs von proinflammatorischen Zytokinen in den Seren von Peli3−/− KO- und Peli3+/+ WT-Mäusen 24 Stunden nach der oralen Verabreichung von APAP. n = 3 pro Gruppe. Die Daten wurden statistisch durch eine Zwei-Wege-ANOVA analysiert, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest (**P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe). i Immunhistochemie für die Neutrophilenmarker Ly6G/Ly6C in Lebergewebeschnitten von Peli3−/−- und WT-Mäusen 24 Stunden nach der oralen Verabreichung von APAP. Maßstabsbalken, 100 μm. j Myeloperoxidase-Aktivitäten in Leberlysaten, die von Peli3-/-- und WT-Mäusen 24 Stunden nach der oralen Verabreichung von APAP erhalten wurden. n = 5 pro Gruppe. Die Daten wurden statistisch durch eine Zwei-Wege-ANOVA analysiert, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest (***P < 0,001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe). Die Balken stellen die Mittelwerte ± SDs dar. In (c), (d) und (i) sind die gezeigten Bilder repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

Um eine Hepatozyten-spezifische Rolle des Peli3-Gens bei APAP-induzierten Leberschäden zu demonstrieren, erzeugten wir Mäuse mit akuter leberspezifischer Depletion von Peli3-mRNA, indem wir zwei Adenoviren injizierten, die unterschiedliche shRNAs gegen Peli3-mRNA exprimierten (Ad-shPeli3 #3 und Ad-shPeli3). #4) über die Schwanzvene. Als Negativkontrolle verwendeten wir ein Adenovirus, das unspezifische shRNA (Ad-shCON) exprimierte. Die quantitative Echtzeit-RT‒PCR (qRT‒PCR)-Analyse zeigte eine signifikante Herunterregulierung der Peli3-mRNA in primären Hepatozyten, die rekombinante Adenoviren exprimieren, wobei jede shRNA gegen Peli3-mRNA im Vergleich zu den Kontrolladenoviren wirkt (Abb. 2a). Nizza wurde 72 Stunden lang mit diesen Adenoviren infiziert und anschließend 14 Stunden lang gefastet. Anschließend wurden 500 mg/kg APAP oral verabreicht. Die H&E-Färbung 24 Stunden nach der APAP-Behandlung zeigte, dass durch die APAP-Behandlung verursachte Leberschäden, wie z. B. zentrilobulärer nekrotischer Zelltod, in den Lebern von Peli3-KD-Mäusen (Ad-shPeli3 Nr. 3 und Nr. 4) signifikant verringert waren (Abb. 2b). TUNEL-Tests zeigten auch eine Verringerung des Zelltods in der Leber von Peli3-KD-Mäusen (Abb. 2c). Darüber hinaus waren die Serum-ALT- und AST-Spiegel bei Peli3-KD-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen signifikant verringert (Abb. 2d). Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass ein Peli3-Mangel in Hepatozyten die APAP-induzierte Leberschädigung verringert.

a Mäuse wurden mit Adenoviren infiziert, die shRNA exprimieren, die auf Peli3-mRNA (Ad-shPeli3 #3 und Ad-shPeli3 #4) über die Schwanzvene abzielt. Als Kontrolle wurden Adenoviren verwendet, die unspezifische shRNA (Ad-shCON) exprimierten. Der Abbau von Peli3-mRNA in Hepatozyten 96 Stunden nach der Infektion dieser Viren wurde durch qRT-PCR-Analyse bestätigt. n = 3 pro Gruppe. Die Daten wurden statistisch durch eine Zwei-Wege-ANOVA analysiert, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest (***P < 0,001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe). Die Balken stellen die Mittelwerte ± SDs dar. b, c Mäuse wurden mit rekombinanten Adenoviren infiziert, und 72 Stunden später ließ man die Mäuse 14 Stunden lang fasten und ihnen wurde dann oral 500 mg/kg APAP verabreicht. Es wurden H&E-Färbung (b) und TUNEL-Assays (c) von Lebern durchgeführt, die aus Peli3-Knockdown (Ad-shPeli3 #3 und Ad-shPeli3 #4) und Kontrollmäusen (Ad-shCON) 24 Stunden nach der oralen Verabreichung von APAP isoliert wurden. Maßstabsbalken, 100 μm (Originalbilder) und 500 μm (vergrößerte Einschübe). Die Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. d Die Serum-ALT- und AST-Spiegel wurden 24 Stunden nach der oralen Verabreichung von APAP gemessen. n = 5 pro Gruppe. Die Daten wurden statistisch durch eine Zwei-Wege-ANOVA analysiert, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest (**P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe). Die Balken stellen die Mittelwerte ± SDs dar. b–d Sham weist auf die Verabreichung von destilliertem Wasser (DW) hin.

Da gezeigt wurde, dass Pellino3 für die Regulierung verschiedener entzündlicher Signalwege wie Toll-like-Rezeptor-Signalwege, NOD2-Signalwege und TNF-Signalwege39,40,41,42 erforderlich ist, untersuchten wir als nächstes die Expression von Zielgenen wie TNFα und Typ-I-Interferon in Hepatozyten, um zu verstehen, ob Pellino3 die APAP-Hepatotoxizität durch Regulierung derselben Zielgene vermittelt. Obwohl ein Peli3-Mangel die durch den NOD2-Liganden induzierte Expression von TNFα in Makrophagen aus dem Knochenmark hemmt und die durch Poly(I:C)39,41 induzierte Expression von IFNβ verstärkt, führte ein Peli3-Mangel in Hepatozyten nicht zu signifikanten Unterschieden in der Expression von TNFα- und IFNβ-mRNAs im Rahmen der APAP-Behandlung (Ergänzende Abbildung 2a, b). Im Gegensatz dazu zeigte die qRT-PCR-Analyse ganzer Leberextrakte, dass die Expressionsniveaus von TNFα und IFNβ nach APAP-Behandlung bei Peli3 −/− KO-Mäusen im Vergleich zu Peli3+/+ WT-Mäusen verringert waren (ergänzende Abb. 2c, d). Diese Diskrepanz scheint auf die Eigenschaften ganzer Leberextrakte zurückzuführen zu sein, zu denen Immunzellen und Hepatozyten gehören. Daher ist es möglich, dass sich die mechanistische Rolle von Pellino3 bei der APAP-Hepatotoxizität von seiner Rolle bei entzündlichen Signalwegen unterscheidet. Es ist jedoch bemerkenswert, dass die IFNβ-Expressionsniveaus im Zusammenhang mit der APAP-Behandlung im Widerspruch zu einem früheren Befund bezüglich der NOD2-Signalisierung stehen39, was die Möglichkeit nahelegt, dass Pellino3 über einen Mechanismus zur APAP-Hepatotoxizität beiträgt, der nach derzeitigem Kenntnisstand nicht identifiziert wurde bezüglich Pellino3.

