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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 48 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Biopsie ist der empfohlene Standard für die pathologische Diagnose von Leberkarzinomen. Allerdings erfordert diese Methode in der Regel Schnitte und Färbungen sowie gut ausgebildete Pathologen zur Interpretation der Gewebebilder. Hier nutzen wir Raman-Spektroskopie, um menschliche Lebergewebeproben zu untersuchen und einen Arbeitsablauf für die pathologische In-vitro- und intraoperative Diagnose von Leberkrebs zu entwickeln und zu validieren. Wir unterscheiden Karzinomgewebe schnell, störungsfrei und markierungsfrei von angrenzenden Nicht-Tumorgeweben, indem wir Raman-Spektroskopie in Kombination mit Deep Learning verwenden, das durch Gewebemetabolomik validiert wird. Diese Technik ermöglicht eine detaillierte pathologische Identifizierung des Krebsgewebes, einschließlich Subtyp, Differenzierungsgrad und Tumorstadium. Basierend auf der Visualisierung der molekularen Zusammensetzung werden auch 2D/3D-Raman-Bilder von unverarbeiteten menschlichen Gewebeschnitten mit submikrometrischer Auflösung erfasst, die bei der Erkennung von Tumorgrenzen und der klinisch-pathologischen Diagnose hilfreich sein könnten. Abschließend wird das Potenzial eines tragbaren, handgehaltenen Raman-Systems während der Operation für die intraoperative Diagnose von menschlichem Leberkrebs in Echtzeit veranschaulicht.

Leberkrebs war im Jahr 2020 die siebthäufigste Krebserkrankung und die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit1. Die Inzidenz neu diagnostizierter Fälle und die altersstandardisierten Inzidenzraten von Leberkrebs sind in den letzten Jahrzehnten weltweit weiter gestiegen, wenn auch erheblich Fortschritte in Diagnose und Therapie2,3.

Daher ist eine genaue und rechtzeitige Diagnose für die Behandlung von Leberkrebs und die Verbesserung der Überlebensrate von entscheidender Bedeutung. Serologische Tests in Kombination mit Bildgebung sind die Standardmethode zur Diagnose von Leberkarzinomen4. Die diagnostische Sensitivität des am häufigsten verwendeten serologischen Tests, der auf Alpha-Fetoprotein (AFP) nachweist, liegt jedoch bei etwa 60 %5. Bildgebende Verfahren wie Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT) und Ultraschall (US) weisen eine hohe Sensitivität und Spezifität für die Erkennung von Leberkrebs auf, insbesondere bei Patienten mit Leberzirrhose6. Solche Bildgebungstests weisen jedoch eine begrenzte räumliche Auflösung auf, sind kompliziert bei der intraoperativen Diagnose und/oder bergen das Risiko einer Exposition gegenüber ionisierender Strahlung7. Daher wird die Biopsie immer noch als Goldstandard für die pathologische Diagnose empfohlen, die für die Prognose und die Steuerung der Behandlung wichtig ist4.

Klinisch werden histopathologische Untersuchungen in der Regel mit Hämatoxylin & Eosin (H&E) oder immunhistochemischer Färbung durchgeführt. Das Färbeverfahren ist zeitaufwändig und eignet sich nur für die Diagnose anhand isolierter Gewebe. Darüber hinaus kann die begrenzte Anzahl an Pathologiespezialisten den Einsatz der Histopathologie einschränken6. In jüngster Zeit hat die digitale Pathologie mit Hochdurchsatz-Bildanalyse Pathologen bei der Identifizierung und Klassifizierung von Gewebeproben erheblich geholfen8,9. Allerdings unterliegt die Probenvorbereitung für die digitale Pathologie den gleichen Einschränkungen wie herkömmliche Methoden. Daher sind Techniken für eine schnellere und unterbrechungsfreie In-vitro- und sogar In-vivo-Untersuchung von Leberkrebs erforderlich.

Die auf Raman-Spektroskopie basierende spektrale Histopathologie bietet einen alternativen Ansatz zur Krebsdiagnose10. Raman-Spektroskopie ist eine optische Technik, die auf der inelastischen Streuung von Licht durch vibrierende Moleküle basiert und chemische Fingerabdrücke komplexer biologischer Proben liefert. Mit der Raman-Messung sind die meisten biomolekularen Informationen mit nur einem einfachen Schnappschuss verfügbar. Wichtig ist, dass die chemische Struktur und Zusammensetzung biologischer Proben durch Raman-Spektroskopie fleckenfrei und zerstörungsfrei mit minimaler Probenvorbereitung ermittelt werden kann11,12,13,14. Spektralinformationen können auch mit Algorithmen der künstlichen Intelligenz kombiniert werden, um ein diagnostisches Klassifizierungsmodell zu erstellen, das eine automatische Diagnose ermöglicht15,16,17,18. Darüber hinaus ermöglicht die Raman-Spektroskopie-Bildgebung die Abgrenzung von Tumorrändern und die Visualisierung interessierender Läsionsbereiche, die für das bloße Auge unsichtbar sind19. Diese Funktionen machen die Raman-Spektroskopie für die Untersuchung isolierter Gewebeproben und die Unterstützung von Chirurgen bei der Identifizierung der Ränder von Tumoren möglich, wodurch eine vollständigere Entfernung mit minimaler Schädigung des normalen Gewebes ermöglicht wird.

Bisher gab es Untersuchungen zur Verwendung der Raman-Spektroskopie zur pathologischen Diagnose verschiedener biologischer Gewebe, darunter Gehirn20, Brust21, Haut22,23, Dickdarm24 und Blase25. Bei Leberkrebs konzentrierten sich auf Raman-Spektroskopie basierende Studien hauptsächlich auf die Analyse von Blutproben, wobei nur wenige Studien auf menschliches Gewebe abzielten.

Darüber hinaus ist bekannt, dass die Heterogenität von Tumorgeweben und eine mögliche Infiltration von Karzinomen die Variabilität der aus Geweben gesammelten Spektraldaten erhöhen. Daher ist es notwendig, von jeder Gewebeprobe eine große Anzahl von Spektren zu sammeln, um die Daten besser darzustellen. Dies kann jedoch die Komplexität der Datenanalyse erhöhen und eine Herausforderung für herkömmliche chemometrische Methoden darstellen. Die datengesteuerte Natur des Deep Learning ist gut geeignet, dieses Problem zu lösen17. Deep Learning kann verborgene Merkmale direkt aus riesigen Datenmengen extrahieren und lernen und wurde erfolgreich im Bereich der Bilderkennung, einschließlich der biologischen und medizinischen Bildanalyse, eingesetzt26,27,28. Dank der Flexibilität seiner Architektur wurde Deep Learning auch auf die Analyse eindimensionaler sequentieller Daten wie Spektraldaten ausgeweitet29,30. In einigen Berichten wurde Deep Learning für die medizinische Diagnose unter Verwendung von 1-D-Raman-Spektraldaten beschrieben18,31.

In dieser Studie berichteten wir über die Untersuchung von menschlichem Hepatopathiegewebe mittels Raman-Spektroskopie. Zunächst gelang es uns, mithilfe der Raman-Spektroskopie in Kombination mit einem VGG-16-basierten Convolutional Neural Network (CNN) Leberkarzinomgewebe schnell, unterbrechungsfrei und markierungsfrei von angrenzenden Nicht-Tumorgeweben zu unterscheiden. Anschließend wurde eine detailliertere pathologische Identifizierung des Leberkrebsgewebes vorgenommen, einschließlich Subtyp, Differenzierungsgrad und Tumorstadium. Die Analyse der Gewebemetabolomik bestätigte die Zuverlässigkeit der Raman-Spektroskopie bei der Identifizierung von Metaboliten. Darüber hinaus ermöglichten Raman-Bilder von unverarbeiteten menschlichen Gewebeblöcken und Gewebeschnitten mit submikrometrischer Auflösung die Visualisierung ihrer molekularen Zusammensetzung, was die Identifizierung von Tumorgrenzen und die klinisch-pathologische Diagnose erleichterte. Schließlich wurde während der Operation ein tragbares Raman-Spektroskopiesystem eingesetzt, um die Machbarkeit einer intraoperativen Leberkrebsdiagnose in Echtzeit zu untersuchen. Ein grafischer Arbeitsablauf der histopathologischen Diagnose des Lebergewebes und der intraoperativen Diagnose basierend auf Raman-Spektroskopie und einem intelligenten Algorithmus ist in Abb. 1 dargestellt.

Große Raman-Datensätze aus Lebergewebe wurden gesammelt und in ein CNN-basiertes Deep-Learning-Modell eingespeist, um es zu trainieren, Spektraldaten verschiedener Gewebetypen zu unterscheiden. Das Modell wurde dann verwendet, um verschiedene pathologische Arten von Leberkrebsgewebe zu unterscheiden. Darüber hinaus wurden die Raman-Ergebnisse durch Gewebemetabolomik auf Basis von Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) validiert. Darüber hinaus wurden Raman-Bilder verwendet, um die molekulare Zusammensetzung unbearbeiteter menschlicher Gewebeblöcke und Gewebeschnitte zu visualisieren. Schließlich wurde während der Operation ein tragbares Raman-System zur intraoperativen Leberkrebsdiagnose in Echtzeit eingesetzt.

Für die hier berichteten Raman-Messungen wurde eine Anregungswellenlänge von 532 nm verwendet, während für die Analyse biologischer Proben normalerweise längere Wellenlängen empfohlen werden, um Fluoreszenzhintergrundsignale zu vermeiden und eine tiefere Lichteindringung zu erreichen. Im Vergleich zu längeren Wellenlängen (z. B. 633 bzw. 785 nm) lieferten die kürzeren Wellenlängen jedoch eine höhere Datenqualität und ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis für Raman-Spektren (ergänzende Abbildung 1), was teilweise auf die Resonanzverstärkung eines bestimmten Proteins zurückzuführen war und Carotinoid-assoziierte Banden32.

Von 120 Leberkrebspatienten wurden Raman-Spektren von passenden Leberkarzinomgeweben und angrenzenden Nichttumorgeweben aufgenommen. Detaillierte Patienteninformationen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Aufgrund der Heterogenität und Komplexität von Krebsgeweben (Ergänzungsabbildung 2) wurden mindestens 50 Spektren von zufällig ausgewählten Punkten auf der Oberfläche jeder Gewebeprobe gesammelt. Ein Vergleich der durchschnittlichen Raman-Spektren von Karzinom- und Parakarzinom-Gewebeproben ist in Abb. 2a dargestellt. Bei den meisten Gewebeproben wurden 19 charakteristische Raman-Peaks beobachtet. Die Raman-Peaks der beiden Gruppen überlappten sich weitgehend, aber die Intensität jedes Peaks in der Parakarzinom-Gewebegruppe ist deutlich höher als die in der Krebsgewebe-Gruppe (Student-t-Test, P < 0,05). Hierarchisch gruppierte Heatmaps charakteristischer Raman-Peaks wurden aufgezeichnet, um die eng verwandten Raman-Peaks vorab zu unterscheiden (ergänzende Abbildung 3). Ergänzende Tabelle 2 gibt die Peakposition und die entsprechenden repräsentativen Verbindungen der wichtigsten Raman-Schwingungsmoden an, über die in der Literatur berichtet wird33.

a–d Die durchschnittlichen Raman-Spektren von 120 Karzinom- und 120 Parakarzinom-Gewebeproben (a), Krebsgewebeproben von Patienten mit HCC und ICC (b), HCC-Gewebeproben in verschiedenen Tumorstadien (c) und HCC-Gewebeproben mit unterschiedlichem Krebs Zelldifferenzierungsgrade (d). Die schattierten Bereiche stellen die Standardabweichungen des Mittelwerts dar. e und f Typische Fotos von Parakrebsgewebe (links) und Leberkrebsgewebeproben (rechts) (e) und die entsprechenden Bilder der H&E-gefärbten Gewebe (f) von 120 getesteten Proben in dieser Studie. g Raman-Testung von Lebergewebe mit einem Mikro-Raman-Spektrometer. h Die Architektur des VGG-16-basierten Deep-Learning-Modells. Raman-Daten bestehend aus 12.000 Spektren wurden mit 64 Filtern in die anfängliche Faltungsschicht eingespeist. Jede Faltungsschicht hatte eine Kernelgröße von 3 und war mit einer ReLU-Aktivierungsschicht verbunden. In den vollständigen Verbindungsschichten wurde eine Drop-out-Schicht verwendet, die den Grundblöcken folgte. Zwischen Blöcken wurde Max-Pooling (Größe 2, Schritt 2) eingesetzt, um die Datenlänge zu reduzieren. Die Zahlen unter jedem Block beziehen sich auf die Länge bzw. die Anzahl der Ausgabekanäle. i, j Kreuzentropieverlust (i) und Genauigkeit (j) beim iterativen Training des CNN. Die Kreuzentropie stellt den mittleren quadratischen Fehler zwischen dem vorhergesagten Wert und dem wahren Wert dar. k Binäre Verwirrungsmatrizen zur Klassifizierung von vier Gewebekategorien basierend auf dem CNN-Algorithmus in Prozent (%). l ROC-Kurven und entsprechende AUC-Werte. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die meisten Peaks konnten aromatischen Aminosäuren, Proteinen und Carotinoiden zugeschrieben werden. Insbesondere stehen die Peaks bei etwa 749, 1212, 1393, 1547, 1586 und 1602 cm−1 im Zusammenhang mit Tryptophan, Tyrosin bzw. Phenylalanin. Die Bande bei 1637 cm−1 entspricht der C = O-Streckung der Amid-I-Bande. Die Raman-Linien bei 1003, 1156 und 1519 cm−1 repräsentieren die C-C- und C-N-Strecke von Carotinoiden. Es wurde auch berichtet, dass der Peak bei 1003 cm−1 mit AFP, einem Biomarker für hepatozelluläres Karzinom (HCC), assoziiert ist34. Darüber hinaus hängen die Raman-Merkmale, die bei 1081, 1130 und 1304 cm−1 auftreten, hauptsächlich mit Lipiden oder Fettsäuren zusammen. Die Banden bei 674, 974, 1336 und 1356 cm−1 können Nukleinsäuren zugeordnet werden. Darüber hinaus hängt die Raman-Signatur um 835 cm−1 mit Sacchariden zusammen. Solche Unterschiede in den Raman-Spektren zwischen Parakrebs- und Krebsgewebe spiegeln Variationen in den biochemischen Komponenten des Lebergewebes wider, die durch Karzinogenese verursacht werden und eine Grundlage für die Unterscheidung von Krebsgewebe von normalem Gewebe bilden.

Als nächstes wurde die feine histopathologische Differenzierung von Leberkrebs anhand der Raman-Spektroskopie weiter untersucht. Primärer Leberkrebs ist eine der häufigsten Krebsarten weltweit. 75–85 % davon sind hepatozelluläre Karzinome (HCC) bzw. 10–15 % intrahepatische Cholangiokarzinome (ICC)35. Wie in Abb. 2b gezeigt, lagen die größten Unterschiede in der Raman-Signalintensität zwischen der HCC- und der ICC-Gruppe bei Carotinoid-bezogenen Raman-Peaks (1003, 1156 und 1519 cm−1), die in der ICC-Gruppe deutlich höher waren. Im Gegensatz dazu waren die meisten Aminosäure-, Lipid- und Nukleinsäure-bezogenen Peaks, wie 749, 974, 1304, 1356, 1393 bzw. 1586 cm−1, in der HCC-Gruppe höher. Darüber hinaus kann eine genaue Beurteilung des Tumorstadiums und des Differenzierungsgrads bei der Wahl der Behandlungsstrategie und der Prognoseeinschätzung hilfreich sein. Wie in Abb. 2c gezeigt, wurden die primären spektralen Unterschiede zwischen frühen und fortgeschrittenen Stadien bei 1003, 1156, 1519 cm−1 (Carotinoide), 1130 cm−1 (Fettsäuren), 749 und 1547 cm−1 (Tryptophan) gefunden. die in der Gruppe im Frühstadium eine höhere Intensität aufwiesen, während die Peaks im Zusammenhang mit Nukleinsäuren bei 674 und 974 cm−1 und Saccharid bei 835 cm−1 in der Gruppe im fortgeschrittenen Stadium höher waren. Darüber hinaus zeigt die ergänzende Abbildung 4 die Raman-Spektren verschiedener Kategorien der Krebsdifferenzierung. Der spektrale Gesamtunterschied zwischen mäßig und schlecht differenzierten Gruppen war signifikanter als der zwischen gut und mäßig differenzierten Gruppen. Ähnlich wie bei den Unterschieden zwischen Krebs- und Parakrebsgruppen zeigten gut und mäßig differenzierte Gruppen auch eine höhere spektrale Gesamtintensität, insbesondere bei den Carotinoid-bezogenen Peaks (Abb. 2d). Der pathologische Typ jedes Gewebeblocks wurde vom Pathologen anhand der H&E-Färbung nach dem Raman-Test erneut bestätigt (Abb. 2e – g).

Um verschiedene Arten von Lebergewebe mithilfe von Raman-Spektren zu klassifizieren, wurde ein VGG-16-Netzwerk-basiertes CNN-Modell verwendet. Die Modellarchitektur bestand aus 13 eindimensionalen Faltungsschichten, 5 Pooling-Schichten und 3 vollständig verbundenen Schichten (wie in Abb. 2h dargestellt), wobei Faltungskernstapel in kleinem Maßstab anstelle von Faltungskernen in großem Maßstab verwendet wurden, um die erforderlichen Parameter zu reduzieren Berechnungen36. Es wurde eine Raman-Datenbank für Lebergewebe mit 50 Spektren pro Gewebeprobe erstellt und insgesamt 12.000 Spektren aus 120 Paaren von Lebergewebeproben erhalten. Die Spektraldaten reichten von 500 bis 2000 cm−1 mit 889 eindimensionalen Float-Daten. Es wurde ein binäres Klassifizierungsmodell erstellt, um Leberkrebsgewebe und Parakrebsgewebe zu klassifizieren, die jeweils mit 1 und 0 bezeichnet wurden. Die Spektraldaten wurden durch Basisliniensubtraktion und Glättung vorverarbeitet und dann mit einem zufälligen Shuffle in das CNN-Modell eingespeist. Als Aktivierungsfunktion in der Ausgabeschicht wurde die Softmax-Funktion verwendet, die Wahrscheinlichkeiten von zwei Klassen ausgibt, wobei der höhere Wert als vorhergesagte Klasse gilt.