Als nächstes untersuchten wir, ob die Peli3-Depletion nach Beginn einer APAP-Überdosierung therapeutische Wirkungen zeigt. Zu diesem Zweck untersuchten wir zunächst die Expressionsniveaus von Peli3-mRNA in primären Hepatozyten während der APAP-Behandlung. Eine Echtzeit-qRT-PCR-Analyse zeigte, dass die Peli3-Expression in Hepatozyten durch die APAP-Behandlung zu frühen und späten Zeitpunkten nur minimal beeinträchtigt wurde (Abb. 3a). Um die Zeitpunkte zu bestimmen, zu denen rekombinantes Adenovirus, das shRNA gegen Peli3-mRNA exprimiert, die endogenen Peli3-mRNA-Spiegel reduziert, wurden Peli3+/+ WT-Mäusen rekombinante Adenoviren (Ad-shPeli3 #3) über die Schwanzvene injiziert. Nach der Isolierung primärer Hepatozyten zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Expression von Peli3-mRNA mittels qRT‒PCR analysiert. Obwohl die endogene Peli3-mRNA-Expression 24 Stunden nach der Injektion von Ad-shPeli3 #3-Viren nicht beeinträchtigt war, wurde zunächst 72 Stunden nach der Injektion eine signifikante Verringerung festgestellt (Abb. 3b). Basierend auf diesen Ergebnissen wurden WT-Mäuse mit rekombinanten Adenoviren infiziert, 14 Stunden lang gefastet und ihnen wurden 500 mg/kg APAP oral verabreicht. Anschließend wurde ihr Überleben beobachtet (Abb. 3c). Die Peli3-Depletion durch rekombinante Adenoviren erhöhte die Überlebensraten sowohl 72 als auch 96 Stunden nach Beginn der APAP-Überdosierung signifikant im Vergleich zu denen von WT-Mäusen, denen Kontrolladenoviren (Ad-shCON) injiziert wurden (Abb. 3c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Peli3 KD möglicherweise therapeutisches Potenzial bei der Behandlung von APAP-induzierten Leberschäden hat.

a Die Expression von Peli3-mRNA in normalen primären Hepatozyten zu den angegebenen Zeitpunkten nach der APAP-Behandlung wurde durch qRT-PCR-Analyse bestätigt. b Die Verringerung der Peli3-mRNA-Expression in primären Hepatozyten, die mit rekombinanten Adenoviren infiziert waren, die Peli3-spezifische shRNA (Ad-shPeli3 #3) exprimierten, zu den angegebenen Zeiten wurde durch qRT-PCR-Analyse bestätigt. a, b Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente und wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest, statistisch analysiert (***P < 0,001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe). ns; nicht signifikant. Die Balken stellen die Mittelwerte ± SDs dar. c Peli3+/+ WT-Mäuse wurden mit rekombinanten Adenoviren infiziert, die Peli3-spezifische shRNAs (Ad-shPeli3 #3 und Ad-shPeli3 #4) exprimierten, oder Kontrolladenoviren, die unspezifische shRNA (Ad-shCON) exprimierten, und wurden anschließend 14 Stunden lang gefastet. APAP (500 mg/kg) wurde oral verabreicht und das Gesamtüberleben der Mäuse wurde zu den angegebenen Zeiten überwacht. n = 14 oder 15 pro Gruppe. Die Daten wurden statistisch mit dem Log-Rank-Test analysiert (**P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe, Ad-shCON).

Da ein Peli3-Mangel die APAP-induzierte Leberschädigung verringert, ist es möglich, dass Pellino3 den APAP-Metabolismus beeinflusst. Um diese Möglichkeit zu bestätigen, untersuchten wir die Expression des CYPE21-Gens, das für das hepatische Cytochrom P450 2E1 kodiert, das APAP metabolisiert. Die Immunblot-Analyse ergab, dass die Expression des CYP2E1-Gens in Peli3-/-KO-Hepatozyten der in Peli3+/+ WT-Hepatozyten ähnlich war, was darauf hindeutet, dass ein Peli3-Mangel keinen Einfluss auf den APAP-Metabolismus hat (Abb. 4a). Als nächstes untersuchten wir die GSH-Spiegel in den Lebern von Peli3–/– KO-Mäusen im Vergleich zu Peli3+/+ WT-Mäusen, da die GSH-Depletion eine Hauptkomponente der APAP-induzierten Hepatotoxizität ist2. Zu diesem Zweck isolierten wir primäre Hepatozyten aus Peli3+/+ WT- und Peli3−/− KO-Mäusen und behandelten sie anschließend 2 Stunden lang mit 20 mM APAP. Wie erwartet waren die gesamten GSH-Spiegel, die sowohl oxidiertes Glutathion (GSSG) als auch reduziertes Glutathion (GSH) umfassten, in den primären Hepatozyten von Peli3+/+ WT-Mäusen nach APAP-Behandlung verringert (Abb. 4b). Allerdings waren die Gesamt-GSH-Spiegel bei Peli3–/– KO-Mäusen nicht so stark reduziert wie bei Peli3+/+ WT-Mäusen (Abb. 4b). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen waren die Spiegel an oxidiertem Glutathion (GSSG) und das Verhältnis von GSSG zu GSH in den primären Hepatozyten von Peli3+/+ WT-Mäusen erhöht und in Peli3–/– KO-Mäusen signifikant erniedrigt (Abb. 4c, d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein Peli3-Mangel zu einer Verringerung der GSH-Depletion bei APAP-induzierten Leberschäden führt.

a Die Expression des hepatischen Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1)-Proteins in den primären Hepatozyten von Peli3–/– KO- und Peli3+/+ WT-Mäusen wurde während der Behandlung mit 20 mM APAP für die angegebenen Zeiten überwacht. b–d Die Spiegel an Gesamtglutathion (b: GSH + GSSG) und oxidiertem Glutathion (c: GSSG) sowie das GSSG-zu-GSH-Verhältnis (d) in den primären Hepatozyten von Peli3-/-- und WT-Mäusen wurden bei 2 gemessen h nach 20 mM APAP-Behandlung. n = 3 pro Gruppe. e Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in primären Hepatozyten wurden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von H2-DCFDA gemessen und quantifiziert. n = 3 pro Gruppe. f Primäre Hepatozyten von Peli3–/– KO- und Peli3+/+ WT-Mäusen wurden mit MitoSOX Red-Farbstoff inkubiert, 4 Stunden lang mit 20 mM APAP behandelt und mittels Durchflusszytometrie auf MitoSOX-Fluoreszenz analysiert. n = 3 pro Gruppe. g Die Expression von Superoxiddismutase 2 (SOD2) in den primären Hepatozyten von Peli3–/– KO- und Peli3+/+ WT-Mäusen wurde während der Behandlung mit 20 mM APAP für die angegebenen Zeiten überwacht. h Die Phosphorylierung von Histon H2AX in primären Hepatozyten, die von zwei unabhängigen Peli3−/− KO- und Peli3+/+ WT-Mäusen erhalten wurden, wurde durch Immunblotting zu den angegebenen Zeiten überwacht. (i) Zur Bewertung der Mitochondrienfunktion wurden MTT-Tests von primären Hepatozyten von Peli3−/− KO- und Peli3+/+ WT-Mäusen durchgeführt, die nach 4-stündiger Behandlung mit APAP gesammelt wurden. n = 3 pro Gruppe. j Ein lysosomaler Aktivitätstest unter Verwendung eines selbst gelöschten Substrats wurde mit primären Hepatozyten von Peli3−/− KO- und Peli3+/+ WT-Mäusen nach 8-stündiger Behandlung mit APAP durchgeführt. n = 3 pro Gruppe. b–f, i, j Die Daten wurden statistisch durch eine Zwei-Wege-ANOVA analysiert, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe). Die Balken stellen die Mittelwerte ± SDs dar. Die in (a), (g) und (h) gezeigten Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