Genauigkeit und Kreuzentropieverlust sind zwei Indikatoren, die häufig zur Beurteilung der Leistung und Zuverlässigkeit von CNN-Modellen verwendet werden. Mit Lerniterationen tendieren die Genauigkeits- und Kreuzentropieverlustkurven des Validierungssatzes allmählich dazu, sich anzunähern, was darauf hindeutet, dass das Modell nicht überanpasst (Abb. 2i, j). Als Ergebnis wurde eine Genauigkeit von 92,6 % für die Schätzung der Karzinomgewebefläche erreicht, begleitet von einer Sensitivität und Spezifität von 90,8 % bzw. 94,6 %.

Darüber hinaus wurden drei weitere CNN-Modelle erstellt, um HCC- von ICC-Geweben sowie zwischen Geweben mit unterschiedlichen Krebsstadien und Differenzierungsgraden zu unterscheiden. Die Leistung von vier binären Modellen ist in den Verwirrungsmatrizen von Abb. 2k dargestellt. Die Tumorheterogenität stellte eine Herausforderung bei der Unterscheidung verschiedener Stadien und Differenzierungsgrade von Tumorgeweben dar, mit Genauigkeiten von 78,3 % bzw. 72,3 %. Bei der Klassifizierung der Leberkrebs-Subtypen HCC und ICC wurde jedoch ein besseres Ergebnis erzielt, das eine Erkennungsgenauigkeit von 82,4 % ergab. Es wurden vier ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) aufgezeichnet, um die Leistung von Klassifikatoren quantitativ zu überprüfen (Abb. 2l), wobei die Werte für die Fläche unter der Kurve (AUC) zwischen 0,783 und 0,965 lagen. Darüber hinaus zeigt der Deep-Learning-Ansatz im Vergleich zu anderen gängigen Algorithmen für maschinelles Lernen, einschließlich PLS-DA, Random Forest und XGBoost, eine überlegene Rechenleistung mit höherer Genauigkeit bei der Gewebeidentifizierung verschiedener pathologischer Typen, insbesondere beim Umgang mit unausgeglichenen Daten (Ergänzungstabelle 3). ).

Es ist erwähnenswert, dass die konventionelle Diagnose von HCC auf der Grundlage eines einzelnen serologischen Biomarkers (wie AFP) in dieser Studie eine geringe Sensitivität erzielte. Bei einem AFP-Schwellenwert von 200 ng/ml waren 25 von 92 HCC-Patienten positiv, mit einer Sensitivität von nur 27,2 % (ergänzende Abbildung 5), viel niedriger als unsere auf Raman-Messungen basierende Methode. Darüber hinaus werden bildgebende Verfahren wie CT und MRT als erste diagnostische Methoden empfohlen, um verschiedene pathologische Zustände von HCC zu identifizieren oder vorherzusagen37,38. Beispielsweise wird das klinische Stadieneinteilung des HCC hauptsächlich auf der Grundlage bildgebender Merkmale diagnostiziert, darunter die Anzahl und Größe der HCC-Knötchen sowie das Vorliegen einer Gefäßinvasion. Hier haben Raman-Spektren auch die Möglichkeit gezeigt, die mikrovaskuläre Invasion mit einer Genauigkeit von 67 % und einem AUC-Wert von 0,694 anhand von 84 Patienten zu bestimmen (ergänzende Abbildung 6). Die Ergebnisse können durch eine weitere Erhöhung der Probenzahlen und Spektralsammlungen verbessert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Raman-Spektroskopie in Bezug auf die Genauigkeit mit herkömmlichen Bildgebungsmodalitäten (wie CT, MRT und US) bei der Identifizierung verschiedener Pathologietypen in der aktuellen Studie vergleichbar oder besser ist als diese (Ergänzungstabelle 4) und eine leistungsstarke Ergänzung zu bestehenden darstellt Pathologische Diagnosetechniken.

Um Veränderungen in der biochemischen Zusammensetzung von Leberkrebsgeweben weiter zu bestätigen, wurde eine nicht zielgerichtete Metabolomics-Strategie basierend auf Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) eingesetzt. Die Gewebemetabolomik wird häufig bei der Untersuchung der Pathogenese von Krankheiten auf der Grundlage metabolischer Eigenschaften39,40 eingesetzt. Sie kann direkte Informationen über Stoffwechselveränderungen an bestimmten Stellen liefern und relevante Tumorbiomarker aufdecken. In dieser Studie wurden insgesamt 25 Paare passender HCC-Gewebe und angrenzender Nicht-Tumorgewebe untersucht. 1995 und 2228 Ionen wurden im positiven bzw. negativen Elektrospray-Ionisationsquellenmodus (ESI+ und ESI−) zurückgehalten (Ergänzungsdaten 1), nachdem Abweichungen und fehlende Werte entfernt wurden. Insgesamt wurden 57 Metaboliten im ESI+-Modus und 51 im ESI−-Modus identifiziert und als mögliche Differenzialmetaboliten ausgewählt (Supplementary Data 2). Die Unterschiede zwischen neun Arten von Primärmetaboliten und der hierarchisch gruppierten Heatmap von 108 spezifischen metabolischen Biomarkern zwischen HCC-Geweben und angrenzenden Nicht-Tumorgeweben wurden in Abb. 3a und b dargestellt. Die meisten Metaboliten zeigten in HCC-Geweben einen Abwärtstrend, was mit der geringeren Raman-Intensität in HCC-Geweben übereinstimmt.

a Verteilungen der relativen Häufigkeit für neun Arten unterschiedlicher Metaboliten zwischen HCC-Gewebeproben und passenden benachbarten Nicht-Tumor-Gewebeproben im Verhältnis zur mittleren relativen Häufigkeit in den Nicht-Tumor-Geweben. i–ix stellen Metaboliten von Tyrosin (i), nichtaromatischen Aminosäuren (ii), Fettsäuren (iii), mit PUFA markierten PCs (iv), mit SFA und MUFA markierten PCs (v), Carnitinen (vi) und Nukleosiden dar (vii), Basen und ihre Derivate (viii) und Saccharide (ix). b Hierarchisch geclusterte Heatmap von 108 signifikant unterschiedlichen Metaboliten zwischen HCC-Geweben und angrenzenden Nicht-Tumor-Geweben basierend auf dem euklidischen Abstand. Die Blöcke wurden entsprechend den relativen Expressionsniveaus der Metaboliten gefärbt. Lila zeigt einen hohen Ausdruck an; Hellorange weist auf eine geringe Expression hin. c Unterschiedlicher Gehalt an aromatischen Aminosäuren (Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan) zwischen HCC-Geweben und angrenzenden Nicht-Tumorgeweben. In der Parakrebsgruppe wurde ein signifikanter Anstieg des Tyrosins beobachtet (zweiseitiger Student-T-Test, P < 0,05) und es wurden auch höhere Werte von Tryptophan und Phenylalanin beobachtet, aber die Veränderungen waren nicht signifikant (zweiseitiger Student-T-Test). , P > 0,05). Boxplots zeigen Mittelwert, Median und untere/obere Quartile; Schnurrhaare zeigen innere Zäune. d Gehalt an repräsentativen Phosphatidylcholinen (i), Nukleosiden, Basen und Sacchariden (ii) mit signifikanten Unterschieden zwischen HCC-Geweben und angrenzenden Geweben. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. HCC-Gewebe, n = 25, angrenzende Gewebe, n = 25. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Beispielsweise wurde in HCC-Geweben eine signifikante Herunterregulierung von Tyrosin beobachtet, während die anderen beiden aromatischen Aminosäuren (ArAAs), Phenylalanin und Tryptophan, keine signifikanten Veränderungen aufwiesen (Abb. 3a(i) und Abb. 3c). Wir fanden jedoch einen Rückgang anderer aromatischer Verbindungen in HCC-Geweben, einschließlich Dopa, 3-Hydroxyanthranilsäure und Anilin, was darauf hindeutet, dass Variationen in den Benzolring-bezogenen Raman-Banden aus Lebergeweben auch von ArAA-Derivaten oder anderen aromatischen Metaboliten herrühren könnten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass auch die meisten nichtaromatischen AAs wie β-Alanin, Glycin, Asparagin, Glutathion und Threonin in HCC-Geweben abnehmen (Abb. 3a (ii)). Allerdings stieg der Argininspiegel in der HCC-Gruppe an, was auf die Unterdrückung des Arginin abbauenden Enzyms Arginase I (ARG1) zurückzuführen sein könnte, und es wurde auch berichtet, dass Arginin das Tumorwachstum fördert41.