Da der GSH-Abbau bei der APAP-Hepatotoxizität mit der Bildung von ROS zusammenhängt, haben wir als Nächstes die ROS-Werte in den primären Hepatozyten von Peli3+/+ WT- und Peli3−/− KO-Mäusen nach 20 mM APAP-Behandlung durch Durchflusszytometrieanalyse unter Verwendung von H2-DCFDA-Farbstoff gemessen . 4 Stunden nach der APAP-Behandlung waren die ROS-Werte in den Hepatozyten von Peli3+/+ WT-Mäusen erhöht und in denen von Peli3–/– KO-Mäusen signifikant erniedrigt (Abb. 4e). Zusätzlich zu den intrazellulären ROS zeigte die MitoSOX-Färbung, dass die Spiegel an mitochondrialen ROS bei der APAP-Behandlung in Peli3–/– KO-Hepatozyten im Vergleich zu Peli3+/+ WT-Hepatozyten signifikant verringert waren (Abb. 4f). Darüber hinaus blieb die Expression der mitochondrialen Superoxiddismutase 2 (SOD2), die als Scavenger-Protein zur Eliminierung von ROS fungiert, in APAP-behandelten primären Hepatozyten von Peli3−/− KO-Mäusen erhalten, während bei Peli3+/+ WT-Mäusen eine verringerte Expression beobachtet wurde (Abb. 4g). Da bekannt ist, dass oxidativer und nitrosativer Stress bei APAP-Hepatotoxizität DNA-Schäden und mitochondriale Dysfunktionen hervorruft50, untersuchten wir als nächstes die Phosphorylierung von Histon H2AX (pH2AX), einem Kennzeichen von Doppelstrangbrüchen (DSBs), in Hepatozyten, die aus Peli3+/+ WT gewonnen wurden und Peli3–/– KO-Mäuse nach APAP-Behandlung. Die Phosphorylierung von Histon H2AX war bei Peli3 −/− KO-Mäusen signifikant verringert (Abb. 4h). Um die Mitochondrienfunktion in Peli3-/- KO-Mäusen zu bewerten, haben wir die mitochondriale Dehydrogenaseaktivität mithilfe des MTT-Assays bewertet. Die mitochondriale Funktion in Peli3+/+ WT-Hepatozyten, jedoch nicht in Peli3−/− KO-Hepatozyten, war nach der APAP-Behandlung signifikant beeinträchtigt (Abb. 4i). Als nächstes quantifizierten wir unter Verwendung eines selbstlöschenden Substrats die in situ lysosomale Enzymaktivität in den primären Hepatozyten von Peli3−/− KO- und Peli3+/+ WT-Mäusen nach 8-stündiger Behandlung mit APAP. Die lysosomale Enzymaktivität wurde durch APAP in Peli3+/+-Hepatozyten erhöht, was den lysosomalen Schaden widerspiegelt, der nach der APAP-Behandlung verursacht wurde, wohingegen die Enzymaktivität in Peli3-/--Hepatozyten verringert war (Abb. 4j). Diese Ergebnisse liefern belastbare Belege dafür, dass ein Peli3-Mangel zur Unterdrückung mitochondrialer und lysosomaler Schäden beiträgt, indem er den oxidativen Stress bei der APAP-Behandlung verringert.

Als nächstes untersuchten wir die molekulare Funktion des Pellino3-Proteins bei APAP-induzierten Leberschäden. Um einen Hinweis zu finden, untersuchten wir zunächst die Wechselwirkung des Pellino3-Proteins mit verschiedenen Kinasen, die an der APAP-induzierten Leberschädigung beteiligt sind, da gezeigt wurde, dass die Pellino3-Aktivität zur Aktivierung von JNK43 führt. Beim Menschen gibt es zwei Formen von Pellino3-Proteinen, die durch alternatives Spleißen hergestellt werden: Pellino3a und Pellino3b43, während bei Mäusen eine einzige Form von Pellino3 vorkommt. Die in dieser Studie verwendeten menschlichen Pellino3- und Maus-Pellino3-Proteine ​​werden als hPellino3 bzw. mPellino3 bezeichnet.

Koimmunpräzipitationstests ergaben, dass das menschliche Pellino3a-Protein, bei dem es sich um die längere Form handelt, stark an GSK3β und MLK3, die MAP3Ks sind, bindet, jedoch schwach an JNKs (Abb. 5a). In ähnlicher Weise band hPellino3b, die kürzere Form, auch an GSK3β und MLK3 (ergänzende Abbildung 3a, b). Diese Ergebnisse veranlassten uns zu untersuchen, ob das menschliche Pellino3-Protein mit seiner E3-Ligaseaktivität die Ubiquitinierung von GSK3β und MLK3 induziert. Plasmide, die für HA-GSK3β und His-Ubi kodieren, wurden in Gegenwart von Wildtyp-Flag-hPellino3, Flag-hPellino3b oder katalytisch inaktiven Mutanten, in denen Cysteinreste im aktiven Zentrum von hPellino3a oder hPellino3b zu Alaninen mutiert waren, in HEK293-Zellen cotransfiziert. Anschließend wurden Ni-NTA-Pulldown-Assays durchgeführt. Die Polyubiquitinierung von GSK3β wurde bei beiden menschlichen Pellino3-Proteinen beobachtet, nicht jedoch bei den katalytisch inaktiven Mutanten von hPellino3a und hPellino3b (Abb. 5b). Darüber hinaus wurde die Polyubiquitinierung des GSK3β-Proteins auch mit Wildtyp-Flag-mPellino3 gefunden, jedoch nicht mit der katalytisch inaktiven Mutante von mPellino3 (Abb. 5c). Im Gegensatz zu GSK3β wurde das MLK3-Protein durch hPellino3a und hPellino3b nicht polyubiquitiniert (ergänzende Abbildung 4). Diese Ergebnisse deuten auf die Möglichkeit hin, dass sowohl menschliches als auch Maus-Pellino3 spezifisch APAP-induzierte Leberschäden durch die Polyubiquitinierung von GSK3β regulieren. Obwohl wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass Pellino3 die APAP-Hepatotoxizität durch Wechselwirkung mit MLK3 moduliert, konzentrierten wir uns auf die Identifizierung des molekularen Mechanismus der APAP-induzierten Leberschädigung basierend auf der Pellino3-vermittelten Polyubiquitinierung von GSK3β. Um die endogene Wechselwirkung von Pellino3 mit GSK3β in primären Hepatozyten der Maus weiter zu bestätigen, führten wir Immunpräzipitationstests durch. Allerdings konnten wir die endogene Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen nicht bestätigen, da alle kommerziell erhältlichen Antikörper gegen Pellino3 keine endogene Pellino3-Expression nachweisen konnten. Trotz dieser Probleme transfizierten wir das für Flag-mPellino3 kodierende Plasmid in primäre Peli3-/-KO-Hepatozyten. Nach der APAP-Behandlung für die angegebene Dauer wurden Immunpräzipitationstests mit einem Anti-Flag-Antikörper durchgeführt. Das in Peli3–/– KO-Hepatozyten ektopisch exprimierte Flag-Pellino3-Protein interagierte 2 Stunden nach der APAP-Behandlung spezifisch mit endogenem GSK3β (Abb. 5d).

a Ein für HA-hPellino3 kodierendes Plasmid wurde mit den angegebenen Flag-markierten Plasmiden in HEK293-Zellen cotransfiziert. Zelllysate wurden mit Anti-Flag-Antikörpern immunpräzipitiert (IP) und anschließend mit Anti-HA- und Anti-Flag-Antikörpern immungeblottet (IB). Gesamtzelllysate (TCLs) wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. b Nachdem ein für Wildtyp-His-Ubi kodierendes Plasmid mit HA-GSK3β in HEK293-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von Flag-hPellino3a, Flag-hPellino3a-CI, Flag-hPellin3b und Flag-hPellino3b-CI cotransfiziert wurde, wurde Ni-NTA- Es wurden vermittelte Pulldown-Assays durchgeführt. TCLs wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. c Plasmide, die für 6xMyc-GSK3β und HA-Ubi kodieren, wurden zusammen mit einem Plasmid, das für Wildtyp-Flag-mPellino3 oder eine katalytisch inaktive (CI) Mutante von Flag-mPellino3 (Flag-mPellino3-CI) kodiert, in HEK293-Zellen cotransfiziert. Die GSK3β-Ubiquitinierung wurde durch Immunpräzipitation unter Verwendung eines Anti-Myc-Antikörpers unter 1 % SDS-Denaturierungsbedingungen und Immunblotting mit einem Anti-HA-Antikörper untersucht. TCLs wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. d Ein für Flag-mPellino3 kodierendes Plasmid wurde in Peli3-/-KO-Hepatozyten transfiziert und anschließend für die angegebenen Zeiten mit 20 mM behandelt. Zelllysate wurden mit Anti-Flag-Antikörper immunpräzipitiert und anschließend mit Anti-GSK3β-Antikörper immungeblottet. TCLs wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. e Für die Ubiquitinierung des endogenen GSK3β-Proteins wurden primäre Hepatozyten von Peli3-/-- und WT-Mäusen 2 oder 4 Stunden lang mit 20 mM APAP behandelt. Zelllysate wurden mit Anti-GSK3β-Antikörper unter 1 % SDS-Denaturierungsbedingungen immunpräzipitiert und anschließend mit Anti-Ubiquitin (FK2-HRP)-Antikörper immungeblottet. TCLs wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. Als Negativkontrolle wurden Zelllysate mit Anti-IgG-Antikörpern immunpräzipitiert. f Ein Plasmid, das für Wildtyp-Ubiquitin (HA-Ubi-WT) oder Ubiquitin-Mutanten kodiert, die nur K48-verknüpfte (HA-Ubi-K48) oder K63-verknüpfte (HA-Ubi-K63) Polyubiquitinierung vermitteln, wurde mit 6xMyc in HEK293-Zellen transfiziert -GSK3β und Flag-hPellino3a in den angegebenen Kombinationen. Zelllysate wurden mit Anti-Myc-Antikörper immunpräzipitiert (IP) und anschließend mit Anti-HA-Antikörper immungeblottet (IB). TCLs wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. g Ein für HA-GSK3β kodierendes Plasmid wurde zusammen mit einer dosisabhängigen erhöhten Expression von Flag-hPellino3a in HEK293-Zellen cotransfiziert. Zelllysate wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. In allen Immunblots wurde die Expression von β-Actin als Ladungskontrolle verwendet. Die Bilder in dieser Abbildung sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente.

Als nächstes untersuchten wir, ob die Polyubiquitinierung von endogenem GSK3β durch Pellino3 reguliert wird, um die Bedeutung der Pellino3-vermittelten GSK3β-Polyubiquitinierung bei APAP-induzierten Leberschäden zu überprüfen. Hepatozyten wurden aus Peli3+/+ WT- und Peli3−/− KO-Mäusen isoliert, für die angegebenen Zeiten mit APAP behandelt und mit Anti-GSK3β-Antikörper gegen endogenes GSK3β-Protein unter 1 % SDS-Denaturierungsbedingungen immunpräzipitiert, und endogene GSK3β-Polyubiquitinierung wurde durch Immunblotting beobachtet mit Anti-Ubiquitin-Antikörper. Eine erhöhte Polyubiquitinierung von endogenem GSK3β wurde in Peli3+/+ WT-Hepatozyten bis zu 4 Stunden nach der APAP-Behandlung beobachtet (Abb. 5e). Allerdings war die Polyubiquitinierung von endogenem GSK3β in Peli3–/– KO-Hepatozyten signifikant verringert (Abb. 5e). Da der Polyubiquitinierungsprozess die Bindung einer E3-Ligase an ein spezifisches Substrat erfordert, deuten unsere Ergebnisse stark darauf hin, dass Pellino3 für die Polyubiquitinierung von GSK3β bei APAP-induzierten Leberschäden durch direkte Bindung an GSK3β verantwortlich ist.