Die Leber ist der Hauptstandort für die Synthese von Lipiden und Fettsäuren. Eine Hepatozytenschädigung kann die Leberfunktion beeinträchtigen und zu einer Störung des Fettstoffwechsels führen42. Mit Ausnahme von Eicosadiensäure und Nervonsäure sind beispielsweise die meisten Fettsäuren, insbesondere mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs), in HCC-Geweben herunterreguliert (Abb. 3a (iii)). Darüber hinaus ist Phosphatidylcholin (PC) ein wichtiger Bestandteil der Zellmembranen und kann durch reaktive Sauerstoffspezies oxidiert werden43. In dieser Studie waren die Mengen an mit PUFAs markierten PCs in der HCC-Gruppe signifikant reduziert (Abb. 3a(iv)), was möglicherweise auf die Oxidation von PUFAs bei hohem oxidativem Stress im Krebsgewebe zurückzuführen ist, was zu a führte weiterer Anstieg von PCs, die mit gesättigten Fettsäuren (SFAs) oder einfach ungesättigten Fettsäuren (MUFAs) markiert sind (Abb. 3a (v) und Abb. 3d (i)). Darüber hinaus wurde ein Anstieg langkettiger Acylcarnitine und ein Rückgang kurz- oder mittelkettiger Acylcarnitine wie Propionylcarnitin und Hexanoylcarnitin beobachtet (Abb. 3a(vi)).

Hepatozyten spielen eine wesentliche Rolle und sind typischerweise am Nukleotidstoffwechsel beteiligt. Es wurde auch eine Störung einiger Nukleoside, Basen und verwandter Metaboliten beobachtet (Abb. 3a (vii – viii)), die hauptsächlich mit dem Purinstoffwechsel zusammenhängt. Purinmetaboliten, die an DNA- und RNA-Synthesen beteiligt sind, sind entscheidend für die Förderung des Überlebens und der Zellproliferation44. Mit Ausnahme von Inosin zeigten die meisten Purinmetaboliten in der HCC-Gruppe eine Herunterregulierung, einschließlich Xanthin, Hypoxanthin, Stoffwechselenzyme45.

Die meisten Saccharide und verwandten Metaboliten wie D-Ribose, D-Sedoheptulose, D-Glucuronsäure, D-Tagatose und Saccharose wurden in HCC-Geweben signifikant herunterreguliert (Abb. 3a (ix) und d (ii)). Allerdings wurde in der HCC-Gruppe ein hoher Spiegel des Glykolyse-Metaboliten Glucose-6-phosphat beobachtet, während Metaboliten des Tricarbonsäurezyklus (TCA), einschließlich Fumarsäure und Bernsteinsäure, herunterreguliert wurden, wie bereits berichtet46. Die Veränderungen dieser energiebezogenen Metaboliten deuten auf einen schnellen Glukoseverbrauch durch erhöhte aerobe Glykolyse in Krebszellen hin, was auf den Warburg-Effekt zurückzuführen sein könnte47.

Darüber hinaus wurde beobachtet, dass mehrere Metaboliten in HCC-Geweben signifikant anstiegen, darunter Glutathion, 5'-Methylthioadenosin, 3,4,5-Trimethoxyzimtsäure, Oxoadipinsäure und 2-Oxoarginin, die das Potenzial haben, Biomarker für Leberkrebs zu sein Screening (Abb. 3b und ergänzende Daten 2). Um die oben genannten Metabolitenunterschiede intuitiver vergleichen zu können, sind in der ergänzenden Abbildung 7 die relativen Veränderungen in der Darstellung von HCC-Proben gegenüber den jeweiligen angrenzenden Geweben dargestellt. Darüber hinaus wurde die Vorhersagekraft der Metabolomik auch mit dem CNN-Modell untersucht, das für die Spektralanalyse zur Unterscheidung von HCC-Geweben verwendet wurde aus angrenzendem Nichttumorgewebe. Die Genauigkeit liegt zwischen 70 % und 80 % und ist damit niedriger als die Ergebnisse der Spektralanalyse. Die Genauigkeit kann jedoch durch eine Erhöhung der Anzahl der Proben verbessert werden.

Aufgrund der Heterogenität der Tumorgewebe und der Unterschiede zwischen den Patienten sind Abweichungen in den Raman-Daten zwischen den Gewebeproben unvermeidlich (ergänzende Abbildung 2), was eine Herausforderung für die Gesamtunterscheidung verschiedener Gewebe darstellt. Bei gepaartem Leberkrebs und angrenzendem Nichttumorgewebe desselben Patienten konnten jedoch in den meisten Proben leicht Unterschiede in der Raman-Intensität beobachtet werden. Daher schlagen wir vor, dass die hier beschriebene Technologie des markierungsfreien Spektrums geeignete Bildanalysealgorithmen integrieren kann, um Krebsränder sichtbar zu machen und die intraoperative Tumorabgrenzung zu erleichtern.

Um dies zu testen, wurden zwei Leberkrebs-Gewebeblöcke für das Raman-Scanning ausgewählt. Wie in Abb. 4a und b gezeigt, bestätigten die beiden Leberkrebsblöcke und die entsprechenden H&E-gefärbten Bilder das Vorliegen einer Hepatozytenkanzerisierung, bei der der Leberstrang eine ungeordnete Anordnung mit erhöhter Zelldichte und erhöhtem Kern-/Zytoplasma-Verhältnis aufwies. Hellfeldbilder für die Kartierungstestregion des Leberkrebsgewebes sind in Abb. 4c dargestellt. Mithilfe der LiveTrack-Technologie wurde die Probenhöhe kontinuierlich angepasst, um die Probe im Fokus zu halten. Während der Raman-Messungen wurden Daten zur Oberflächenhöhe aufgezeichnet. In Abb. 4c sind dreidimensionale (3D) Oberflächenprofilbilder der beiden Gewebeproben mit maximalen Höhenunterschieden von 38,2 bzw. 27,4 µm dargestellt. Die Raman-Bilder wurden mit Algorithmen zur selbstmodellierenden Kurvenauflösung (SMCR) und zur hierarchischen Clusteranalyse (HCA) analysiert. Die SMCR-Methode könnte den unbekannten Raman-Mapping-Datensatz in die Spektren reiner Komponenten auflösen und gleichzeitig Konzentrationsbilder und reines Spektrum liefern (wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben). Basierend auf der SMCR-Methode wurden qualitativ hochwertige Bilder erhalten (Abb. 4d). In der ersten Gewebeprobe war eine deutliche Grenze der Krebsregion zu erkennen, wobei die Karzinom- und Leberparenchymregionen erfolgreich unterschieden werden konnten, wie in verschiedenen Pseudofarben dargestellt. Die Tumorgrenzen waren in der Raman-Bildgebung nicht glatt (Abb. 4d und e, oberes Feld), wahrscheinlich aufgrund der dünnen Tumorkapsel und des kleinen Bildgebungsbereichs (50 × 50 μm) mit Scanintervall im Mikrometerbereich (2 μm). Das zweite Gewebe zeigte im dargestellten Bereich eine relativ schwach ausgeprägte Krebsgrenze (Abb. 4d und e, unteres Feld), die sich mit dem Leberparenchym vermischte, was wahrscheinlich auf das Vorhandensein einer krebsartigen Infiltration zurückzuführen war, die auf Hellfeldbildern kaum erkennbar war. Diese Krebsläsionen wurden durch H&E-Färbung bestätigt (Abb. 4b). HCA war eine weitere chemometrische Methode, die hier verwendet wurde, um eine Reihe von Spektren auf abstraktere Weise zu Clustern mit ähnlichen Spektren zu kombinieren. Die Ergebnisse der von HCA abgeleiteten Bilder (Abb. 4e) stimmen mit denen überein, die mit SMCR verarbeitet wurden (Abb. 4d), was auf die Zuverlässigkeit der Bildverarbeitungsalgorithmen hinweist.

a Fotos von zwei ausgewählten Leberkrebsblöcken; Pfeile zeigen auf die Positionen der Raman-Bildgebungsregionen. b Die lokalen H&E-gefärbten Bilder der beiden Lebergewebe und die weißen Kästchen in der unteren Reihe sind die ungefähren Raman-Bildgebungsbereiche. c Hellfeldbilder (50 × 50 µm) des Mapping-Testbereichs (links) und entsprechende 3D-Oberflächenprofilbilder, erstellt mit LiveTrack-Technologie (rechts) von zwei Proben. d, e SMCR-abgeleitete (d) und HCA-abgeleitete (e) Raman-Bilder zeigen Krebsränder für die Lebergewebeproben. f Typische Spektren, die von den in (d) angegebenen Punkten 1–8 gesammelt wurden; Die Punkte 1, 2, 5 und 6 stammen aus den mutmaßlichen Parakarzinom- oder Nichttumorregionen und die Punkte 3, 4, 7 und 8 stammen aus den mutmaßlichen Karzinomregionen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die spektrale Variation in verschiedenen Oberflächenregionen des Lebergewebes weiter zu demonstrieren, haben wir Spektren (Abb. 4f) von mehreren Stellen gesammelt, die in Abb. 4d mit Pfeilspitzen markiert sind. Die Punkte 1, 2, 5 und 6 wurden aus mutmaßlichen Parakarzinom- und Nichttumorregionen gesammelt und zeigten in beiden Gewebeblöcken eine höhere Raman-Intensität als die aus mutmaßlichen Karzinomregionen (Punkte 3, 4, 7 und 8) gesammelten. Dieser Unterschied in der Raman-Signatur bildet eine Grundlage für die Erkennung durch Bildalgorithmen und unterstützt unsere anfängliche Erwartung einer hochpräzisen Erkennung von Tumorrändern mithilfe der Raman-Technik. Darüber hinaus können größere Raman-Bilder auch durch die Verwendung eines Objektivs mit geringer Vergrößerung und/oder durch Erhöhen des Scanintervalls mithilfe des leistungsstarken Bildalgorithmus erhalten werden (ergänzende Abbildung 8).