Basierend auf diesen Erkenntnissen untersuchten wir als nächstes das Polyubiquitinierungsmuster von GSK3β durch menschliches Pellino3. Wildtyp-Ubiquitin (HA-Ubi), die K48-Ubiquitin-Mutante (HA-Ubi-K48), in der sechs Lysinreste außer Lysin 48 durch Arginin ersetzt sind, und die K63-Ubiquitin-Mutante (HA-Ubi-K63), in der nur Lysin enthalten ist 63 bleibt intakt und wurde mit 6xMyc-GSK3β in Abwesenheit oder Gegenwart von Flag-hPellino3a in HEK293-Zellen cotransfiziert. Die K63-, aber nicht K48-verknüpfte GSK3β-Polyubiquitinierung wurde durch Pellino3 erhöht (Abb. 5f). Da bekannt ist, dass K63-verknüpfte Polyubiquitinierung an verschiedenen zellulären Aktivitäten wie Signaltransduktion, Proteintransport, Protein-Protein-Interaktion und DNA-Reparatur beteiligt ist, ist es möglich, dass K63-verknüpfte GSK3β-Polyubiquitinierung durch Pellino3 die GSK3β-vermittelte Signaltransduktion beeinflusst bei APAP-induzierter Leberschädigung und hat keinen Einfluss auf die Stabilität des GSK3β-Proteins. Tatsächlich hatte die Expression von menschlichem Pellino3 keinen dosisabhängigen Einfluss auf die Stabilität von GSK3β, und dieser Prozess wird durch K48-verknüpfte Polyubiquitinierung vermittelt (Abb. 5g).

Unsere vorliegenden Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Pellino3 als E3-Ligase fungiert, um die Polyubiquitinierung von GSK3β zu induzieren. GSK3β ist im Zytoplasma konstitutiv aktiv und seine Aktivität wird durch Phosphorylierung an Tyrosin 216 verstärkt oder durch Phosphorylierung an Serin 9 (Ser9)53,54 gehemmt. Interessanterweise ist bekannt, dass die APAP-Behandlung die Phosphorylierung sowohl der aktiven als auch der gehemmten Form von GSK3β erhöht und die Translokation sowohl der phosphorylierten als auch der gesamten GSK3β-Proteine ​​in die Mitochondrien verursacht32. Es bleibt jedoch unklar, warum die gehemmte Form von GSK3β bei einer APAP-vermittelten Leberschädigung verstärkt wird und wie GSK3β in die Mitochondrien transloziert wird.

Daher untersuchten wir als nächstes, wie Pellino3 die Funktion von GSK3β bei APAP-induzierten Leberschäden moduliert. Zu diesem Zweck untersuchten wir die Phosphorylierung und mitochondriale Translokation von GSK3β in Hepatozyten von Peli3+/+ WT- und Peli3−/− KO-Mäusen, denen oral APAP verabreicht wurde. Der Phosphorylierungsgrad von GSK3β an Ser9 war bei Peli3-/− KO-Mäusen signifikant verringert, wohingegen die Phosphorylierung von Tyrosin 216 (Tyr216) durch Peli3-Mangel kaum beeinträchtigt wurde (Abb. 6a). Zytoplasmatische und mitochondriale Fraktionierungstests ergaben, dass die mitochondriale Translokation sowohl des gesamten GSK3β als auch des an Ser9 phosphorylierten GSK3β 1 Stunde nach der APAP-Behandlung in Peli3+/+ WT-Hepatozyten eingeleitet wurde. Im Gegensatz dazu waren die mitochondriale Translokation von GSK3β und die Phosphorylierung an Ser9 bei Peli3–/– KO-Mäusen im Vergleich zu Peli3+/+ WT-Mäusen signifikant verringert (Abb. 6b). Allerdings scheint die verringerte Phosphorylierung von GSK3β an Ser9 in der mitochondrialen Fraktion von Peli3−/−-Hepatozyten auf eine verringerte mitochondriale Translokation des gesamten GSK3β zurückzuführen zu sein.

a Ganze Leberlysate, die zu den angegebenen Zeiten nach der oralen Verabreichung von 500 mg/kg APAP aus Peli3-/-- und WT-Mäusen isoliert wurden, wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet, um die Phosphorylierung von GSK3β zu untersuchen. b Aus Peli3-/- und WT-Mäusen isolierte primäre Hepatozyten wurden für die angegebenen Zeiten mit 20 mM APAP behandelt und anschließend in zytoplasmatische und mitochondriale Extrakte fraktioniert. Beide Extrakte wurden mit den angegebenen Antikörpern gegen an Ser9 phosphoryliertes GSK3β und Gesamt-GSK3β immungeblottet. Die Expression von Tubulin und COX IV wurde als zytoplasmatische und mitochondriale Marker bzw. Belastungskontrollen verwendet. c Ganze Leberlysate, die 4 Stunden nach der oralen Verabreichung von 500 mg/kg APAP von Peli3-/-- und WT-Mäusen erhalten wurden, wurden mit Antikörpern immungeblottet, um die Phosphorylierung und den Gesamtspiegel von JNK nachzuweisen. d Aus Peli3-/- und WT-Mäusen isolierte primäre Hepatozyten wurden 2 oder 4 Stunden lang mit 20 mM APAP behandelt und anschließend in zytoplasmatische und mitochondriale Extrakte fraktioniert. Beide Extrakte wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. e Für Rettungsexperimente wurde Wildtyp-Flag-Pellino3 oder ein katalytisch inaktiver (CI) Mutant von Pellino3 in primäre Hepatozyten transfiziert, die von Peli3-/−-Mäusen erhalten wurden. Als Kontrolle wurde ein Scheinvektor in primäre Hepatozyten von Wildtyp-Mäusen transfiziert. Nachdem beide Sätze von Hepatozyten 2 Stunden lang mit 20 mM APAP behandelt worden waren, wurden sie in zytoplasmatische und mitochondriale Extrakte fraktioniert und anschließend mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet, um die Phosphorylierung von GSK3β am Ser9-Rest und die Gesamtkonzentrationen von GSK3β nachzuweisen. In (d) und (e) wurden Tubulin und COX IV als zytoplasmatische und mitochondriale Marker und Belastungskontrollen verwendet. f Plasmide, die für die Wildtyp-Flag-mGSK3β-, Flag-mGSKβ-S9A-Mutante und HA-Ubi kodieren, wurden zusammen mit einem für Myc-mPellino3 kodierenden Plasmid gemäß den angegebenen Kombinationen in HEK293-Zellen cotransfiziert. Die GSK3β-Ubiquitinierung wurde durch Immunpräzipitation unter Verwendung eines Anti-Flag-Antikörpers und Immunblotting mit einem Anti-HA-HRP-Antikörper untersucht. Gesamtzelllysate (TCLs) wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. g Primäre Hepatozyten von Peli3+/+ WT-Mäusen wurden mit Wildtyp-Flag-mGSK3β oder der Flag-mGSK3β-S9A-Mutante transfiziert und anschließend 8 Stunden lang mit APAP behandelt. Zellextrakte wurden mit Anti-Phospho-H2AX- und Anti-Flag-Antikörpern immungeblottet. h Nachdem Plasmide, die für HA-Ubi-WT, HA-Ubi-K48 und HA-Ubi-K63 kodieren, gemäß den angegebenen Kombinationen in Peli3+/+ WT- und Peli3–/– KO-Hepatozyten transfiziert wurden, wurden die Zellen mit 20 mM APAP behandelt 2 h, und Zellextrakte wurden mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. a, c, f, g, h Die Expression von β-Actin wurde als Ladungskontrolle verwendet. Alle Immunblot-Bilder in dieser Abbildung sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente.

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkung eines Peli3-Mangels auf die Aktivierung von JNK bei APAP-induzierter Leberschädigung, da berichtet wurde, dass die JNK-Aktivierung während der APAP-Hepatotoxizität stromabwärts von GSK3β erfolgt und JNK auch in Mitochondrien verlagert wird27,34. Nachdem Hepatozyten aus unabhängigen Peli3+/+ WT- (n = 5) und Peli3−/− KO-Mäusen (n = 3), denen oral APAP verabreicht wurde, isoliert worden waren, analysierten wir die Phosphorylierung von JNK durch Immunblotting. Bei der APAP-Behandlung war die Phosphorylierung von JNK bei drei unabhängigen Peli3+/+ WT-Mäusen erhöht und bei Peli3–/– KO-Mäusen deutlich verringert (Abb. 6c). Darüber hinaus war die mitochondriale Translokation von phosphoryliertem JNK und Gesamt-JNK aus dem Zytoplasma bei APAP-Behandlung bei Peli3–/– KO-Mäusen im Vergleich zu Peli3+/+ WT-Mäusen signifikant verringert (Abb. 6d). Ähnlich wie bei den für GSK3β gefundenen Ergebnissen scheint die verringerte Phosphorylierung von JNK in der mitochondrialen Fraktion von Peli3-/−-Hepatozyten durch eine verringerte mitochondriale Translokation von JNK verursacht zu werden. Diese Ergebnisse deuten insgesamt darauf hin, dass Pellino3 eine vorgelagerte Signalkomponente ist, die die Phosphorylierung und mitochondriale Translokation von GSK3β reguliert, die anschließend die JNK-Phosphorylierung im Zytoplasma und die mitochondriale Translokation von JNK bei APAP-induzierten Leberschäden reguliert.

Als nächstes führten wir Rettungsexperimente durch, um die Bedeutung der E3-Ligase-Aktivität von Pellino3 für die Phosphorylierung und mitochondriale Translokation von GSK3β klar zu beurteilen. Hepatozyten aus Peli3–/– KO-Mäusen sowie Peli3+/+ WT-Hepatozyten wurden mit Wildtyp-mFlag-Pellino3 bzw. einer katalytisch inaktiven Mutante von Pellino3 (Flag-mPellino3-CI) transfiziert, die Hepatozyten wurden mit APAP behandelt 2 h und anschließend in zytoplasmatische und mitochondriale Fraktionen getrennt. Ähnlich wie bei unseren vorherigen Ergebnissen (Abb. 6a, b) waren die mitochondriale Translokation von GSK3β und die Ser9-Phosphorylierung in Peli3 -/- KO-Hepatozyten im Vergleich zu Peli3 +/+ WT-Hepatozyten verringert (Abb. 6e; Spuren 2, 4, 10, 12). Interessanterweise stellte die ektopische Expression von Wildtyp-mPellino3 in Peli3-/−-KO-Hepatozyten die mitochondriale Translokation und Ser9-Phosphorylierung von GSK3β signifikant wieder her (Abb. 6e; Spuren 4, 6, 12, 14), wohingegen die Expression des katalytisch inaktiven Mutanten von Pellino3 (Flag-mPellino3-CI) ergab diesen Effekt nicht (Abb. 6e; Spuren 6, 8, 14). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die E3-Ligaseaktivität von Pellino3 für die Regulation von GSK3β bei APAP-induzierten Leberschäden entscheidend ist.

Obwohl unsere vorliegenden Ergebnisse darauf hinweisen, dass die Phosphorylierung von GSK3β Ser9 die E3-Ligaseaktivität von Pellino3 erfordert (Abb. 6a, b), ist es möglich, dass die Phosphorylierung von GSK3β an Ser9 für die Pellion3-vermittelte Ubiquitinierung von GSK3β erforderlich sein könnte. Um diese Möglichkeit zu testen, untersuchten wir die Ubiquitinierung der GSK3β-S9A-Mutante, bei der der Ser9-Rest durch Alanin ersetzt wurde. Die GSK3β-S9A-Mutante wurde durch Wildtyp-Pellino3-Protein polyubiquitiniert, ähnlich wie Wildtyp-GSK3β (Abb. 6f). Zusammen mit unseren aktuellen Erkenntnissen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Pellino3-vermittelte Ubiquitinierung von GSK3β der GSK3β-Ser9-Phosphorylierung vorgeschaltet ist, die für die APAP-Hepatotoxizität wesentlich ist, und dass die Phosphorylierung von GSK3β an Ser9 keine Voraussetzung für die GSK3β-Ubiquitinierung durch Pellino3 ist. Tatsächlich wurde die Bedeutung der Phosphorylierung von GSK3β an Ser9 für die APAP-Hepatotoxizität durch die Ergebnisse bestätigt, dass die ektopische Expression der GSK3β-S9A-Mutante in Peli3+/+ WT-Hepatozyten die Phosphorylierung von Histon H2AX bei APAP-Behandlung nicht erhöhte (Abb. 6g). ).

Darüber hinaus untersuchten wir die Bedeutung der K63-verknüpften Polyubiquitinierung von GSK3β durch Pellino3 für die GSK3β-Phosphorylierung an Ser9 und dessen mitochondriale Translokation. Plasmide, die für die Ubiquitin-Mutante K48 (HA-Ubi-K48) oder K63 (HA-Ubi-K63) kodieren, wurden vorübergehend in primäre Peli3+/+ WT- oder Peli3−/− KO-Hepatozyten transfiziert, und die Zellen wurden anschließend 2 Stunden lang mit APAP behandelt . Als Kontrolle wurde auch Wildtyp-Ubiquitin (HA-Ubi-WT) in primäre Hepatozyten transfiziert. Die Phosphorylierung von GSK3β an Ser9 und seine mitochondriale Translokation in Peli3+/+ WT-Hepatozyten wurden durch APAP-Behandlung in Gegenwart von Wildtyp-Ubiquitin (HA-Ubi-WT) und der K48-Ubiquitin-Mutante (HA-Ubi-K48) grundsätzlich erhöht ( Abb. 6h und ergänzende Abb. 5). Im Gegensatz dazu erhöhte die Expression der K63-Ubiquitin-Mutante (HA-Ubi-K63) die Phosphorylierung von endogenem GSK3β an Ser9 und dessen mitochondriale Translokation durch APAP-Behandlung im Vergleich zu den mit HA-Ubi-WT und HA-Ubi-K48 erzielten Ergebnissen weiter ( Abb. 6h und ergänzende Abb. 5). Dieser signifikante Anstieg der GSK3β-Phosphorylierung bei Ser9 und seiner mitochondrialen Translokation in Gegenwart von HA-Ubi-K63 wurde in primären Peli3-/-KO-Hepatozyten nicht beobachtet (Abb. 6h und ergänzende Abb. 5). Daher stützen diese Ergebnisse unsere aktuelle Feststellung, dass die K63-verknüpfte Polyubiquitinierung von GSK3β durch Pellino3 für die GSK3β-Phosphorylierung an Ser9 und die mitochondriale Translokation bei APAP-induzierten Leberschäden erforderlich ist.