Um die klinisch-pathologischen und diagnostischen Möglichkeiten der Raman-Spektroskopie zu überprüfen, verwendeten wir ein Mikro-Raman-Spektrometer, um ungefärbte menschliche Lebergewebeschnitte mit einer Dicke von 5 µm abzubilden. Wir haben zunächst Originalspektren im Bereich von 2000–3400 cm−1 aufgenommen (Abb. 5a). Die Gewebespektren enthielten einen markanten Peak bei 2930 cm−1, der mit der CH3-Streckung in Proteinen zusammenhängt48. Darüber hinaus wurden mehrere charakteristische Raman-Peaks im Zusammenhang mit Lipiden bei 2855, 2885 und 3007 cm−1 nachgewiesen, die auf die symmetrische CH2-Schwingung von Lipiden, die Fermi-Resonanz oder asymmetrische Schwingung von CH2 in gesättigten geraden langen Acylketten und ungesättigten zurückzuführen sind =CH-Streckung in Acylketten49. Die Raman-Bildaufnahme im StreamHR-Modus wurde am ungefärbten Leberkrebs und angrenzenden Gewebeschnitten mit einer Auflösung von 0,8 µm in den beiden axialen Richtungen durchgeführt. An den Raman-Kartierungsdaten wurde eine multivariate Analyse durchgeführt, um räumliche Verteilungskarten der wichtigsten chemischen Komponenten der Gewebe zu rekonstruieren. Die Raman-Spektren reiner Proteine ​​und Lipide wurden ebenfalls mit dem SMCR-Algorithmus aufgelöst (Abb. 5a). SMCR-rekonstruierte Konzentrationskarten von Proteinen und Lipiden in normalem Lebergewebe sind in Abb. 5b bzw. c dargestellt. Um ihre relative räumliche Verteilung besser zu verstehen, ist in Abb. 5d ein Farbüberlagerungsbild beider dargestellt.

ein typisches Raman-Spektrum von Lebergewebeschnitten im Bereich von 2000–3400 cm−1 (violette Linie); Die Raman-Spektren von reinem Protein (blaue Linie) und Lipiden (gelbe Linie) werden ebenfalls vom SMCR-Algorithmus aufgelöst. Der Raman-Peak bei 2930 cm-1 (Pfeil 3) steht im Zusammenhang mit Protein, und Peaks um 2855 cm-1 (Pfeil 1), 2885 cm-1 (Pfeil 2) und 3007 cm-1 (Pfeil 4) sind charakteristisch für Lipide. b–d SMCR-rekonstruierte Konzentrationskarten von Lipiden (b) und Proteinen (c) in normalem Lebergewebe; d ist eine Überlagerung der beiden. Um die beiden Bilder zusammenzuführen, wurde der minimale LUT-Wert von Gelb (Lipide) angepasst. e–i Hellfeldbilder des Mapping-Testbereichs und entsprechende H&E-gefärbte, SMCR-abgeleitete Raman-Bilder sowie entsprechende 3D-Oberflächenprofilbilder von normalem Lebergewebe (e). f–i zeigen andere Geweberegionen mit typischen Morphologien, einschließlich Kanzerisierung (f), Steatohepatitis (g), Fibrose (h) und Bindegewebe (i). Alle Maßstabsbalken sind 10 µm groß.

Als nächstes wurden Raman-Bilder von typischem normalem Leberparenchym (Abb. 5e) und Krebsbereichen (Abb. 5f) verglichen. Die Overlay-Raman-Bilder von Proteinen und Lipiden sowie die entsprechenden 3D-Oberflächenprofilbilder, Hellfeldbilder und H&E-gefärbten Bilder des Testbereichs sind in Abb. 5e und f dargestellt. Die vom SMCR-Algorithmus abgeleiteten Bilder zeigten eine klare subzelluläre Struktur in Pseudofarben und zeigten Variationen in der Lipid- und Proteinkonzentration. In normalem Lebergewebe lagen Proteine ​​in der Kernregion in höheren Konzentrationen vor, und Lipide waren hauptsächlich in den peripheren Regionen der Leberzellen verteilt. Während in Krebszellen Proteine ​​hauptsächlich in der Nähe der Zellmembran verteilt sind und weniger im Zellinneren. Es ist erwähnenswert, dass solche Unterschiede in der räumlichen Verteilung biochemischer Komponenten in H&E-gefärbten Bildern typischerweise schwer zu erkennen sind. Darüber hinaus wurden in den Raman-Bildern auch typische Veränderungen während der Transformation von Krebszellen beobachtet, wie die unregelmäßige Anordnung der Hepatozyten und ein größeres Kern-/Zytoplasma-Verhältnis, was mit Hellfeldern und H&E-Färbung übereinstimmt. Zusätzlich zur planaren Bildgebung wurden 3D-Oberflächenprofilbilder erhalten, die Informationen über die chemische Zusammensetzung mit der Topographie der Gewebeoberfläche kombinierten.

Zusätzlich zu normalem und krebsartigem Gewebe wurden Raman-Scans an mehreren anderen Geweberegionen mit typischen Morphologien durchgeführt, darunter Steatohepatitis, fibrotisches Gewebe und Bindegewebe (Abb. 5g – i). Diese Raman-Bilder zeigten verschiedene morphologische Merkmale von Zellen und Geweben, wie Fetttröpfchen und Filamentfasern, die mit den entsprechenden Hellfeld- und gefärbten Bildern übereinstimmten. Alle einzelnen SMCR-rekonstruierten Konzentrationskarten von Proteinen und Lipiden in Gewebeschnitten sind in der ergänzenden Abbildung 9 dargestellt. Zusätzlich zur zweidimensionalen (2D) histochemischen Bildgebung auf der Gewebeoberfläche haben wir auch „Z-Stapel“-Bilder in drei Dimensionen erstellt durch Raman-Spektroskopie. Ergänzende Abb. 10 zeigt rekonstruierte 3D-Bilder der fünf Gewebeschnitte in Abb. 5. Die Bilder wurden aus einem Sechs-Z-Schnitt-Stapel (5 µm-Scheiben) rekonstruiert, wobei jede Ebene 50 µm × 3 µm abdeckte, was eine größere histochemische Tiefe lieferte Informationen zu den Gewebeproben. In dieser Studie betrug die maximale Nachweistiefe von Lebergewebe durch konfokale Raman-Spektroskopie unter einem 532-nm-Laser etwa 200 µm (ergänzende Abbildung 11). Für eine tiefere Gewebedetektion kann die Integration der räumlich versetzten Raman-Spektroskopie (SORS) angewendet werden, um eine Tiefendetektion im Zentimeterbereich zu erreichen50.

Nachdem wir die Leistung der Raman-Spektroskopie bei der Diagnose und Bildgebung von Lebergewebe in vitro validiert hatten, untersuchten wir weiter ihre Machbarkeit für die intraoperative Leberkrebsdiagnose in Echtzeit. Ein speziell angefertigtes tragbares Raman-Spektroskopiesystem wurde intraoperativ zur Erkennung von Leberkarzinomen eingesetzt. Das System bestand aus einem fasergekoppelten Laser bei 785 nm, einer Handsonde und einem Faserspektrometer (Details im Abschnitt „Methoden“ beschrieben). Das Spektrometer war mit einer Erfassungssoftware an einen Personalcomputer angeschlossen und gab Informationen über den molekularen Inhalt des Zielgewebes aus. Während des Betriebs war die Sonde außerdem mit einer sterilen Einwegschutzhülle abgedeckt, die einen vernachlässigbaren Einfluss auf das gemessene Raman-Spektrum hatte (ergänzende Abbildung 12).