Obwohl die Pathophysiologie der APAP-vermittelten Leberschädigung und die Signalwege, die diese Hepatotoxizität steuern, in den letzten Jahrzehnten umfassend untersucht wurden, haben wir kein klares Verständnis der Ubiquitin-modifizierenden Systeme, die die posttranslationale Modifikation von Signalkomponenten in der APAP-induzierten Leber regulieren Verletzung. Nur wenige Studien deuten darauf hin, dass E3-Ligasen wie das endoplasmatische Retikulum-polytopische gp78/AMFR (autokriner Motilitätsfaktor-Rezeptor), Parkin und HOIP durch den Einsatz von Knockout-Mäusen oder RNA-Interferenztechnologie an APAP-induzierten Leberschäden beteiligt sind55,56,57.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass das Pellino3-Protein eine neuartige E3-Ubiquitin-Ligase bei APAP-induzierter Leberschädigung ist und dass die K63-verknüpfte Polyubiquitinierung von GSK3β durch Pellino3 zur GSK3β-Phosphorylierung an Ser9 im Zytoplasma und zur mitochondrialen Translokation führt. Phosphoryliertes GSK3β trägt zur Erhöhung der mitochondrialen ROS, mitochondrialer Dysfunktion und DNA-Schäden bei, was schließlich zum nekrotischen Zelltod führt (ergänzende Abbildung 6). Darüber hinaus deuten die Ergebnisse, dass die Peli3-mRNA-Expression durch die APAP-Behandlung kaum beeinflusst wird, darauf hin, dass die Wechselwirkung von Pellino3 mit GSK3β bei der APAP-Hepatotoxizität wichtiger ist als die Regulierung der Peli3-mRNA. Somit ist dies die erste Studie, die Pellino3 als eine E3-Ubiquitin-Ligase identifiziert, die auf GSK3β in Hepatozyten abzielt, und ihre pathophysiologische Rolle bei Peli3-/- KO-Mäusen aufdeckt, denen oral APAP verabreicht wurde.

In dieser Studie stellten wir die Hypothese auf, dass Pellino3 eine wichtige Rolle bei APAP-induzierten Leberschäden spielen könnte, da Pellino3 nachweislich die Aktivierung von c-Jun und Elk-1 fördert und an verschiedenen entzündlichen Signalwegen beteiligt ist, indem es auf verschiedene Substrate abzielt25,43 . Hier zeigten wir deutlich eine verringerte APAP-induzierte Leberschädigung sowohl bei Ganzkörper-Peli3-/-KO-Mäusen als auch bei hepatozytenspezifischen Peli3-depletierten Mäusen. Diese schützende Wirkung des Peli3-Mangels auf die APAP-Hepatotoxizität scheint auf eine Abnahme der Phosphorylierung und mitochondrialen Translokation von GSK3β zurückzuführen zu sein, begleitet von einer Verringerung der mitochondrialen ROS sowie Funktionsstörungen und DNA-Schäden. Tatsächlich gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass die durch die APAP-Behandlung verursachten katastrophalen Veränderungen eine GSK3β- und JNK-Phosphorylierung und deren mitochondriale Translokation erfordern und dass GSK3β JNK32,58 vorgeschaltet ist. Unsere aktuellen Ergebnisse mit Peli3-/- KO-Mäusen liefern belastbare Beweise dafür, dass die Pellino3-vermittelte Ubiquitinierung von GSK3β in Hepatozyten ein wesentlicher Schritt für die Phosphorylierung von GSK3β bei Ser9 und der mitochondrialen Translokation von GSK3β ist, die für die mitochondriale Schädigung bei APAP-Hepatotoxizität von entscheidender Bedeutung sind. Wir konnten jedoch die Möglichkeit nicht ausschließen, dass Pellino3 in Entzündungszellen auf unbekannte Weise zur APAP-Hepatotoxizität beiträgt, da berichtet wurde, dass Pellino3 an verschiedenen Entzündungssignalwegen beteiligt ist.

Obwohl GSK3β als wichtiger Regulator der mitochondrialen Aktivität Aufmerksamkeit erregt hat und bekannt ist, dass die APAP-Behandlung bei Mäusen eine GSK3β-Aktivierung und eine mitochondriale Translokation verursacht32,58, kennen wir den genauen Mechanismus der mitochondrialen Translokation von GSK3β in Hepatozyten noch nicht. Ein Hinweis darauf, wie GSK3β in Mitochondrien transloziert wird, könnte aus zuvor berichteten Experimenten mit H9c2-Kardiomyoblasten abgeleitet werden59. In diesen Zellen wandert GSK3β unter oxidativem Stress in die Mitochondrien, indem es mit dem spannungsabhängigen Anionenkanal 2 (VDAC2) in einer Weise interagiert, die von der Phosphorylierung von GSK3β an Ser959 abhängt. Basierend auf diesem früheren Befund könnte die K63-verknüpfte Polyubiquitinierung von GSK3β durch Pellino3 entscheidend für die Wechselwirkung von GSK3β mit einem bestimmten Faktor auf der Mitochondrienmembran bei APAP-induzierten Leberschäden sein. Daher könnte unsere Studie Hinweise für die weitere Erweiterung unseres Wissens über den Mechanismus der mitochondrialen Translokation von GSK3β bei APAP-Behandlung liefern.