Abbildung 6 zeigt die durchschnittlichen Raman-Spektren von Lebergewebe, die aus intraoperativen In-vivo-Messungen erhalten wurden. Die Sonde wurde über die Gewebeoberfläche gehalten, um Raman-Signale an mehreren zufällig ausgewählten Punkten im Karzinom und angrenzenden Nichttumorregionen zu messen. Die gesamte Raman-Spektralintensität der Nichttumorregion war deutlich höher als die der Tumorregion. Dies steht im Einklang mit In-vitro-Testergebnissen, obwohl es einen Unterschied zwischen den Gewebespektren gibt, die mit dem tragbaren Raman-Spektrometer und dem Mikro-Raman-Spektrometer erfasst wurden (ergänzende Abbildung 13). Die primären spektralen Unterschiede zwischen Tumor- und Nichttumorregionen liegen in den proteinbezogenen Peaks bei 640, 976, 1024, 1540 und 1635 cm−1 und den lipidbezogenen Peaks bei 413, 775, 1314, 1381 und 1436 cm− 1 und mit Nukleinsäuren assoziierte Peaks bei 689, 1094 und 1514 cm−1. Da mehr intraoperative Spektraldaten erfasst werden, können diese Spektralunterschiede in Kombination mit geeigneten Algorithmen dabei helfen, Tumor- und Leberparenchymregionen in der Operation zu unterscheiden, und weitere intraoperative Raman-Mapping-Techniken könnten die Visualisierung von Tumorgrenzen ermöglichen.

Die durchschnittlichen Raman-Spektren von intraoperativen In-vivo-Messungen für Karzinom- und Parakarzinomgewebe wurden von sechs Patienten gesammelt. Die Spektren wurden mit einem tragbaren Raman-Spektrometersystem erfasst, das mit einem 785-nm-NIR-Laser und einem computergesteuerten CCD-Spektrometer ausgestattet war. Die schattierten Bereiche stellen Standardabweichungen der Mittelwerte dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Raman-Spektroskopie hat das Potenzial, ein vielseitiges Werkzeug für die histopathologische Diagnose von Leberkrebs zu sein, da sie eine schnelle Erkennung und hohe chemische Spezifität auf der Grundlage intrinsischer molekularer Schwingungssignale ermöglicht. Insbesondere zeigten die Spektren von Leberkrebs insgesamt eine schwächere Intensität als diejenigen, die von benachbarten Nicht-Tumorgeweben gesammelt wurden, und es wurden auch unterschiedliche Raman-Muster in verschiedenen pathologischen Geweben beobachtet, was die Komplexität des biochemischen Stoffwechsels bei der Progression von Leberkrebs widerspiegelte51. Um die Unterschiede dieser biochemischen Komponenten zwischen HCC-Geweben und angrenzenden Geweben zu bestätigen, wurde eine Metabolomik-Analyse auf der Grundlage von LC-MS durchgeführt, die ergab, dass die meisten Metaboliten in HCC-Geweben einen Abwärtstrend aufwiesen, wie z. B. die meisten Aminosäuren, Lipide und Nukleinsäuren PCs, die mit SFAs oder MUFAs gekennzeichnet sind, haben zugenommen. Das Ergebnis stimmte mit dem der Raman-Analyse überein und zeigte, dass die Raman-basierte Metabolomik, auch bekannt als Ramanomics52, im Vergleich zur herkömmlichen Metabolomik umfassende und zuverlässige biologische Informationen liefern und verschiedene pathologische Gewebe bequemer und kostengünstiger ohne zusätzliche Verbrauchsmaterialien unterscheiden kann.

Darüber hinaus wurde ein VGG-16-basiertes CNN-Modell erstellt und erfolgreich zur Unterscheidung zwischen Raman-Spektren, die aus Leberkarzinomgeweben und benachbarten Nichttumorgeweben gesammelt wurden, sowie zur Erkennung verschiedener pathologischer Lebergewebe, einschließlich verschiedener Subtypen, Tumorstadien usw., eingesetzt Differenzierungen. Die Ergebnisse zeigten, dass Raman-Spektroskopie in Kombination mit Deep Learning Spektralmuster in verschiedenen pathologischen Proben genau erfassen und identifizieren kann. Darüber hinaus planen wir, in der Folgearbeit auch die Unterscheidung von HCC-Vorläufern und nichtmalignen Leberläsionen zu untersuchen, sowie die Unterscheidung zwischen primärem und sekundärem Leberkrebs, die für die Behandlung und Prognose des Leberkarzinoms von entscheidender Bedeutung ist.

Basierend auf den Raman-Spektralunterschieden kann die Zellmorphologie von Gewebeschnitten markierungsfrei dargestellt werden. Die SMCR-aufgelösten Raman-Bilder konnten nicht nur räumliche Verteilungen, sondern auch eine quantitative Identifizierung der wichtigsten biochemischen Komponenten (Proteine ​​und Lipide) von Zellen und Geweben auf subzellulären 2D- und 3D-Maßstäben zeigen, die mit Standard-H&E-Färbemethoden nicht anwendbar sind. Dies weist darauf hin, dass die subzelluläre Raman-Analyse ein großes Potenzial zur Vereinfachung der Krebsdiagnose in klinischen Studien bietet und eine Perspektive für die histopathologische Diagnose bietet.

Klinisch ist die chirurgische Resektion eine Standardmethode zur Krebsbehandlung. Eine genaue Identifizierung der Tumorgrenzen ist hilfreich für die vollständige Resektion von Läsionen ohne übermäßige Resektion von normalem Gewebe, insbesondere für die Resektion von Lebermetastasen. Für Chirurgen ohne geeignete intraoperative Methoden zur visuellen Unterscheidung der beiden Gewebe stellt dies jedoch oft eine Herausforderung dar. Wir verwendeten Raman-Spektroskopie sowohl bei Ex-vivo- als auch bei In-vivo-Messungen für Lebergewebe, die durch unterschiedliche pathologische Muster gekennzeichnet sind. Bilder, die mit deutlichen Krebsrändern aufgenommen wurden, waren anhand der Spektralunterschiede zwischen Tumor- und Leberparenchymregionen sichtbar. Darüber hinaus haben wir erfolgreich die Eignung des tragbaren Raman-Spektrometers zur Unterscheidung von Tumoren von Nicht-Tumorregionen während der Operation überprüft. Diese legen nahe, dass die Raman-Technik das Potenzial hat, Chirurgen bei der schnellen Analyse von interessierenden Regionen während der Operation zu unterstützen, ohne Unterbrechungen oder Verzögerungen durch intraoperative Gefrierschnitte oder H&E-Färbung53.

Es ist bemerkenswert, dass Raman-Spektren von Gewebe, die mit dem tragbaren Raman-Spektrometer gesammelt wurden, von denen des Mikro-Raman-Spektrometers abweichen, insbesondere an einigen Peakpositionen (ergänzende Abbildung 13). Dies kann auf Unterschiede zwischen den beiden Arten von Spektralgeräten wie Laserquellen, Laserleistung und -wellenlänge sowie Spektrometer zurückzuführen sein. Ein ähnliches Ergebnis wurde auch bei der Raman-Detektion von Maustumoren mit einem tragbaren Raman-Gerät54 beobachtet. Obwohl es Unterschiede in den von den beiden Geräten gemessenen Raman-Daten gab, hatte dies keinen Einfluss auf die Fähigkeit der Raman-Spektroskopie, Krebsgewebe von benachbartem normalem Gewebe zu unterscheiden.

Darüber hinaus bedarf die praktische Anwendung der Raman-Spektroskopie als klinisches Instrument noch weiterer Erforschung und Optimierung. In dieser Forschung ist das von Lebergewebeblockaden abgeleitete Raman-Signal hoch genug, um für die Diagnose erkannt zu werden. Daher waren für die Raman-Signalverstärkung keine metallischen Nanopartikel erforderlich, wodurch das Risiko einer Metallpartikeltoxizität und -ausscheidung in klinischen Anwendungen vermieden wurde55,56. Einer der Hauptmängel der spontanen Raman-Spektroskopie ist jedoch die relativ geringe Signalintensität, die einen Kompromiss zwischen Bildqualität und kurzer Aufnahmezeit erforderlich macht. Dies könnte durch die Kombination der kohärenten Raman-Spektroskopie gelöst werden, die auf nichtlinearen optischen Effekten basiert und gleichzeitig für hohe Geschwindigkeit und hohe räumliche Auflösung in der Raman-Spektralbildgebung verwendet werden kann48,57. Darüber hinaus können die begrenzten spektralen Sammelpunkte mit der tragbaren Raman-Sonde dazu führen, dass Läsionen während der Operation fehlen, während die Atemschwankungen die Spektralqualität beeinträchtigen können, obwohl die Raman-Integrationszeit mehr als zehnmal kürzer als die Atemperiode ist. Wir hoffen, in unserer Folgearbeit zeigen zu können, dass ein intelligentes Roboterkollaborationssystem zur Unterstützung der intraoperativen Raman-Bildgebung eingesetzt werden kann, um solche Probleme zu lösen. Darüber hinaus hat die Entwicklung integrierter tragbarer Diagnosegeräte die präzisere und komfortablere Entfernung von interessierenden Regionen während einer Krebsoperation ermöglicht58. Mit dem Aufkommen dieser neuen Instrumente ist jedoch auch die Standardisierung der Instrumente für alle Benutzer ein Problem29, und Faktoren wie Anregungswellenlänge, Laserleistung, Spektrumsammlertyp sowie Datenverarbeitungsalgorithmen sollten standardisiert werden. Daher besteht die Hoffnung, dass bald ein praktisches Raman-Spektroskopiesystem mit einem Normalisierungskriterium für die genaue Diagnose entwickelt wird, um dessen klinische Einführung zu erleichtern.

Obwohl die aktuelle Arbeit im Zusammenhang mit Leberkarzinomen durchgeführt wurde, könnte der gleiche Ansatz zur Beurteilung ähnlicher histologischer Merkmale von Tumoren in anderen Organen verwendet werden. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass die Raman-Technik in Verbindung mit intelligenten Algorithmen für die Diagnose von Leber- und anderen Tumorarten eingesetzt werden könnte und möglicherweise eine Rolle bei der pathologischen Identifizierung und intraoperativen Führung spielt.

Alle aktuellen Forschungsmethoden wurden gemäß den Richtlinien durchgeführt, die von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Wenzhou Medical University genehmigt wurden (Ethikgenehmigung Nr. 2020213). Von allen Patienten, für die die Risiken und Vorteile der Studie detailliert beschrieben wurden, wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

In der vorliegenden Studie wurden insgesamt 240 Gewebeproben mit paarweisem Leberkrebs und angrenzenden nicht-tumorösen Gewebeblöcken von 120 Patienten mit primärem Leberkrebs entnommen, von denen bei 98 Personen ein hepatozelluläres Karzinom (HCC) und bei 22 ein intrahepatisches Cholangiokarzinom diagnostiziert wurde (ICC). Detaillierte Informationen zu den klinischen und histopathologischen Diagnosen der 120 Patienten finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. Die diagnostischen Ergebnisse der Patienten, einschließlich Krebstyp, Krebsstadium und Differenzierungstyp, wurden auf der Grundlage verwandter klinischer und pathologischer Indikatoren4 von Ärzten des First Affiliated Hospital bestätigt der Medizinischen Universität Wenzhou.

Nach der chirurgischen Resektion und Untersuchung wurden alle Proben im Kühlschrank bei –80 °C gelagert. Vor den Spektralmessungen wurden Gewebeblöcke auf einen Objektträger gelegt und Wasser von der Gewebeoberfläche mit Seidenpapier absorbiert. Um die weitere Anwendung bei der intraoperativen Erkennung und Bildgebung zu erleichtern, wurde eine minimale Probenverarbeitung angewendet. Die aus Krebsgewebe und angrenzendem Nichttumorgewebe entnommenen Gewebeblöcke wurden von Pathologen anhand der H&E-Färbung erneut bestätigt.

Für die Abbildung von Gewebeschnitten wurden Gewebeschnitte mit einer Dicke von 5 µm mit einem Gefriermikrotom präpariert und die Schnitte für Raman-Messungen auf Objektträgern befestigt. Das gleiche Gewebe wurde durch H&E-Färbung nach Raman-Messungen beobachtet.

Raman-Spektren von Gewebeproben wurden mit einem Mikro-Raman-Spektrometer (Renishaw, Gloucestershire, UK) unter Verwendung eines Anregungslasers bei 532 nm erhalten. Der Laserstrahl wurde durch ein L×50-Objektiv (numerische Apertur (NA) = 0,50, Arbeitsabstand (WD) = 8,2 mm) auf die Probenoberfläche fokussiert. Jedes Spektrum wurde über 3 s bei 5 % (1,25 mW cm−2) Laserleistung integriert. Mindestens 50 Spektren im Bereich von 500–2000 cm−1 wurden von zufällig ausgewählten Punkten auf der Oberfläche jeder Gewebeprobe gesammelt. Vor der statistischen Analyse wurden die Spektraldaten mit der Software WIRE 5.3 mit Basisliniensubtraktion und Savitzky-Golay-Glättung verarbeitet, um den Fluoreszenzhintergrund zu entfernen und das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.

Bei der Raman-Bildgebung von Gewebeblöcken zur Abgrenzung von Tumorrändern wurden Raman-Spektren auch mit einem L×50-Objektiv (NA = 0,50, WD = 8,2 mm) aufgenommen, das mit einem 532-nm-Laser, einer Laserleistung von 2,5 mW cm-2 und 2 ausgestattet war s Belichtungszeit für jeden Datenpunkt. Die Raman-Scans wurden mit einer Auflösung von 2 μm in x- und y-Richtung (StreamHR-Modus) aufgenommen, was eine schnelle Sammlung von Spektren mit hoher räumlicher Auflösung ermöglicht. Um eine Beeinträchtigung der Qualität der Raman-Analyse mit hoher Vergrößerung aufgrund unebener Oberflächen von Gewebeproben während der Bildgebung zu vermeiden, wurde die LiveTrack-Fokusverfolgungstechnologie verwendet, um während der Bildaufnahme automatisch auf die Probenoberfläche zu fokussieren.

Bei der Raman-Bildgebung von Gewebeschnitten wurden Raman-Spektren mit einer höheren Auflösung von 0,8 μm in beiden axialen Richtungen, mit einer Laserleistung von 12,5 mW cm-2 und einer Belichtungszeit von 0,5 s für jeden Datenpunkt aufgenommen. Der StreamHR- und LiveTrack-Modus, ausgestattet mit einem 532-nm-Laser und einem L×50-Objektiv (NA = 0,50, WD = 8,2 mm), wurden wie oben für eine schnelle und präzise Datenerfassung verwendet.

Für die Raman-Bildgebungsanalyse von Tumorrändern wurden die selbstmodellierende Kurvenauflösung (SMCR) und die hierarchische Clusteranalyse (HCA) der Software WiRE 5.3 verwendet. Die Spektren wurden vor jeder weiteren multivariaten Bildgebung durch Basislinienkorrektur, Glättung, Entfernung kosmischer Strahlung und Rauschfilterung vorverarbeitet.

Zur intraoperativen Erkennung von Leberkrebs wurde ein tragbares Raman-Spektroskopiesystem eingesetzt. Als Laserquelle wurde ein fasergekoppelter Laser bei 785 nm (FC-D-785, Changchun New Industries Optoelectronics Technology Co., Ltd., China) verwendet, der in eine Handsonde eingeführt wurde, die mit einer 100-µm-Faser für den Laser verbunden war Anregung und eine 200 µm Standardfaser zur Signalerfassung (NA = 0,22). Raman-Signale wurden mit einem ladungsgekoppelten Faserspektrometer (CCD) (QE Pro, Ocean Optics Inc., Dunedin, FL, USA) über einen Spektralbereich von 200–1100 nm und eine Auflösung von 6–7 cm–1 gesammelt . Die Spektren deckten einen weiten Bereich spektraler Verschiebungen von 0 bis 4000 cm−1 ab. Das Spektrometer wurde über eine OceanView-Schnittstelle mit einem PC verbunden.

Um eine intraoperative Infektion zu vermeiden, wurden die Raman-Sonde und die angeschlossene Faser mit medizinischem Alkohol abgewischt und mit einer sterilen Einweg-Schutzhülle aus Polyethylen (Renhe Medical Supplies Industry and Trade Co., Ltd, Chun'an, China) abgedeckt. Vor der Messung wurde die Gewebeoberfläche bearbeitet, um Blut im getesteten Bereich zu minimieren. Vor jeder Messung wurde zunächst ein Hintergrundspektrum aufgenommen und automatisch mit einer Integrationszeit von 0,2 s bei ausgeschaltetem Laser subtrahiert. Anschließend wurden fünf Messungen mit einer Integrationszeit von 0,2 s an zufällig ausgewählten Punkten jeder Gewebeoberfläche durchgeführt. Die Laserleistung an der Spitze der Sonde betrug etwa 40–56 mW cm−2, gemessen mit einem optischen Leistungsmesser (PM100D von Thorlabs Inc.). Die gemessenen Gewebe wurden von Pathologen nach der Operation zur Gewebebiopsie entnommen.

In dieser Studie wurden 25 Paare passender HCC-Gewebe und angrenzender Nichttumorgewebe ausgewählt, um metabolische Unterschiede mittels LC-MS festzustellen. Die spezifischen Probenverarbeitungs- und Testmethoden waren wie folgt.

25 mg Probe wurden in ein Eppendorf-Röhrchen eingewogen und 500 μl Extraktlösung (Methanol:Acetonitril:Wasser = 2:2:1) und eine isotopenmarkierte interne Standardmischung wurden zugegeben. Anschließend wurden die Proben 4 Minuten lang bei 35 Hz homogenisiert und 5 Minuten lang in einem Eiswasserbad beschallt. Der Homogenisierungs- und Ultraschallzyklus wurde dreimal wiederholt. Anschließend wurden die Proben 1 Stunde lang bei –40 °C inkubiert und anschließend 15 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde zur Analyse in ein frisches Glasfläschchen überführt. Die Qualitätskontrollprobe (QC) wurde durch Mischen gleicher Aliquots der Überstände aller Proben hergestellt.