Es ist jedoch wahrscheinlich, dass die Funktionen von Pellino3 in GSK3β über die mitochondriale Translokation von GSK3β hinausgehen. Im Vergleich zu Peli3+/+ WT-Mäusen war die GSK3β-Ser9-Phosphorylierung im Zytoplasma bei Peli3−/− KO-Mäusen signifikant verringert, wohingegen eine Veränderung der Tyrosin-216-Phosphorylierung nicht festgestellt wurde. Im Allgemeinen ist bekannt, dass die GSK3β-Aktivität durch Tyrosin-216-Phosphorylierung verstärkt oder durch Ser9-Phosphorylierung gehemmt wird. Berichten zufolge erhöht die APAP-Behandlung jedoch die Phosphorylierung sowohl der aktiven als auch der gehemmten Form von GSK3β, auch wenn der Grund bisher nicht untersucht wurde32. Da über keine Kinasen berichtet wurde, die GSK3β direkt an Ser9 phosphorylieren, ist es möglich, dass die E3-Ligaseaktivität von Pellino3 bestimmte Kinasen reguliert, die die GSK3β-Phosphorylierung an Ser9 steuern. In diesem Zusammenhang ist bemerkenswert, dass die Expression von GSK3β und die Phosphorylierung der Glykogensynthase (GS), dem Substrat von GSK3beta, in den Leberextrakten von MLK3-KO-Mäusen nach APAP-Behandlung verringert waren, was darauf hindeutet, dass MLK3 mit verbunden ist GSK3β durch eine positive Rückkopplungsschleife bei APAP-induzierter Leberschädigung33. Es gibt jedoch keine direkten Beweise dafür, dass MLK3 eine Kinase ist, die GSK3β an Ser9 phosphoryliert. In Anbetracht unserer Feststellung, dass Pellino3 unabhängig von seiner E3-Ligaseaktivität an MLK3 bindet, lohnt es sich zu untersuchen, ob die K63-verknüpfte Polyubiquitinierung von GSK3β durch Pellino3 die GSK3β-Phosphorylierung an Ser9 durch MLK3 oder eine unbekannte Kinase fördert. Basierend auf einer Zusammenfassung der Ergebnisse und denen, die in früheren Berichten detailliert beschrieben wurden, steht die Pellino3-vermittelte K63-verknüpfte Polyubiquitinierung von GSK3β in entscheidendem Zusammenhang mit der Ser9-Phosphorylierung von GSK3β im Zytoplasma, und ihre Phosphorylierung an Ser9 fördert die mitochondriale Translokation von GSK3β bei APAP-Hepatotoxizität. Diese Spekulation könnte teilweise durch eine frühere Feststellung gestützt werden, dass die mitochondriale Translokation von GSK3β in H9c2-Kardiomyoblasten von der Ser9-Phosphorylierung abhängt59.

Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse, dass ein Peli3-Mangel die ROS-Erzeugung und die GSH-Spiegel in der Leber verringert, stark darauf hin, dass Pellino3 auf unbekannte Weise an APAP-induziertem oxidativem Stress beteiligt sein könnte. Daher ist es möglich, dass Pellino3 mit der Expression antioxidativer Enzyme wie Superoxiddismutase 2 (SOD2) zusammenhängt. Daher sollte der zugrunde liegende Mechanismus, durch den Pellino3 spezifisch die Expression antioxidativer Enzyme wie SOD2 bei der APAP-Hepatotoxizität reguliert, ein Thema von zukünftigem Interesse sein.

Unsere Erkenntnisse, dass Pellino3 mit unterschiedlichen Bindungsstärken an die MAP-Kinasen GSK3β, MLK3 und JNK1 bindet, deuten darauf hin, dass Pellino3 möglicherweise eine Gerüstaktivität im Signalweg aufweist, der die APAP-Hepatotoxizität reguliert. Diese Spekulation würde mit der vorherigen Feststellung übereinstimmen, dass Pellino3 als Gerüstprotein fungiert43. Darüber hinaus zeigte unsere Studie, dass die erhöhte Überlebensrate von Mäusen, denen APAP oral verabreicht wurde, mit der Verringerung der endogenen Peli3-mRNA-Expression durch rekombinante Adenoviren, die Peli3-spezifische shRNAs exprimieren, korreliert, was darauf hindeutet, dass die Peli3-Depletion nach Beginn der APAP-Hepatotoxizität die Leber reduzieren kann Schaden. Dieser Befund unterstreicht die Bedeutung der Pellino3-GSK3β-Achse für die Einleitung und das Fortschreiten der APAP-Hepatoxizität. Tatsächlich zeigen unsere vorliegenden Ergebnisse, dass die Pellino3-vermittelte Ubiquitinierung von GSK3β, die zur Phosphorylierung von GSK3β an Ser9 und zur mitochondrialen Translokation von GSK3β führt, entscheidend für den pathologischen Prozess der APAP-induzierten Leberschädigung ist und dass ein Peli3-Mangel die Mitochondrien verringert ROS und Schäden sowie lysosomale Schäden. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse stark darauf hin, dass die Pellino3-GSK3β-Achse in Hepatozyten für APAP-induzierte Leberschäden von entscheidender Bedeutung ist, und unterstreichen, dass die Blockade der GSK3β-Ubiquitinierung durch Pellino3 ein wichtiges Schema für die Behandlung der APAP-Hepatotoxizität sein könnte.

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Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss der National Research Foundation of Korea (SRC 2017R1A5A1014560) unterstützt, der vom Ministerium für Wissenschaft und IKT finanziert wurde, und teilweise durch einen Zuschuss (2020R1A2C3009643 an SHP) der National Research Foundation of Korea.

Jun-Hyeong Kim

Aktuelle Adresse: KoBio Labs, Seongnam, 13488, Republik Korea

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jaewon Lee, Jihoon Ha, Jun-Hyeong Kim.

Abteilung für Biowissenschaften, Sungkyunkwan-Universität, Suwon, 16419, Republik Korea

Jaewon Lee, Jihoon Ha, Jun-Hyeong Kim, Dongyeob Seo, Minbeom Kim, Yerin Lee, Seong Shil Park, Jin Seok Park, Su Myung Jung, Yong-Soo Bae und Seok Hee Park

Abteilung für Biowissenschaften, Korea University, Seoul, 02841, Republik Korea

Dahee Choi & Seung-Hoi Koo

Abteilung für Biochemie, Gachon University School of Medicine, Incheon, 21999, Republik Korea

Der junge Jae Lee und Suntaek Hong

Abteilung für Pharmakologie, Ajou University School of Medicine, Suwon, 16499, Republik Korea

Siyoung Yang

SRC-Zentrum für Immunforschung an nicht-lymphoiden Organen, Sungkyunkwan-Universität, Suwon, 16419, Republik Korea

Siyoung Yang, Yong-Soo Bae und Seok Hee Park

Medpacto Inc., Seoul, 06668, Republik Korea

Kyung-Min Yang & Seong-Jin Kim

GILO Institute, GILO Foundation, Seoul, 06668, Republik Korea

Seong-Jin Kim

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JL, JH und JHK konzipierten die Forschung, führten die experimentelle Arbeit durch, analysierten Daten und verfassten das Manuskript. DS, MK, YL, SSP und JSP führten die experimentellen Arbeiten durch und analysierten die Daten. DC erzeugte die rekombinanten Adenoviren. YJL und SH erzeugten die Knockout-Mäuse und beteiligten sich am Studiendesign. SY, KMY, SMJ, SHK und YSB waren am Studiendesign beteiligt, analysierten Daten und koordinierten die Studie. SJK und SHP entwarfen und konzipierten die Forschung, überwachten die experimentelle Arbeit, analysierten Daten und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Seong-Jin Kim oder Seok Hee Park.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Lee, J., Ha, J., Kim, JH. et al. Die Peli3-Ablation lindert Paracetamol-induzierte Leberschäden durch Hemmung der GSK3β-Phosphorylierung und der mitochondrialen Translokation. Exp Mol Med (2023). https://doi.org/10.1038/s12276-023-01009-w

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Eingegangen: 15. August 2022

Überarbeitet: 07. Februar 2023

Angenommen: 15. März 2023

Veröffentlicht: 01. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s12276-023-01009-w

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