LC-MS/MS-Analysen wurden unter Verwendung eines UHPLC-Systems (Vanquish, Thermo Fisher Scientific) mit einer UPLC-BEH-Amid-Säule (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm) durchgeführt, gekoppelt an ein Q Exactive HFX-Massenspektrometer (Orbitrap MS, Thermo). Die mobile Phase bestand aus 25 mmol/L Ammoniumacetat und 25 mmol/L Ammoniakhydroxid in Wasser (pH = 9,75) (A) und Acetonitril (B). Es wurde eine Gradientenelution verwendet: 0–0,5 min, 95 % B; 0,5–7 Min., 95–65 % B; 7–8 Min., 65–40 % B; 8–9 Min., 40 % B; 9–9,1 Min., 40–95 % B; 9,1–12 Min., 95 % B. Die Flussrate betrug 0,5 ml/Min. Die Temperatur des Autosamplers betrug 4 °C und das Injektionsvolumen betrug 2 μl.

Das QE HFX-Massenspektrometer könnte MS/MS-Spektren im informationsabhängigen Aufnahmemodus unter Steuerung der Aufnahmesoftware (Xcalibur, Thermo) erfassen. In diesem Modus wertet die Aufnahmesoftware kontinuierlich das MS-Spektrum aus. Die ESI-Quellenbedingungen waren wie folgt: Hüllgasdurchflussrate, 30 Arb; Hilfsgasdurchfluss, 25 Arb; Kapillartemperatur, 350 °C; volle MS-Auflösung, 60.000; MS/MS-Auflösung: 7500; Kollisionsenergie, 10/30/60 im NCE-Modus; Sprühspannung: +3,6 oder −3,2 kV. Die Messung wurde mit Unterstützung von Shanghai Biotree Biotech Co., Ltd. durchgeführt.

Rohdaten wurden mit ProteoWizard in das mzXML-Format konvertiert und von einem internen Programm verarbeitet, das mit R entwickelt wurde und auf XCMS zur Peakerkennung, Extraktion, Ausrichtung und Integration basiert. Die Identifizierung der Verbindungen basierte auf dem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis der Ausgangsionen in der primären Massenspektrometrie und charakteristischen Produktionen, die durch die Fragmentierung erzeugt wurden. Zur Annotation von Metaboliten wurde eine kommerzielle MS2-Datenbank (BiotreeDB) verwendet. Der Grenzwert für Anmerkungen wurde auf 0,6 festgelegt. Alle detektierten Ionen wurden für die anschließende quantitative Analyse gemäß internen Standards normalisiert. Von ESI+ und ESI− detektierte Ionen wurden zur multivariaten Analyse in die SIMCA-Software (Umetrics, Umea, Schweden) importiert. Um unterschiedliche Metaboliten zwischen HCC und angrenzenden Nicht-Tumorgeweben zu untersuchen, wurden im OPLS-DA-Modell Ionen mit signifikanten Veränderungen (Student-t-Test, P < 0,05) sowie variablen Bedeutungswerten im Projekt (VIP) > 1 ausgewählt . Letztendlich wurden 57 Metaboliten im ESI+-Modus und 51 im ESI−-Modus identifiziert und als Kandidaten für differenzielle Metaboliten ausgewählt.

Die Raman-Spektren wurden von PyTorch analysiert und die CNN-Architektur wurde basierend auf dem VGG-16-Framework36 modifiziert. Das CNN-Modell wurde mit 13 eindimensionalen Faltungsschichten (einschließlich 2 Faltungsschichten mit 64 Kerneln, 2 Faltungsschichten mit 128 Kerneln, 3 Faltungsschichten mit 256 Kerneln und 2 Sätzen mit 3 Faltungsschichten mit 512 Kerneln) und 5 Pooling aufgebaut Schichten (Größe 2, Schritt 2) und 3 vollständig verbundene Schichten, wie in Abb. 2h dargestellt.

Um Spektren von Krebs- und Parakrebs-Gewebebereichen zu unterscheiden, wurde ein Soft-Max-Optimierer verwendet, um die Ausgabe der vorherigen Verbindungsschicht in eine Wahrscheinlichkeitsausgabe mit einer Lernrate von 0,0001 und einer Stapelgröße von 128 umzuwandeln. Um eine Überanpassung zu verhindern, a Die Dropout-Schicht wurde mit einer Rate von 50 % eingesetzt, wodurch der Beitrag von 50 % der Neuronen zur nächsten Schicht zunichte gemacht wurde, um eine übermäßige Abhängigkeit von bestimmten Neuronen bei der Klassifizierung zu verringern. Spektraldaten von 20 Lebergewebeprobenpaaren wurden zufällig als Testsatz ausgewählt und die Spektraldaten der verbleibenden 100 Probenpaare wurden zufällig in einem Trainingssatz und einem Validierungssatz im Verhältnis 8:2 aufgeteilt. Ähnliche Aufteilungen wurden in anderen drei Klassifizierungsmodellen durchgeführt, wobei 20 % der Stichproben in jeder Gruppe zufällig als Testsatz ausgewählt wurden und die übrigen Stichproben im Verhältnis 9:1 in den Trainingssatz und den Validierungssatz aufgeteilt wurden. Der Gewichtsausgleich wurde verwendet, um mögliche Datenungleichgewichte zu verringern, indem bei der Verlustberechnung die Gewichtung jeder Trainingsstichprobe geändert wurde, damit alle Klassen gleichermaßen zum Verlust beitragen (Details zum Code finden Sie im folgenden GitHub-Link).

Korrelationsanalysen repräsentativer Raman-Peakintensitäten basierend auf dem Pearson-Korrelationskoeffizienten (r) in Form einer Korrelationsmatrix-Heatmap wurden von Python berechnet. Die zur Datenanalyse verwendeten Softwareversionen sind wie folgt: Python 3.9.9, Pytorch 1.10.1, Numpy 1.22.0, Matplotlib 3.5.1, Torchvision 0.11.2, TQDM 4.62.3, Pandas 1.0.4 und Seaborn 0.9 .0.

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt, wie in jeder Abbildungslegende angegeben. Alle Daten entsprachen der Normalverteilung. Die statistische Signifikanz zwischen den beiden Gruppen wurde durch einen zweiseitigen Student-t-Test ermittelt, wobei P-Werte < 0,05 als signifikant angesehen wurden. Die mikroskopischen Aufnahmen der Färbebilder und Raman-Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Messungen.

Der SMCR-Algorithmus wurde in der Gewebeschnitt-Raman-Bildgebungsanalyse verwendet, um verschiedene hepatische histopathologische Muster zu identifizieren. Die SMCR-Methode ist eine Form der multivariaten Kurvenbestimmung und alternierenden Methode der kleinsten Quadrate, die Komponenteninformationen in physikalisch bedeutsame Komponenten umwandelt. Kurz gesagt zerlegt SMCR die experimentelle Datenmatrix (X), die alle Spektraldaten für jedes Pixel enthält, in zwei kleinere Matrizen, die Matrix der Konzentrationsbildgebung (C) und die Matrix des reinen Spektrums (S):

wobei E die Fehlermatrix ist. Durch anfängliches Schätzen der Spektrenmatrix können S, C und ST berechnet werden, und dann kann eine iterative Optimierung unter Verwendung des alternativen Algorithmus der kleinsten Quadrate (ALS) durchgeführt werden, bis Konvergenz erreicht ist59.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Manuskript und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Die mit diesem Manuskript verbundenen Rohdaten der Massenspektrometrie finden Sie in den Zusatzdaten 1 und 2. Die kommerzielle MS2-Datenbank (BiotreeDB) muss hingegen durch Kontaktaufnahme mit Biotree Biotech Co., Ltd. bezogen werden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der für das CNN-Modell und die Demodatensätze verwendete Code ist unter https://github.com/thidoiSanren/CNN_liver-cancer_Raman60 verfügbar.

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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. LR19H180001) an YW, Leading Talent Innovation and Entrepreneurship Project of Wenzhou (RX2016005) an YW und Public Projects of Wenzhou (2020005) an YW

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Liping Huang, Danfeng Jiang, Qingwen Zhang und Yi Wang

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Hongwei Sun & Keqing Shi

Österreichisches Institut für Technologie, Giefinggasse 4, Wien, 1210, Österreich

Wolfgang Knoll

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LH, QZ und YW haben die Studie entworfen und durchgeführt. HS und KS stellten klinische Proben zur Verfügung und halfen bei der Gewebefärbung und intraoperativen Operationen. LS, YC und YG führten statistische Analysen durch und erstellten die CNN-Modelle. XR und DJ halfen LP bei der Gewebevorbereitung und dem Raman-Test. LP war für die Datenverarbeitung und grafische Darstellung verantwortlich. LH, XL und QZ haben das Manuskript geschrieben. WK, QZ und YW betreuten das Projekt. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Qingwen Zhang oder Yi Wang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Wei Min und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Huang, L., Sun, H., Sun, L. et al. Schnelle, markierungsfreie histopathologische Diagnose von Leberkrebs basierend auf Raman-Spektroskopie und Deep Learning. Nat Commun 14, 48 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35696-2

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Eingegangen: 02. März 2022

Angenommen: 15. Dezember 2022

Veröffentlicht: 04. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35696-2

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